שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מחקרים בהתפתחות חיך מונעים על ידי את השכיחות של חיך שסוע, מומים מולדים שמטיל נטל בריאותי עצום ויכולים להשאיר נמשך השחתה. אנו מדגימים כאן טכניקה למדפי חך התרבות שיכול לשמש כדי לחקור מסלולי איתות שונים מעורבים בפיתוח חיך והיתוך.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שפה שסועה היא בין הנפוצים ביותר של כל המומים המולדים. הצורות המשניות החיך ממדפי mesenchymal מכוסה באפיתל ששומרות על צורת תפר אפיתל קו האמצע (MES). התיאוריות מציעות כי תאי MES מעקב אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אפופטוזיס והגירה, מה שהופך את החיך התמזגו 1. התפוררות מוחלטת של MES היא השלב החיוני הסופי של מפגש חיך עם סובבי תאי mesenchymal. אנו מספקים שיטה לתרבות איבר החיך. פיתחו בפרוטוקול מבחנה מאפשר הלימוד של התהליכים הביולוגיים ומולקולריים במהלך היתוך. היישומים של טכניקה זו הם רבים, ובכלל זה תגובות הערכה לחומרים כימיים אקסוגני, השפעות של גורמים רגולטוריים וצמיחה וחלבונים ספציפיים. יש תרבות איבר חיך מספר היתרונות הכוללים מניפולציה בשלבים שונים של פיתוח, שאינו אפשרי באמצעות במחקרי vivo.

Introduction

בתרי Orofacial הם המומים המולדים craniofacial הדומיננטיים ביותר. כמו כן, לוקח בחשבון את כל פגמי craniofacial האפשריים, אלה הם האנומליה הלידה השנייה בשכיחותו בתינוקות 2. חיך שסוע להתרחש בכ -1 מכל 700 לידות בארצות הברית (ארה"ב) בכל שנה, את השכיחות של חיך שסוע היא שווה 475 ילדים שנולדו עם חיך שסוע לחודש או 15 ילדים עם שסעים ליום 3. כ -1% מילדים שנולדו ברחבי העולם כל שנה תערוכת צורה כלשהי של dysmorphology craniofacial.

בתרי החיך והשפה צריכים הליך מאוד יקר ומסובך עם השלכות לכל החיים לחולים שיש להם את האנומליה הזו. העלות המשוערת לכל מטופל עם שסוע פה היא כ -100,000 $ 4. הטיפול בחולה עם שפה שסועה דורשת צוות של רופאים, כולל רופאים, מומחי אוזן וגרון, גנטיקאים, מרדימים craniofacial,דיבור בשפת פתולוגים, תזונאים, orthodontists, prosthodontists, פסיכולוגים, נוירוכירורגים, ורופאי עיניים.

בpalatogenesis, החך המשני נשאלת צמחים לזווג, אשר בתחילה לגדול בצורה אנכית ולעבור גובה מדף חיך מעל dorsum של הלשון. בעקבות העלאה, מדפי החך לזווג לגדול לכיוון קו האמצע (בE14.5 -E15 בעכברים ובשבוע 9 בבני אדם). אפיתל המדיאלי הקצה (MEE) המכסה את קצה המדף שומר יוצר תפר אפיתל קו האמצע.

זה ואחריו אפיתל מעבר mesenchymal ו / או אפופטוזיס לאפשר מפגש mesenchymal. הידבקות של MEE המנוגדים היא אירוע חיוני שינוי שגורם לחיך שסוע. עם זאת, רק מעט מחקרים בחנו את ההידבקות הראשונית של מדפי חך 5. צורות החיך קשות על ידי התמיינות של תאי mesenchymal לתא עצם. ההתפתחות לא תקינה של החיך יכול לייצר מפתחלא חיך עם או בלי מעורבות של השפה.

טכניקות תרבות איבר החיך היו בשימוש נרחב למעבדות רבות במהלך 30 השנים האחרונות 6,7.

בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרטי שיטה של ​​נתיחת חיך ותרבות איבר סטטי. היתרון של תרבות איבר חסרת תנועה הוא שהיא מאפשרת מדפי חך הפתיל. טכניקה זו הייתה בשימוש בהצלחה במעבדה שלנו לניסויי היתוך ואיתות רבים 8,9. עם זאת ההיקף של הטכניקה הוא עצום וניתן להשתמש בו בכל פעם שנדרשה מערכת תרבות איבר סטטי, כולל ההערכה של תגובות לחומרים כימיים אקסוגני, את ההשפעות של גורמי גדילת רגולציה במסלולים שונים וחלבונים ספציפיים.

