使用静态器官培养研究腭融合的方法

Developmental Biology

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Summary

腭发展研究是由腭裂,出生缺陷,它强行巨大的医疗负担,并可以留下持久的缺陷的发生率动机。我们在这里展示了一种技术,可用于研究参与腭发展和融合不同信号通路的培养腭。

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Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

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Abstract

唇腭裂是最常见的所有出生缺陷。从骨髓间充质货架的次生腭形成覆盖着上皮细胞附着,形成中线上皮煤层(MES)。该理论认为MES细胞遵循上皮至间质转变(EMT),细胞凋亡和迁移,使稠腭1。在MES的完全解体是腭融合与周围间质细胞的最后一个基本阶段。我们提供味觉器官培养的方法。 体外协议开发允许生物和分子过程的融合过程中的研究。这种技术的的应用有很多,包括评估响应外源化学试剂,监管和生长因子和特异性蛋白质的效果。腭器官培养具有许多优点,包括:在操作的开发使用体内研究认为是不可能的不同阶段。

Introduction

口面裂是最主要的颅面先天缺陷。另外,当以在考虑所有可能的颅面畸形,这些是在新生儿2第二最常见的出生异常。腭裂发生在约1在每700出生在美国(美国)每年,腭裂的发生率等于475所生的子女,每月兔唇或15个孩子,每个3天裂。世界各地的孩子大约有1%生每年展品某种形式的颅面畸形学的。

腭和唇的裂需要非常昂贵和复杂的过程与谁有这种异常的患者终生影响。估计费用为每一个病人口腔裂约为$ 10万个4。与唇腭裂患者的治疗需要一个团队的医生,包括颅面外科,耳鼻喉科,遗传学家,麻醉医师,言语语言病理学家,营养学家,正牙医生,prosthodontists,心理学家,神经外科医生,和眼科医生。

在腭,次级腭产生作为副产物配对,最初垂直增长和经受舌头的鼻背上述腭搁板标高。随着海拔的配对腭增长对(在小鼠E14.5 -E15和9周人)中线。内侧缘上皮细胞(MEE),涵盖了架子尖端附着形成中线上皮煤层。

这之后是上皮至间质转变和/或凋亡,以允许充质汇合。反对MEE的附着力是一个重要事件,其​​变更导致腭裂。然而,只有少数研究调查了腭5的初始粘合性。硬腭形式由分化的间充质细胞的成骨细胞。口感可以产生谱号的畸形发展吨口味有或没有唇部的参与。

腭器官培养技术被广泛应用于很多实验室在过去30年6,7了。

在这个协议中,我们详细描述腭解剖和静态器官培养的方法。一动不动器官培养的优点是,它允许腭融合。这种技术已经被成功地用于在我们的实验室对许多聚变和信令实验8,9。然而该技术的范围广阔,可以用于每当静态器官培养系统是必需的,包括响应外源性化学药剂的评价中,在不同的途径和特定蛋白质调节的生长因子的作用。

图1
图1.鼠标腭,小鼠腭的发展阶段。(BF)扫描 ELE二级腭ctron显微照片(SEM)的代表发展时期。红色箭头:显示腭粘附和融合的初始部分。黄箭头:点到初级和次级口味融合后,将消失之间的空间(重印从考夫曼11与许可PLOS之一)。

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Protocol

描述所有的程序必须按照与使用脊椎动物,其中包括由当地机构动物护理和使用委员会事先批准的准则和规定进行。

1.准备解剖仪器仪表及文化传媒

  1. 要用于在夹层预洗所有仪器用3%的过氧化氢,然后高压釜在121℃下20分钟。过滤BGJb介质与使用0.22微米孔径大小的过滤器是在一个通风柜真空抽吸抗生素和抗真菌溶液。

2.准备文化设备

  1. 切,将支持腭器官小三角形聚碳酸酯膜过滤器,喷以70%的酒精,并允许他们干。通过将清洁和消毒等边三角形状的线栅(20毫米)在器官培养板制备中心阱器官培养的培养皿(60x15毫米)。然后填写井用1毫升的BGJB媒体文化传媒。注意:介质应足以达到网格的水平而不浸没的口味。放置膜过滤器,有光泽的一面朝下,对电网的顶部(每格3-4的膜).Depending在实验中,处理(蛋白质,抗体或抑制剂)可以被加入到培养基

