Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University
* These authors contributed equally

Published 3/25/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Cite this Article

Copy Citation

Gaj, T., Liu, J. Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains. J. Vis. Exp. (97), e52814, doi:10.3791/52814 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Yüksek verimli ve çok yönlü bir protein teslim stratejileri birçok temel araştırma ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir. hücrelere saflaştırılmış proteinler direkt verilmesi, bunun başarılması için güvenli ve kolay yöntemlerden biri. 1,2 nükleik asitlerin gen ifadesi üzerindeki kullanan stratejiler farklı temsil eder 3-5 proteini dağıtım girmeyle mutagenez riski teşkil bağımsızdır Hücresel transkripsiyon / çeviri makine ve derhal yürürlüğe sağlar. Ancak, proteinlerin üzerine hücre delici aktivitesini endowing basit ve genellenebilir yöntemlerin eksikliği rutin hücre içine doğrudan giriş boşa. Hücre içi protein sağlanmasını kolaylaştırmak için geçerli yöntem, doğal olarak, 6-8 ya da tasarlanan hücre-delici peptidler, 9-12 kompresörlü transdüksiyon etki, 13,14 nano-tanecikleri 15 ve lipozomlar, 16 virüs benzeri partiküller 17,18 meydana kullanımına dayanmaktadır 19 Ne yazık ki, bu yaklaşımların çoğu düşük hücresel alım oranları, 20,21 yoksul kararlılık, 22 yanlışlıkla hücre tipi özgüllük, 23 düşük endozomal kaçış özellikleri 24 ve ek toksisite. 25 tarafından engellenmektedir, birçok protein iletim teknolojileri teslim proteinlerin biyoaktivitesini azaltır. 14

Biz daha önce laboratuarımızda çinko-parmak nükleazı göstermiştir (ZFN) protein - kimerik kısıtlama programlanabilir Cys 2 -His 2 çinko parmak, DNA bağlama proteini ve Fokl sınırlama endonükleazı 26-28 bölünme alanından oluşan endonükleazlar - doğal olarak hücreye olan geçirgen. 29 Bu şaşırtıcı hücre delici etkinlik özel tasarlanmış çinko-parmak etki, hedeflenen genom tr için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır bir DNA-bağlanma platformun bir içsel özelliği olduğu gösterilmiştirMühendisliði, 30-32 ve kabul protein yüzey altı pozitif yüklü kalıntıların takımyıldızı sonucu olduğu. Gerçekten de, c-Jun N-DEK dahil olmak üzere birçok DNA-bağlama proteinleri,., Hücre zarlarını geçme yeteneği doğuştan gelen bir kapasiteye sahip olduğu gösterilmiştir 33 Daha yakın zamanda, laboratuar Bu sonuçlar genişletilmiş göstermiştir ki, çinko-hücre-delici aktivitesi parmak (ZiF) etki hücre içi protein teslimat için kaldıraçlı olabilir. Bir çok geleneksel hücre nüfuz peptit uygulama sistemlerinin aşıldı verimliliği artışa neden oldu spesifik protein yük için bir ya da iki parmak ZiF etki ya da genetik füzyonu. 34 En önemlisi, ZiF aracılı teslim kaynaşık enzimatik kargo aktiviteyi tehlikeye ve kolaylaştırdı Sitozolik teslimat yüksek düzeyde. Topluca, bu bulgular proteinlerin verimli ve kolay teslim kolaylaştırmak için ZiF etki potansiyelini göstermek ve makro potansiyel olarak daha farklı tiplerihücrelere molekülleri.