איור 1
ele סריקת איור 1. העכבר Palatogenesis. שלבי התפתחות של חיך העכברים. (BF)micrographs ctron (SEM) של החיך המשני בזמנים התפתחותי נציג. חיצים אדומים: להראות את החלק הראשוני של הידבקות חיך והיתוך. צהובים חצים: נקודה למרחב שבין החיך הראשי והמשני שייעלם לאחר ההיתוך (נדפס מ -11 קאופמן באישור PLoS ONE).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים חייבים להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות, כוללים אישור מראש על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית.

1. הכנת מכשירי הביתור ותרבות מדיה

  1. כביסה מוקדמת כל המכשירים לשימוש בנתיחה עם מי חמצן 3% ולאחר מכן החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. סנן תקשורת BGJb עם פתרון אנטיביוטי וantimycotic באמצעות מסנן נקבובית בגודל 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום במנדף.

2. הכנת תרבות הציוד

  1. חותך מסנני קרום פוליקרבונט שיתמכו באיברי החיך במשולשים קטנים, לרסס עם אלכוהול 70% ולאפשר להם להתייבש. הכן צלחת המרכז-ובכן האיברים תרבות (60x15 מ"מ) על ידי הצבת רשת נקייה ומעוקרת שווה צלעות בצורת משולשת תיל (20 מ"מ) על צלחת תרבות איבר. ואז למלא היטב עם 1 מיליליטר של Bתרבות תקשורת תקשורת GJb. הערה: התקשורת צריכה להיות מספיק כדי להגיע לרמה של הרשת ללא הצללה החיך. מניחים את מסנני קרום, הצד מבריק כלפי מטה, על גבי הרשת (3-4 ממברנות לרשת) .Depending בניסוי, ניתן להוסיף טיפול (חלבונים, נוגדנים או מעכבים) לתקשורת

3. העובר עכבר איסוף והכנה לתרבות

  1. כדי להשיג עוברי עכבר סוג בר, שימוש בעיתוי 13.5 מתח רקע גנטי בהריון CD-1 עכבר. נקה את האזור לנתיחה עם אתנול 70%.
    הערה: זנים אחרים של עכברים יכולים לשמש. אנחנו מעדיפים CD-1 עכברים בגלל מספר ההמלטה הגדולה יותר.
  2. להרדים עכברים בהריון בE13.5 DPC (ימים שלאחר משגל) עם 5% Isoflurane אחריו נקע בצוואר רחם כדי להבטיח מוות באמצעות פרוטוקולים שאושרו.
  3. ריסוס אתנול 70% על פני בטן הגחון כדי להימנע מצורך שיער מקל הבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrallyבאמצעות מספריים חדים-הפעלה בוטה ומלקחי מיקרו לנתח כדי לאתר את הרחם. שימוש במלקחיים, להרים את כל הרחם ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם עם מספריים הפעלה אור.
  4. מניחים את הרחם על מגבת נייר נקייה על קרח (לדברי מדריך הפרוטוקול לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה). מכסה את הרחם עם מגבת נייר נקייה אחרת על מנת למנוע זיהום. לעקר את המכשירים באמצעות 70% אתנול תרסיס לפני שימוש נוסף. הרחם והעוברים יכולים להיות מועברים למעבדה על קרח.
  5. בזרימה למינרית פתוחה, להפוך בזהירות פתח קטן בצק החלמון באמצעות מספריים חדים-הפעלה בוטה ומלקחי מיקרו לנתח. הפוך את הפתיחה רחבה יותר ולאחר מכן בעדינות לדחוף אותו לexteriorize את העובר מן שק החלמון.
  6. מעבירים את העוברים מייד לצלחת פטרי עם pH הקר פוספט שנאגרו מלוח 1X (PBS) 7.4. כדי להבטיח את השלב, לשעבר הנכוןאמין העובר תחת מיקרוסקופ לנתח למורפולוגיה גוף, גודל הראש והגפיים.
    הערה: עוברים שאינם בשלב הנכון של פיתוח אינם משמש לניסוי.

איור 2
איור 2. איבר באד מורפולוגיה. קדמת הבמה והגפיים אחוריות נבדקות לתואר של כניסה חגורה בין הספרות. בE13.5, כל condensations הספרות בולט, עם חגורה וחריצי דיסטלי בין ספרות המופיעים מאוד ברורים. הספרות האחורית היא מאחורי בחצי יום 12 שורה עליונה:. Forelimb, שורה תחתונה: גפיים אחוריות.