3.小鼠胚胎收集和准备文化

  1. 为了获得野生型小鼠胚胎,利用定时13.5怀孕的CD-1小鼠遗传背景品系。清洁用70%乙醇的解剖区域。
    注:可用于小鼠的其他菌株。我们优选CD-1小鼠,因为更大的垫料数量。
  2. 安乐死怀孕小鼠E13.5 DPC(天性交后),用5%异氟醚颈椎脱位使用批准的协议来保证死刑。
  3. 喷洒在腹侧的腹部表面的70%的乙醇,以避免腹部卷发棒的文书。然后腹侧打开腹腔用尖钝经营剪刀和微解剖钳定位子宫。使用镊子,解除整个子宫和削减在子宫体和子宫角的一个光操作剪刀的提示它从身体分离。
  4. 将子宫上干净的纸巾在冰​​(根据协议指南护理和使用实验动物的)。用另一干净的纸巾,以防止污染的子宫。消毒用70%乙醇喷洒在进一步使用仪器。子宫和胚胎可以运到在冰上的实验室。
  5. 在一个开放的层流罩,仔细地做一个小开口,利用尖钝经营剪刀和微解剖钳卵黄囊。使扩大开放,然后轻轻将其推到exteriorize从卵黄囊胚胎。
  6. 立即胚​​胎转移至培养皿用冷的磷酸盐缓冲盐水1X(PBS)的pH为7.4。为了确保适当的阶段,前胺解剖显微镜的身体,头部大小和肢体形态下的胚胎。
    不用于实验胚胎不属于在发展的权阶段:注意。

图2
图2.肢芽形态的前后肢被检查的数字之间织带缩进的程度。在E13.5,所有的数字凝聚突出,与数字之间的织带和远端缺口出现非常明显的。在后数字是落后了半天12上排:前肢,下排:后肢。

4.腭解剖

  1. 在用PBS解剖显微镜下的培养皿放置一个胚胎的时间。使用小解剖剪和镊子从胚的体分开的头部。
  2. 小心地握着鼠标颅骨高于人眼视觉用钳子(避免上颌处理)上的唇线两侧做出两个切口。然后取出下颌和舌头。通过切割在眼睛水平隔离上颌处理区,并取出大脑,眼睛,鼻中隔和毗邻的组织。

图3
从13.5胚胎,当腭货架具有升高的图3.腭组织收集但不进行接触,腭置于器官培养上在72小时的静态模型空气媒体接口的过滤器。(A)的水平解剖上的E13.5胚胎。(B)的蓝色恒星划分区域举行与解剖过程中钳组织。(C)查看放置在梯形滤膜解剖腭。培养皿(D)侧面的位置后,剖分口味和加入培养基。

  1. 将腭口朝上,取出鼻中隔和它周围的组织,保持连接到帮助引导它由前至后的主要口味。用勺子铲,并在培养皿非常仔细地转移腭(鼻朝下)将准备好的过滤器上的网格。注:调整媒体音量,允许适当的空气介质接口。
  2. 根据体视显微镜,解剖主要腭及用镊子将腭接近对方。该腭不会熔化,如果他们不接触放置。切三角形的膜过滤器,其中腭前部的位置。梯形形状将有助于定位上腭的前部。
  3. 单独或与两个或三个在使用BGJb培养基相同的器官培养皿培养的腭。

5.培养鼠标腭

  1. 孵育Tissu酒店在37℃下在加湿的气体混合物(5%CO 2和95%空气)72小时ES,并改变它的介质,每24小时。

6.口感处理进行组织学分析

  1. 72小时培养用4%甲醛/磷酸缓冲盐水ö后固定的口味/ N在4℃   ℃。然后,轻轻地用移液管在培养皿用PBS洗涤组织。裹在一块实验室湿巾和地方口味的嵌入盒。
    注:完成实验室湿巾口味防止在脱水过程中的损失。
  2. 脱水组织以下70%,80%和100%的乙醇洗涤1小时,随后经常石蜡包埋过程。嵌入,将面临的托盘上腭的前部。
  3. 由前切串行6微米的部分在冠状定向后路。一个完整的部分腭将产生350-450 secti组件。染色用苏木精和曙红(H&E)。10分数使用先前描述的平均数融合得分,每20 段(MFS)比例(表1)的部分。8

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Representative Results

该技术可应用于各种不同experiments.The以下研究的目的是测试尼古丁在体外对腭融合致畸作用。被用于本次实验的两个品系的小鼠,CD1和C57.Palatal组织与烟碱半硫酸盐的0.06和6mm的浓度处理。据观察,腭融合模式和时间分别在两个不同的菌株不同。在CD1小鼠,与对照组腭持续融合在时间依赖性。然而,在治疗组烟碱特别是在6毫米尼古丁浓度图4A)延迟融合。的CD1小鼠味觉组织学切片显示72小时,对照标本后,总的融合。在较低剂量的尼古丁的腭附着但上皮细胞保持在培养3天。培养在高剂量的尼古丁腭72小时培养后没有进行接触。

(图4B)的比较试样孵育48小时。对C57小鼠味觉组织学切片显示,治疗组在中线连续上皮缝坚持。融合观察刚好在对照组中在72小时。

我们观察到在这两种小鼠的腭融合,受高剂量的尼古丁。然而,从C57的口味更明智的尼古丁。总之,我们的结果表明,小鼠的遗传背景影响尼古丁反应在腭组织。

图4
图 4.两个菌株的小鼠口味在尼古丁的存在下培养24,48,或72小时的小鼠品系响应在不同程度的尼古丁。暴露于高剂量的尼古丁(6毫摩尔)各种不同口味未能熔化并具有低的平均得分融合(MFS)。注意,在24小时后,没有任何的口味已经关闭,MFS从1范围(腭不接触)到3(部分融合)的所有组。通过48小时,许多控制口味已部分熔融(分数超过3),并通过72小时后,将CD1口味完全熔融(得分为5),但C57控件还没有完全熔融(3.67)。 (距离Maria塞拉诺和凯西·斯沃博达博士未公布数据)。

得分了标准
1 非融合,没有粘合性。
2 非融合的一些明显的粘合性。
3 粘连的MEE层部分解体和明确的部分间质汇合。
4 完全融合MEE细胞或缝剩余的痕迹。
完全融合,没有证据表明MEE细胞或缝可见。

表1:平均融 ​​合得分(MFS)规模 (康和斯沃博达,2002)。计算分数每个腭的前(第1-150),中(第150-300),后(第300-450)。8

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Discussion

本文中的方案提供了从胚胎解剖腭为13.5天胚胎的方法。从小鼠胚胎腭分别在无血清的培养基中培养在95% O 2,5%CO 2的气氛下在37℃。成功的腭夹层是极其依赖于多种因素,在从安乐死的小鼠的培养完成的胚胎时在操作过程中的每个步骤。一的影响腭融合的最重要因素是启动器官培养所需要的时间;胚胎必须在13.5作为二次腭货架是水平的胚胎天,但还没有开始熔化( 图1)。

在手术过程中的另一个关键点是从卵黄囊胚胎的外化。此步骤需要非常小心,以防止损坏的面部结构。一旦胚被从囊移除,头从除去身体并放置在陪替氏培养皿以与从两侧光纤照明立体显微镜观看。下颌骨和舌头都去掉了,露出了味觉。大脑和残留组织在眼睛水平被删除。在这一点上重要的是考虑周围的货架上皮层是重要的。有必要操纵组织非常小心,以保持这些细胞的完整性。上皮细胞负责粘附的MES和形成。

每个解剖腭打开口腔面朝下清洗从鼻中隔软骨的任何。该组织是上腭的前侧,似乎更白,更简明。自由有害的组织腭移到培养皿,并放置在过滤膜的顶部。货架的位置的立体声解剖显微镜下再次检查。他们必须推到一起,让坚持,并进一步对腭融合。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

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References

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