Burada, memeli hücrelerinde protein temini için ZiF teknolojisi nasıl uygulanacağına ilişkin ayrıntılı adım adım bir protokol verilmektedir. Daha önce bir paketi inşa bir, iki, üç, dört, beş ve altı parmak bağlı α-sarmal DNA bağlayıcı artıkların herbirinin, bir ikame, DNA bağlama yeteneğinden yoksun ZiF etki, ancak hücreler 34 (Şekil 1) içine proteinleri üretmektedirler. İki parmak ZiF etki alanı kullanılarak HeLa hücrelerine Emerald GFP (EmGFP) üretimi ve transdüksiyon tarif edilmektedir. Bu protokol, Escherichia coli içinde çözünür ifade ve hemen hemen her memeli hücre tipinde edebilen hemen hemen herhangi bir protein verecek şekilde uzatılabilir. Beklenen sonuçlar sağlanır ve bu sistemin performansını maksimize etmek için stratejiler de tartışılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klonlama

  1. PET-28 ifade vektörü sistemi içine alt-klonlandığında, istek (pET-2F-ZiF) üzerine mevcuttur edilmiştir alanin ile ikame edilmiş, iki parmak ZiF etki elde edilir. 34
  2. PCR primerleri ile plazmid zümrüt-pBAD gelen EmGFP amplifiye 5 'Xmal-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; kalın olarak Xma I bölgesi) ve 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; kalın Sac sitesi).
    1. Şablon DNA 5 ng, 10x polimeraz tamponu 10 ul damıtılmış / iyonu giderilmiş su oluşur 1 Taq DNA polimeraz, 0.2 mM her bir dNTP Birimi (U) ve geri kalan hacim 100 ul çözelti içinde, her bir primerden 0.2 uM kullanın . Siklusları: 5 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye için 95 ° C 30 döngü, 30 saniye için 55 ° C sıcaklıkta ve 1 dk için 72 ° C; 10 dakika boyunca 72 ° C. Jel extracti PCR ürünü saflaştırmakve Abs 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonunu belirlemek.
  3. Özet pET-2F-ZiF ve sınırlama EmGFP kodlayan uç DNA 1 ug başına enzimin 10 u kullanarak 37 ° C 'de 3 saat boyunca tavsiye edilen tamponda Xma I ve Sac I enzimleri. Gibi etidyum bromür gibi floresan interkalasyon boya kullanılarak agaroz jel elektroforezi ile DNA görselleştirmek.
  4. Jel ekstraksiyon kiti ile sindirilmiş DNA arındırın ve ABS 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlenir.
  5. Oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca T4 DNA ligazı 1 ünite kullanılarak pET-2F-ZiF 50-100 ng saflaştırılmış EmGFP kodlayan DNA Arter. 1 insert-vektör molar oranı: En iyi sonuç için, 6 kullanarak ligasyon reaksiyonu gerçekleştirmek.
  6. Buz üzerinde herhangi bir kimyasal uyumlu XL-1 Mavi E. coli hücreleri 50 ul çözülme ve 10-20 ng lige pET-2F-ZiF-EmGFP bölgesinin ile yavaşça karıştırın.
  7. 3 için buz tutun0 dak. Isı şoku 90 sn için 42 ° C sıcaklıkta karışım ve çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat boyunca katabolik baskı (SOC) ile süper optimal suyu 2 ml hücreler geri kazınılmıştır.
  8. 50 ug / ml kanamisin içeren bir lizojeni suyu (LB) agar plakası üzerine geri kültür, 100 ul yayıldı ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
  9. Bir sonraki gün, Süper Broth (SB), ya da 50 ug / ml kanamisin, 37 ° C'de LB agar plakası ve kültür göre O / N itibaren bir koloni içeren LB kültür 6 ml inoküle.
    Not: Koloni PCR primerlerini 5 'Xmal-EmGFP ve 3' Sacl-EmGFP kullanılarak miniprep önce pozitif klonları tanımlamak için kullanılabilir.
  10. Miniprep ile pET-2F-ZiF-EmGFP arındırmak ve T7 promotörü kullanılarak DNA dizilemesi ile teyit plazmid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. İfade ve saflaştırma