4. חך Dissection

  1. הנח עובר אחד בכל פעם בצלחת פטרי עם PBS תחת מיקרוסקופ לנתח. מספריים שימוש קטנים לנתח ופינצטה להפריד את הראש מהגוף של העוברים.
  2. מחזיק בזהירות את גולגולת העכבר מעל גובה עיניים עם מלקחיים (הימנעותתהליך הלסת) לעשות שני חתכים בשני הצדדים של קו השפתיים. ואז להסיר את הלסת התחתונה ולשון. לבודד את אזור לסת תהליך על ידי ביצוע חתך בגובה עיניים ולהסיר את המוח, עיניים, מחיצת האף ורקמות הסמוכות.

איור 3
רקמת 3. חך איור נאספה מ13.5 עוברים, כאשר מדפי החך שהעלו, אך לא יצרה קשר. מדפי החך הונחו בתרבות איבר במסנן בממשק תקשורת האוויר במשך 72 שעות במודל הסטטי. (א) רמה של כוכבי נתיחה על עובר E13.5. (ב) הכחולה לתחום אזורים להחזיק את הרקמה עם מלקחיים במהלך נתיחה. צפה (C) של מדפי חך גזור מונחים על קרום מסנן טרפז. מבט צד (D) של צלחת התרבות אחרי המיקום של חיך גזור ותוספת של תקשורת ותרבות.

  1. הנח את צד הפה החיך ולהסיר את מחיצת האף ורקמות סביבו, שמירה על החיך העיקרי המצורף כדי לסייע לה להתמצא מקדמי לאחורית. השתמש במרית כף ולהעביר בזהירות רבה את מדפי החך (צד האף למטה) למסננים מוכנים ברשתות במנות התרבות. הערה: התאם את עוצמת קול של מדיה כדי לאפשר ממשק אוויר תקשורת נכון.
  2. מתחת למיקרוסקופ סטריאו, לנתח את החיך הראשוני ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את מדפי החך קרובים אחד לשני. מדפי החך לא הפתיל אם הם לא ממוקמים במגע. חותך את מסנן הקרום המשולש שבו החלק הקדמי של החך ממוקם. צורת הטרפז תסייע באיתור החלק הקדמי של החך.
  3. תרבות מדפי חך בנפרד או עם שתיים או שלושה באותו צלחת תרבות איבר באמצעות תקשורת ותרבות BGJb.

5. מדפי Culturing עכבר Palatal

  1. דגירה tissues על 37 מעלות צלזיוס בתערובת humidified גז (5% אוויר CO 2 ו -95%) במשך 72 שעות, ולשנות את המדיום כל שעה 24.

6. חך עיבוד לניתוח היסטולוגית

  1. לתקן את החיך לאחר 72 שעות בתרבות עם 4% פורמלדהיד / O פוספט שנאגרו מלוח / N ב 4 °   ג ואז, בעדינות עם טפטפת העברה לשטוף את הרקמה בצלחת התרבות עם PBS. לעטוף את החך בפיסת מגבוני מעבדה ומקום בהטבעת קלטות.
    הערה: גלישת החיך במגבוני מעבדה למנוע האובדן שלהם במהלך תהליך ההתייבשות.
  2. מייבש את הרקמה הבאה 70%, 80% ועד 100% אתנול שוטף עבור שעה 1, ואחריו את הליך הטבעת פרפין הרגיל. להטבעה, תניח את החלק הקדמי של החך מול המגש.
  3. חותך 6 מיקרומטר סעיפים סידוריים בכיוון העטרה מקדמי לאחוריים. חיך סעיף שלם יניב 350-450 sectiהרחבות. להכתים את החלקים עם hematoxylin ו eosin (H & E). בקנה מידה 10 כל סעיף 20 ה באמצעות ציון ממוצע היתוך שתואר לעיל (MFS) (טבלת 1). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הטכניקה יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של המחקר הבא experiments.The שונים נועד לבחון את ההשפעה של ניקוטין טרטוגניות במבחנה על היתוך חיך. שני זנים של עכברים שמשו לניסוי זה, CD1 ורקמת C57.Palatal טופל ב0.06 ו -6 מ"מ ריכוזים של hemisulfate ניקוטין. היה נראה כי דפוסי היתוך חיך ועיתוי היו שונים בשני הזנים השונים. בעכברי CD1, מדפי חך מקבוצת הביקורת המשיכו היתוך באופן תלוי בזמן. עם זאת, בקבוצה שטופל היתוך הניקוטין התעכב במיוחד בריכוז ניקוטין 6 מ"מ (איור 4 א). סעיפי היסטולוגיה של חיך עכבר CD1 הראו היתוך מוחלט לאחר 72 שעות בדגימות השליטה. במינונים נמוכים יותר של ניקוטין מדפי החך לדבוק אך תאי האפיתל יישארו לאחר 3 ימים בתרבות. מדפי חך טופחו על מינונים גבוהים של ניקוטין לא ליצור קשר לאחר 72 שעות של דגירה.

= "Jove_content"> בעכברים C57, מדפי חך מקבוצת הביקורת המשיכו היתוך באופן תלוי בזמן. עם זאת, מדפי חך של עכברי C57 הראו ציון גבוה יותר בריכוז 6 מ"מ כאשר הדגימות הודגרו במשך 48 שעות בהשוואה לדגימות טופחו על 0.6 מ"מ ריכוז של ניקוטין לאותו פרק זמן (איור 4). סעיפי היסטולוגיה של חיך עכברי C57 הראו כי בקבוצות טיפול תפר אפיתל רציף התמיד בקו האמצע. היתוך נצפה רק בקבוצת הביקורת ב 72 שעות.

הבחנו כי היתוך החיך בשני הסוגים של עכברים הושפע מינונים גבוהים של ניקוטין. עם זאת, חיך מC57 היה יותר הגיוני לניקוטין. לסיכום, התוצאות שלנו מראות כי רקע גנטי של עכברים משפיע תגובות ניקוטין ברקמות חיך.

איור 4
שני זנים של חיך עכבר בתרבית בנוכחות הניקוטין במשך 24, 48, או 72 שעות. זני העכבר הגיבו לניקוטין בדרגות שונות. כל החיך נחשף למינון הגבוה של ניקוטין (6 מ"מ) לא הצליח להתמזג והיה ציון ממוצע היתוך נמוך (MFS) .Note שב 24 שעות, אף אחד מהחיך סגר וMFS נע בין 1 (מדפי חך לא נוגעים) עד 3 (היתוך חלקי) בכל הקבוצות. על ידי 48 שעות, רב של חיך השליטה שהתמזגה באופן חלקי (ציונים מעל 3) ועל ידי 72 שעות, חיך CD1 היה התמזגו (ציון 5) לחלוטין, אבל בקרות C57 לא התמזגו לגמרי (3.67). (נתונים שלא פורסם ממריה סראנו וקתי ד"ר סבובודה).

ציון קריטריונים
1 ללא היתוך ללא הדבקה.
2 ללא היתוך עם כמה הידבקות לכאורה.
3 הידבקות עם כמה התפוררות שכבות מיי ומפגש mesenchymal חלקי ברור.
4 היתוך להשלים עם כמה עקבות של תאי MEE או תפר שנותר.
5 היתוך מלא ללא עדות לתאי MEE או תפר גלוי.

טבלת 1: היקף ציון הממוצע Fusion (MFS) (קאנג וסבובודה, 2002). (סעיפים 1-150) לחשב את הציונים לכל חיך לקדמי, (סעיפים 150-300) אמצע ואחורי (סעיפים 300-450). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול במאמר זה מספק שיטה של ​​לנתח מדפי חך מעוברים ביום עוברי 13.5. מדפי חך מעוברי עכברים היו בתרבית בתקשורת ותרבות סרום ללא באווירה של 95% O CO 2 5% 2 על 37 מעלות צלזיוס. נתיחת חיך מוצלחת תלויה באופן קריטי על גורמים רבים בכל שלב במהלך ההליך מרגע העוברי של העכברים מורדמים להשלמת התרבות. אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על היתוך חיך הוא הזמן שלוקח כדי להתחיל את תרבות האיבר; עוברים צריכים להיות ביום עוברי 13.5 כמדפי חך המשניים הם אופקיים, אבל לא התחילו הפתיל (איור 1).

נקודה נוספת במהלך ההליך קריטי היא החצנה של עוברים מצק החלמון. צעד זה דורש זהירות רבה כדי למנוע נזק למבני הפנים. ברגע שהעובר הוא להסיר את השק, הראש הוסר מלצפייה בגוף והניח בצלחת פטרי עם סטראו עם תאורת סיבים אופטית משני הצדדים. הלסת התחתונה והלשון יוסרו, חושפים את החיך. המוח והרקמות שיורית יוסרו בגובה עיניים. בשלב זה הוא חשוב לשקול את שכבת האפיתל סביב המדפים. זה הכרחי כדי לתפעל את הרקמה בזהירות רבה כדי לשמור על השלמות של תאים אלה. תאי האפיתל אחראים לדבקות והיווצרות של MES.

כל חיך גזור מופעל צד פה למטה כדי לנקות סחוס כל ממחיצת האף. רקמה זו היא בצד הקדמי של החיך ומופיעה תמצית לבנה ועוד. מדפי חך חופשיים של רקמה לא רצויה מועברים לצלחת תרבות וממוקמים על גבי קרום המסנן. העמדה של המדפים נבדק שוב תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו. הם חייבים להיות דחף יחד כדי לאפשר דבקות ונוספת על היתוך חיך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics