Methode der Untersuchung Palatal Fusion mit statischen Organ Culture

Developmental Biology

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Summary

Studium der Gaumen Entwicklung werden durch das Auftreten von Gaumenspalte, einem Geburtsfehler, die eine enorme gesundheitliche Belastung auferlegt und hinterlassen bleibende Entstellung motiviert. Wir zeigen hier eine Technik zur Kultur palatinalen Regalen, die verwendet werden können, um verschiedene Signalwege in palatinalen Entwicklung und Fusion studieren.

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Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

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Abstract

Lippen- und Gaumenspalte gehören zu den am häufigsten von allen Geburtsfehler. Die sekundären Gaumen Formen aus mesenchymalen Regale mit Epithel bedeckt, die die Mittellinie epithelialen Naht haftet (MES). Die Theorien besagen, dass MES-Zellen folgen eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT), Apoptose und Migration, so dass ein fusioniertes Gaumen 1. Vollständigen Zerfall der MES ist die letzte wesentliche Phase der Gaumenzusammenfluss mit umliegenden mesenchymalen Zellen. Wir stellen ein Verfahren zum Gaumen Organkultur. Die in vitro-Protokoll entwickelt, ermöglicht die Erforschung der biologischen und molekularen Prozesse bei der Fusion. Die Anwendungen dieser Technik sind zahlreich, darunter Auswertung der Antworten auf exogene chemische Mittel, die Auswirkungen der regulatorischen und Wachstumsfaktoren und spezifische Proteine. Palatinalen Organkultur hat eine Reihe von Vorteilen, einschließlich Manipulation in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung, die nicht mit in vivo-Studien ist möglich.

Introduction

Gesichtsspalten sind die vorherrschenden kraniofaziale Missbildungen. Auch bei Berücksichtigung aller möglichen kraniofazialen Defekten, dies sind die zweithäufigste Geburt Anomalien bei Neugeborenen 2. Gaumenspalten bei ungefähr 1 in jeden 700 Geburten in den Vereinigten Staaten (US) jedes Jahr auftreten, ist die Inzidenz von Gaumenspalte gleich 475 Kinder mit Gaumenspalten pro Monat oder 15 Kinder mit Spalten pro Tag 3 geboren. Etwa 1% der Kinder geboren auf der ganzen Welt jedes Jahr weisen irgendeine Form von kraniofazialen Dysmorphien.

Klüften des Gaumens und der Lippen brauchen einen sehr teuren und komplizierten Verfahren mit lebenslangen Folgen für die Patienten, die diese Anomalie haben. Die geschätzten Kosten für jeden Patienten mit oralen Spalt beträgt ca. 100.000 $ 4. Die Behandlung eines Patienten mit Lippen- und Gaumenspalte erfordert ein Team von Ärzten einschließlich Schädelchirurgen, HNO-Ärzte, Genetiker, Anästhesisten,Logopäden, Ernährungswissenschaftler, Kieferorthopäden, Zahntechniker, Psychologen, Neurochirurgen und Augenärzten.

In palatogenesis, stellt sich die sekundären Gaumen gepaart Auswüchse, die ursprünglich vertikal wachsen und unterziehen Gaumenregal Höhe über den Zungenrücken. Nach der Erhebung, wachsen die paarigen Gaumen Regalen in Richtung der Mittellinie (bei E14.5 -E15 bei Mäusen und Woche 9 bei Menschen). Der mediale Rand Epithel (MEE), die die Lagerspitze deckt haftet Bildung der Mittellinie epithelialen Naht.

Dies wird durch epitheliale zu mesenchymale Transition und / oder Apoptose gefolgt, um mesenchymale Fluss zu ermöglichen. Haftung der gegenüberliegenden MEE ist ein wesentliches Ereignis, dessen Veränderung bewirkt, Gaumenspalte. Allerdings untersucht nur wenige Studien, die Anfangshaftung der Gaumen Regalen 5. Die harten Gaumen Formen durch Differenzierung von mesenchymalen Zellen in Osteoblasten. Die abnorme Entwicklung des Gaumens können Schlüssel zu erzeugent Gaumen mit oder ohne Beteiligung der Lippe.

Gaumen Organkulturtechniken hatte weithin für viele Labors in den letzten 30 Jahren 6,7 verwendet.

In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail ein Verfahren zur Gaumen Dissektion und statischer Organkultur. Der Vorteil eines bewegungsOrganKultur ist, dass es Gaumen Regalen zu verschmelzen. Diese Technik war erfolgreich in unserem Labor für viele Fusion und Signalisierung Experimenten 8,9 verwendet. Aber der Schutzumfang der Technik ist beträchtlich und kann verwendet werden, wann immer statische Organkultursystem erforderlich ist, einschließlich der Bewertung der Reaktionen auf exogene chemische Mittel sein, die Auswirkungen regulatorischer Wachstumsfaktoren in verschiedenen Bahnen und bestimmten Proteinen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Maus Palatogenesis. Entwicklungsstadien der Mäuse Gaumen. (BF) Scanning elecTRON Mikroskopische Aufnahmen (SEM) der Sekundär Gaumen an repräsentativen Entwicklungszeiten. Rote Pfeile: zeigen den Anfangsteil der Gaumen Adhäsion und Fusion. Gelbe Pfeile: Punkt, um den Raum zwischen den primären und sekundären Gaumen, die nach der Fusion verschwinden (nachgedruckt von Kaufman 11 mit Genehmigung von PLoS ONE).

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Protocol

Alle beschriebenen Verfahren muss in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch die lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt werden.

1. Herstellung von Dissecting Instrumente und Kultur Medien

  1. Vorwäsche alle Instrumente in Präparation mit 3% Wasserstoffperoxid und dann Autoklavieren bei 121 ° C für 20 Minuten verwendet werden. Filter BGJb Medien mit einer Antibiotika und Antimykotika-Lösung unter Verwendung eines 0,22 um Porengroße Filter mit Vakuumsauger in einer Haube.

2. Herstellung der Kultur Ausrüstung

  1. Schneiden Sie Polycarbonat-Membranfilter, die den Gaumenorgane in kleine Dreiecke unterstützen wird, Spray mit 70% Alkohol und lassen Sie sie trocknen. Bereiten Sie Mitte-Well Organ Culture Dish (60x15 mm), indem Sie einen sauberen und sterilisiert gleichseitigen dreieckigen Drahtgitter (20 mm) über den Organkulturplatte. Dann füllen Sie das auch mit 1 ml BGAK Medienkulturmedien. ANMERKUNG: Das Medium sollte ausreichen, um die Höhe des Gitters ohne Eintauchen der Gaumen erreichen. Platzieren des Membranfilters, glänzenden Seite nach unten, auf die Oberseite des Gitters (3-4 Membranen pro Raster) .Depending auf das Experiment, kann die Behandlung (Proteine, Antikörper oder Inhibitoren) für die Medien hinzugefügt werden

3. Mouse Embryo Gewinnung und Vorbereitung für die Kultur

  1. Zu Wildtyp-Maus-Embryonen erhalten, verwenden zeitlich 13,5 schwangere CD-1-Maus genetischen Hintergrund Belastung. Reinigen Sie das Sezierung Bereich mit 70% Ethanol.
    Hinweis: andere Mäusestämme verwendet werden. Wir bevorzugen CD-1-Mäusen wegen der größeren Wurfnummer.
  2. Euthanize schwangeren Mäusen bei E13.5 dpc (Tage nach dem Koitus) mit 5% Isofluran durch Genickbruch folgte zum Tode mit zugelassenen Protokolle zu versichern.
  3. Spray 70% Ethanol auf der ventralen Bauchoberfläche zu vermeiden, dass die Bauchhaarstock zu den Instrumenten. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle ventralmit einem scharf stumpfen Betriebs Schere und Mikro-Pinzette die Gebärmutter zu lokalisieren. Mit den Zangen, heben Sie die gesamte Gebärmutter und trennen sie vom Körper durch Schneiden an der Gebärmutterkörper und an den Spitzen der Uterushörner mit Licht Betriebs Schere.
  4. Legen Sie die Gebärmutter auf einem sauberen Papiertuch über Eis (Nach dem Protokoll Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren). Decken Sie die Gebärmutter mit einem anderen sauberen Papiertuch, um eine Kontamination zu verhindern. Sterilisieren der Instrumente mit 70% Ethanol Spray vor der weiteren Verwendung. Der Uterus und die Embryonen in das Labor auf Eis transportiert.
  5. In einem offenen Laminarströmungshaube, sorgfältig machen eine kleine Öffnung im Dottersack mit spitz stumpf Betriebs Schere und Mikro-Pinzette. Stellen Sie die Öffnung breiter und dann drücken Sie sie vorsichtig, um den Embryo aus dem Dottersack exteriorisieren.
  6. Transfer der Embryonen sofort auf eine Petri-Schale mit kalter Phosphat-gepufferter Saline 1X (PBS), pH 7,4. Um die richtige Bühne, ex versichern,Amin der Embryo unter einem Binokular für den Körper, Kopfgröße und Leben Morphologie.
    HINWEIS: Embryonen, die nicht im richtigen Entwicklungsstadium befinden, nicht für das Experiment verwendet.

Figur 2
Abbildung 2 Gliedmaßen Morphologie. Die Vorder- und Hinterschenkel auf den Grad der Gurtband Einbuchtung zwischen den Ziffern geprüft. Bei E13.5 sind alle stelligen Verdichtungen prominent, mit der Gurt und distale Einkerbungen zwischen den Ziffern erscheinen sehr deutlich. Die Hinter Ziffern hinten von einem halben Tag 12 Obere Reihe:. Vorderbein, untere Reihe: Hintergliedmaße.

4. Am Gaumen Dissection

  1. Setzen Sie einen Embryo zu einem Zeitpunkt, in einer Petrischale mit PBS unter dem Binokular. Mit Hilfe von kleinen Präparierscheren und Pinzette trennen den Kopf vom Körper der Embryonen.
  2. Sorgfältig halten Sie die Maus Schädels über Augenhöhe mit einer Pinzette (Vermeidungdie Oberkieferfortsatz) machen zwei Einschnitte auf beiden Seiten der Lippenlinie. Dann entfernen Sie den Unterkiefer und Zunge. Isolieren Sie die Oberkieferfortsatz Region, indem ein Schnitt in Augenhöhe und entfernen Sie das Gehirn, Augen, Nasenscheidewand und der angrenzenden Gewebe.

Figur 3
Abbildung 3. Am Gaumen Gewebe von 13,5 Embryonen, wenn die Gaumen Regalen erhöht hatte gesammelt, aber nicht Kontakt hergestellt. Die Gaumen Regale wurden in Organkultur auf einem Filter an der Luftmedienschnittstelle 72 h im statischen Modell gelegt. (A) Niveau Dissektion auf E13.5 Embryos. (B) Blaue Sterne abzugrenzen Bereichen, um das Gewebe mit einer Pinzette bei der Präparation zu halten. (C) Blick seziert Gaumen Regalen auf einem Trapezfiltermembran platziert. (D) Seitenansicht der Kulturschale nach der Platzierung der seziert Gaumen und Zugabe von Kulturmedien.

  1. Legen Sie die Gaumen oralen Seite nach oben und entfernen Sie die Nasenscheidewand und das Gewebe um ihn herum, halten die primäre Gaumen befestigt zu orientieren sie von vorne nach hinten zu helfen. Mit einem Löffel Spachtel und sehr sorgfältig übertragen Sie die Gaumen Regalen (Nasenseite nach unten) auf die vorbereiteten Filter auf die Netze in den Kulturschalen. HINWEIS: Stellen Sie die Lautstärke von Medien, um eine ordnungsgemäße Luft-Media-Schnittstelle zu ermöglichen.
  2. Unter dem Stereomikroskop, sezieren die primäre Gaumen und mit Hilfe einer Pinzette, um die Gaumen Regalen nahe beieinander zu platzieren. Die Gaumen Regale werden nicht schmelzen, wenn sie nicht in Kontakt gebracht. Schneiden Sie die dreieckigen Membranfilter, wo der vordere Teil des Gaumens befindet. Die Trapezform wird bei der Lokalisierung der vordere Teil des Gaumens zu unterstützen.
  3. Kultur Gaumen Regale einzeln oder mit zwei oder drei in der gleichen Organkulturschale mit BGJb Kulturmedien.

5. Die Kultivierung Maus Palatal Regale

  1. Inkubieren Sie die tissues bei 37 ° C in einer befeuchteten Gasgemisch (5% CO 2 und 95% Luft) für 72 Stunden, und ändern Sie das Medium alle 24 Stunden.

6. Am Gaumen Verarbeitung für die histologische Analyse

  1. Befestigen Sie die Gaumen nach 72 Stunden in Kultur mit 4% Formaldehyd / phosphatgepufferter Kochsalzlösung O / N bei 4 °   Dann wurden vorsichtig mit einer Transferpipette waschen das Gewebe in der Kulturschale mit PBS. Wickeln Sie die Gaumen in einem Stück Laborwischtücher und in Einbettkassetten.
    HINWEIS: Wrapping den Gaumen in Laborwischtücher zu verhindern den Verlust während des Entwässerungsprozesses.
  2. Dehydratisierung des Gewebes folgenden 70%, 80% und bis zu 100% Ethanol wäscht für 1 h, gefolgt von der regulären Paraffineinbettung Verfahren. Zum Einbetten, platzieren Sie den vorderen Teil des Gaumens mit Blick auf das Tablett.
  3. Schneiden Sie Serien 6 um Abschnitte in der koronale Orientierung von vorne nach hinten. Eine komplette Abschnitt Gaumen 350-450 Abschnit ergebenons. Färben die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). 10 Note jedes 20. Abschnitt Verwendung der zuvor beschriebenen Mittlere Fusion Score (MFS) Skala (Tabelle 1). 8

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Representative Results

Die Technik kann auf verschiedene Arten von experiments.The folgende Studie angewendet werden sollte die teratogene Wirkung von Nikotin in vitro an palatinalen Fusion zu testen. Zwei Mäusestämme wurden für dieses Experiment verwendet wurde CD1 und C57.Palatal Gewebes mit 0,06 und 6 mM Konzentrationen von Nikotin Hemisulfat behandelt. Es wurde beobachtet, dass palatalen Fusions Muster und Zeitpunkt wurden in den zwei unterschiedlichen Stämmen unterschiedlich. In CD1-Mäusen, Gaumen Regalen aus der Kontrollgruppe setzte Fusion in der Zeit abhängige Weise. Jedoch in der behandelten Gruppe verzögert Nikotin Fusions insbesondere bei 6 mM Nikotinkonzentration (4A). Histologie Abschnitte CD1 Maus Gaumen zeigten vollkommene Verschmelzung nach 72 h in den Kontrollproben. Bei niedrigeren Dosen von Nikotin haften die Gaumen Regalen, aber die Epithelzellen nach 3 Tagen in Kultur zu bleiben. Gaumen Regalen bei hohen Dosen von Nikotin inkubiert nicht Kontaktierung nach 72 h Inkubation.

(4B) inkubiert. Histologie Abschnitte C57 Mäusen Gaumen zeigten, dass in den Behandlungsgruppen eine kontinuierliche epithelialen Naht beharrte auf der Mittellinie. Fusion wurde nur in der Kontrollgruppe bei 72 Stunden beobachtet.

Wir beobachteten, dass Gaumen Fusion in beiden Arten von Mäusen wurde durch hohe Dosen von Nikotin beeinflusst. Allerdings waren Gaumen von C57 sinnvoller, Nikotin. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass der genetische Hintergrund der Mäuse beeinflusst Nikotin Antworten in Gaumengewebe.

Figur 4
Zwei Stämme von Maus Gaumen in Gegenwart von Nikotin kultiviert für 24, 48 oder 72 Std. Die Mäusestämme reagierten auf die Nikotin in unterschiedlichem Ausmaß. Alle Gaumen der hohen Dosis von Nikotin (6 mM) ausgesetzt versäumt, zu verschmelzen und hatte geringe mittlere Verschmelzungsschwelle (MFS) .Hinweis, dass bei 24 Stunden, keine der Gaumen war geschlossen und der MFS reichte von 1 (Gaumen Regalen nicht berühren) bis 3 (Teilfusion) in allen Gruppen. Von 48 Stunden, sind viele der Steuer Gaumen hatte teilweise verschmolzen (Werte über 3) und um 72 h wurden die CD1 Gaumen komplett verschmolzen (Note 5), aber die C57 steuert nicht vollständig verschmolzen (3,67). (Unveröffentlichte Daten von Maria Serrano und Dr. Kathy Svoboda).

Ergebnis Kriterien
1 Nicht-Fusions ohne Adhäsion.
2 Non-Fusion mit einer gewissen Scheinhaftung.
3 Haftung mit einigen Zerfall der MEE Schichten und klaren Teil mesenchymalen Fluss.
4 Vollständige Verschmelzung mit einigen Spuren der MEE Zellen oder verbleibende Naht.
5 Vollständige Fusion ohne Anzeichen von MEE-Zellen oder eine Naht sichtbar.

Tabelle 1: Durchschnittliche Fusion Score (MFS) Skala (Kang und Svoboda, 2002). Berechnen Sie die Werte für jeden Gaumen für den vorderen (§§ 1 bis 150), Mitte (§§ 150-300) und posterioren (§§ 300-450). 8

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Discussion

Das Protokoll in diesem Artikel stellt ein Verfahren zum Präparieren Gaumen Regalen von Embryonen im embryonalen Tag 13,5. Palatinalen Regalen aus Mausembryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2 5% CO 2 bei 37 ° C. Erfolgreiche palatinalen Dissektion ist kritisch abhängig von mehreren Faktoren in jedem Schritt während des Verfahrens aus dem embryonalen Zeit der Mäuse euthanasiert zu der Beendigung der Kultur. Einer der wichtigsten Faktoren für Gaumenfusion ist die Zeit, um die Organkultur zu starten; Embryonen müssen auf Embryonaltag 13,5 als die sekundären Gaumen Regalen horizontal sind, aber noch nicht begonnen haben, um (1) zu fixieren.

Ein weiterer kritischer Punkt während des Verfahrens ist die Entäußerung von Embryonen aus dem Dottersack. Dieser Schritt erfordert große Sorgfalt, um Schäden an den Gesichtsstrukturen zu verhindern. Sobald sich der Embryo aus dem Sack entfernt ist, wird der Kopf entnommender Körper und die in einer Petrischale gegeben, mit einem Stereomikroskop mit LWL Beleuchtung von beiden Seiten betrachtet werden. Der Unterkiefer und die Zunge entfernt werden, indem die Gaumen. Das Gehirn und das Restgewebe sind auf Augenhöhe entfernt. An diesem Punkt ist es wichtig, die Epithelschicht in den Regalen zu betrachten. Ist es notwendig, das Gewebe vorsichtig manipulieren, um die Integrität der Zellen zu halten. Epithelzellen sind für die Einhaltung und die Bildung der MES verantwortlich.

Jedes seziert Gaumen eingeschaltet oralen Seite nach unten, um jede Knorpel aus der Nasenscheidewand zu reinigen. Dieses Gewebe ist auf der vorderen Seite des Gaumens und erscheint weißer und kondensierte. Palatinalen Regalen frei von unerwünschten Gewebes werden in eine Kulturschale entfernt und auf die Oberseite der Filtermembran angebracht. Die Position der Regale wird wiederum unter dem Stereomikroskop geprüft Sezieren. Sie müssen zusammen geschoben werden, um die Einhaltung und weiter Gaumen Fusion zu ermöglichen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

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References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

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