  1. Kimyasal yetkili BL21 E. 50 ul çözülme Buz üzerinde coli hücreleri ve PL pET-2F-ZiF-EmGFP 100 ng ile yavaşça karıştırınasmid. Adımlarda 1.7-1.8 açıklandığı gibi Transform.
  2. Ertesi gün, tek bir koloni ile 50 ug / ml kanamisin içeren LB ortamında 10 ml aşılamak ve çalkalanarak 37 ° C'de O / N büyür.
  3. Bir sonraki gün, 50 ug / ml kanamisin,% 0.2 glikoz ve 100 uM ZnCI2 ile takviye edilmiş LB ortamı 1 L O / N kültür 10 ml seyreltik. 0.8, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar çalkalanarak 37 ° C'de kültür büyütün ve 2 mM izopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ve protein ifadesini teşvik eder. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile 37 ° C'de büyüme 6 saat, hasat sonrasında, hücreler.
    Not: İndüksiyon koşulları oldukça değişkendir ve ifade edilen proteinlerin istikrar bağlıdır. 0.8 600 ulaşıldığında bir OD kadar OD 600 her 30 dk izleyin.
  4. Liziz tamponu, 5 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl içinde hücre pelletini, 100 uM ZnCl2, 1 mM ditiyotreitol (DTT), 1mM MgCl2, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 10 mM imidazol, pH 8.0). Aşağıdaki ayarı ile sonikasyon ile buz üzerinde lizleyin hücreleri: 50% güç çıkışı, / 10 saniye kapalı aralıklarla üzerinde 5 saniye ile 4 dakika işlem süresi. Çözüm aşırı ısınma kaçının.
  5. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 25,000 x g'de hücre lizat santrifüj ve yeni bir toplama tüpüne süpernatant aktarın. En iyi sonuçlar için, 4 ° C'de aşağıdaki adımları uygulayın.
  6. Bir sütun dengelenmiş Ni-NTA bulamacın 1 ml kullanıma hazır süpernatanın çalıştırın. Yıkama tamponu, 20 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 30 mM imidazol, pH 8.0) ile reçinenin yıkayın.
  7. 5 yıkama tampon maddesinin ml'si (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 300 mM imidazol, pH 8.0) ile proteininin elüt edilmesi.
  8. Tampon saklama tamponu ile elüt protein (50 mM alışverişiTris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 ve% 10 gliserol, pH 8.0) kullanılarak ve imalatçının talimatlarına uygun olarak santrifüj ile bir spin konsantratör kullanılarak en az 40 uM proteinin konsantre edilir.
  9. BCA veya Bradford deneyi ile protein konsantrasyonu belirleyin. 10 dakika boyunca 95 ° C 'de 2 ul 2 x SDS-PAGE yükleme boyası, kaynatma ile saflaştırılmış proteinlerin 2 ul karıştırın ve daha sonra% 4 protein saflık (Şekil 2) üzere% 20 Tris-Glisin, SDS-PAGE gidermek.

3. Protein Depolama

  1. -80 ° C'de, sıvı azotun ve depoda konsantre protein, flaş dondurma alikosu. EmGFP füzyon proteinleri için, ışıktan proteini korumak için alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır.
  2. Tekrarlanan donma ve protein çözeltisi çözülme kaçının. Not: ZiF-kaynaşık proteinler en az 1 ay boyunca bu koşullar altında stabildir. Uygunsuz veya> 4 ay depolama yol açabilirProtein yağış veya EmGFP ve photobleaching

4. Protein İletimi

  1. % 10 ihtiva eden Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde HeLa hücrelerini muhafaza (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik% 5 CO2 ile bir tam nemli bir atmosferde 37 ° C 'de.
    Not: Hücreler fazla 30 kat protein iletimi için tavsiye edilmez pasajlandı.
  2. Ön kaplama, 25 ° C'de 30 dakika ila 60 poli-lisin, 50 mg / ml 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 kuyulu bir levha üzerine tohum hücreleri. Hücreler% 80 arasında -90% konfluent sonra tohumlama 24 saat sonra ya da her bir gözden ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış serum içermeyen DMEM içinde 500 ul (SFM) ile yıkayın.
  3. Her bir oyuğa, SFM, 250 ul ZiF-EmGFP proteininin 2 uM ve 100 uM ZnCl2 ihtiva eden ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Not: ZiF etki hücrelerine girmek primarily bir enerji-bağımlı bir mekanizma makropinositozlar, 34 ile. Bu nedenle, hücreleri verimli bir protein içselleştirme 37 ° C'de inkübe edilmesi gerekir.
  4. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 500 ul ile üç kez hücrelerden Ortamı çıkarın ve yıkama Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su, heparin, 0.5 mg / ml ile takviye edilmiş (DPBS). Not: Heparin, mansap analizler zorlaştırıyor olabilir yüzey bağlı protein kaldırmak için gereklidir.
  5. Gelişmiş teslimat için üç kata kadar (İsteğe bağlı) Tekrar tedavileri.
  6. Hemen 2 dakika süreyle 37 ° C'de% 0.05 tripsin-EDTA ile sindirme ile yıkama heparin sonra muamele edilmiş hücreler izole edin. % 1 FBS ile takviye edilmiş DPBS 0.5 ml müstakil hücreleri yeniden askıya.
  7. Fluoresein izotiyosiyanat (FITC) kanal (Şekil 3) kullanılarak 35 akış sitometrisi ile her bir numunenin floresan yoğunluğu ölçülür. Nüfusu yerleştirmek için ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlayınFarklı özelliklere sahip popülasyonlar birbirinden çözümlenir sağlamak ölçekte faiz.
  8. Her numune için 10,000 canlı etkinliklerle toplayın ve sadece SOY ile tedavi edilen hücrelere ZiF-EmGFP ile tedavi HeLa hücrelerinde veri analiz yazılımı. 36 Normale floresan flow sitometri kullanarak verileri analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İki parmak ZiF-EmGFP füzyon proteinleri E. ifade edilebilir E. coli,>% 95 homojenlik ve yüksek verimle (> 25 mg / ml) (Şekil 2). Genel bir ve iki parmak ZiF füzyon proteinleri, vahşi tip uğratılmamış proteinin kişilerce hemen hemen aynı miktarlarda üretilebilir. Bununla birlikte, bazı bağlamlarda, beş ve altı parmak ZiF füzyon proteinleri alt baş uygulamalar için yeterince yüksek verimlerle üretilmesi mümkün değildir.

37 ° C'de 90 dakika boyunca, HeLa hücreleri üzerine iki parmak ZiF-EmGFP proteininin doğrudan uygulama EmGFP floresan (Şekil 3A) bir doza bağlı bir artışa yol açar. Kritik olarak, herhangi bir flüoresan ZiF sahasının mevcut olmaması halinde görülmektedir. Daha önce hücrelerin yaklaşık% 100, sadece 2 uM iki parmak ZiF-EmGFP protein ile işlendikten sonra bir floresan olduğu görülmüş ve ZiF füzyon proteini ile muamele edilmiş HeLa hücreleri protein konsantrasyonlarında EmGFP floresan için pozitif olduğu düşük 0.25 uM (Şekil 3B).

Şekil 1,
Şekil 1. Yapı ve çinko-parmak protein sekansı. Tek bir çinko-parmak (ZiF) etki (Üst) Kristal yapı. . Zn 2+ ile koordine korunmuş Cys ve O'nun kalıntılarının yan zincirler iyon sopa (PDB ID: 2I13) olarak gösterilmiştir ZiF etki 37 (Alt) Dizi. Oklar ve silindirler, sırasıyla, Β-sac ve α-sarmal ikincil yapılar gösterir. alanin ile ikame edilmiştir α-sarmal DNA bağlayıcı kalıntılar pembe vurgulanır. Hücre içselleştirilmesi aracılık tahmin pozitif yüklü kalıntılar açık mavi vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"Fo: keep-together.within-sayfa =" always "> Şekil 2,
Bir, iki, üç ve dört parmak ZiF-EmGFP füzyon proteinlerini kapsamına almaktadır. ZiF-EmGFP füzyon proteinleri E. ifade Saflaştırılmış Şekil 2. SDS-PAGE E. coli ve Ni-NTA agaroz reçinesine ile saflaştırılmıştır. Elüt edilen protein,% 4% 20 Tris-Glisin jel ile SDS-PAGE ile saflık için analiz edilmiştir. Önemli bir bozulma veya ZiF-EmGFP füzyon proteinlerinin kesilmeleri gözlenmiştir.

Şekil 3,
Şekil 3. HeLa hücrelerine protein verilmesinin ZiF aracılı. Iki parmak ZiF-EmGFP proteininin artan miktarları ile tedavi edilmiş HeLa hücrelerinde (A), flüoresan yoğunluğu. EmGFP proteini ile muamele edilmiş HeLa hücreleri, tek başına muamele edilmemiş hücreler ile tamamen üst üste gelir. (B) 2 uM o ile arka arkaya muamele edilmiş HeLa hücrelerinin Normalleştirilmiş florasan yoğunluğuf iki parmak ZiF-EmGFP proteini. Flüoresan yoğunluğu akış sitometresi ile tespit edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, hücre-geçirgen çinko-parmağı (ZiF) sahaları kullanılarak protein temini için adım adım bir protokol verilmektedir. ZiF etki kaynaşık enzimatik yük 34 etkinliğini azaltmaz; üretim ve değişikliğe uğratılmamış proteinle birlikte gözlenenler ile hemen hemen aynı mayalarda proteinlerin saflaştırılması için izin verir; ve geleneksel hücre nüfuz peptid ya da protein transdüksiyon alan sistemleri aşan randımanı olan hücre tiplerinin geniş bir aralığı içine proteinler ve enzimler taşıyabilir. Bununla birlikte, bu bulgular, geniş bir uygulama yelpazesi için hücreler içine doğrudan protein teslim aracılık edecek ZiF alanlarının geniş bir potansiyel göstermektedir.

Maksimum proteini dağıtım önce daha büyük bir pozitif yük taşıyan üç ve dört parmak ZiF etki dizileri uzatılmış olmasına rağmen, sadece iki parmak ZiF alanı kullanılarak elde edilmiştir. Bu bulgular ZiF-aracılı hücre giriş ücreti, inc dışındaki faktörlerden etkilendiği olabileceğini göstermektedirProtein stabilitesini veya yapısal rijidite luding. ZiF etki aracılı proteini dağıtım enerji bağımlı olduğu bulunmuştur ve bu nedenle protein ile tedavi edilmiş tüm hücreler 37 ° C'de kuluçkaya yatırılır gerektirir edildi. Çeşitli endositik yollar makropinositoz küçük molekül inhibitörlerinin kullanımı ile, ve daha az bir ölçüde kaveolin bağlı endositoz için ZiF aracılı hücre giriş için ana yolları olarak tespit edilmiştir. 34 Özellikle, diğer protein transdüksiyon sistemlerinden farklı olarak, ZiF alanlardır verimli, kaynaşmış makromoleküler kargo sitozolik teslim yüksek düzeyde aracılık etmek endozomlar kaçan sağlam protein teslim ulaşmak için bu alanların potansiyelini vurgulayan yetenekli.

Bizim tecrübelerimize göre, hücrelerin ekim yoğunluğu protein iletimi yüksek düzeyde ulaşmak için kritik bir adımdır. Biz onlar% 80 -90% konfluense ulaştığınızda hücreleri tedavi ve önceden gözlenen tavsiye olduğunu>% 95 confluency gösterisi subfertilitesi numaralı seribaşı hücreleruygun iletim kapasitesi, düşük yoğunluklarda (<% 50) tohumlanmıştır hücre yüzeyi proteini, toksisitesi duyarlı iken. Önemli bir şekilde, yüksek ayırma eğilimi olan hücre tipleri için, hücre kültür plakaları, poli-lisin ile önceden kaplamış olarak tavsiye edilir. Poli-lizin, negatif yüklü hücre yüzeyi bileşenleri ile elektrostatik etkileşimler yoluyla hücre eki kolaylaştırır. Her ZiF etki α-sarmal DNA bağlayıcı kalıntılar DNA tanıma için bir potansiyelini ortadan kaldırmak için kaldırılmış olmasına rağmen, ΒΒα ZiF alanı kat stabilize Zn2 + iyonu ile koordine bir sistein ve histidin kalıntıları gibi kalır. Böylece, herhangi bir depolama tampon protein bütünlüğünü korumak için ZnCİ2 en az 100 uM ile takviye edilmesi önerilir.

ZiF etki daha önce hücre tiplerinde çeşitli içine proteinler ve enzimler sunmak için gösterilmekle birlikte, ZiF teslimat etkinliği, aynı zamanda, her iki macromo bağlı olabilirMolecular kargo ve protein konsantrasyonu. Örneğin, hücreler iki parmak ZiF-lusiferaz füzyon proteini ile tedavi edilen hücreler, iki parmak ile muamele sırasında daha yüksek konsantrasyonlarda düştü aktivite ile, 0.5 uM proteini ile tedavi edilen maksimum ışıldamayı görüntülemek için gözlendi EmGFP floresan doza bağımlı bir artış sergiledi yoğunluğu 8.0 mcM protein kadar, ve ardışık protein tedavileri üzerine. Bu nedenle bir konsantrasyon aralığında benzersiz her ZiF etki füzyon hücre delici yeteneğinin değerlendirilmesi önerilir.

Henüz ortaya olmamasına rağmen Nihayet, biz ZiF etki teslim hücrelere makromoleküllerin çeşitli bir dizi sunma yeteneğine son derece esnek bir platform olduğunu tahmin. DNA ve RNA hem de kimyasal bir hidrolize edilebilir bağlayıcı vasıtasıyla ZiF etki yüzeyi üzerine fonksiyonalize olarak veya geçici olarak ZiF etki kapsüllenmesi hücrelere transfekte edilmesi için, örneğin, mümkün olabilir. Buna ek olarak, verimlilik veZiF proteini teslim Ensi daha yüzey yükü optimizasyonu odaklanmış rasyonel tasarım çabaları tarafından geliştirilmiş olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Bu çalışma ve ShanghaiTech Üniversitesi, Shanghai, Çin (DP1CA174426 Carlos F. Barbas için) (JL) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Moleküler grafik Pymol kullanılarak elde edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
XmaI New England Biolabs R0180L
SacI New England Biolabs R0156L
Expand High Fidelity PCR system Roche 11759078001
dNTPs New England Biolabs N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells Life Technologies EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 161-0737
T4 DNA Ligase Life Technologies 15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527I
IPTG Thermo Scientific R0391
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086-5G
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-25
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-25G
DTT Fisher Scientific PR-V3151 
PMSF Thermo Scientific 36978
Ni-NTA Agarose Resin QIAGEN 30210
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMO Millipore UFC900324
DMEM Life Technologies 11966-025
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10437-028
Antibiotic-Antimycotic  Life Technologies 15240-062
24-Well Flat Bottom Plate Sigma-Aldrich CLS3527-100EA
Poly-Lysine Sigma-Aldrich P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium Life Technologies 21600010
Heparan Sulfate Sigma-Aldrich H4777
Trypsin Life Technologies 25300054
HeLa cells ATCC CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats