Metode til at studere Palatal Fusion hjælp Statisk Organ Culture

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Undersøgelser af ganen udvikling er motiveret af forekomsten af ​​ganespalte, en misdannelse, der pålægger en enorm sundhed byrde og kan forlade varig vansiring. Vi demonstrerer her en teknik til kultur palatinalt hylder, som kan bruges til at studere forskellige signalveje der er involveret i udvikling og palatal fusion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Læbe-ganespalte er blandt de mest almindelige af alle fosterskader. De sekundære ganen formularer fra mesenkymale hylder dækket med epitel, der klæber til at danne midterlinjen epitelial sømmen (MES). Teorierne tyder på, at MES celler følge en epitelial til mesenkymale overgang (EMT), apoptose og migration, hvilket gør en sammensmeltet ganen 1. Fuldstændig opløsning af MES er den sidste væsentlige fase af palatal sammenløb med omgivende mesenkymale celler. Vi tilvejebringe en fremgangsmåde til ganen organkultur. Den udviklede in vitro protokol tillader undersøgelse af de biologiske og molekylære processer i fusion. Anvendelserne af denne teknik er talrige, herunder evaluere svar på exogene, kemiske stoffer, virkningerne af regulerings- og vækstfaktorer og specifikke proteiner. Palatal organkultur har en række fordele, herunder manipulation på forskellige udviklingsstadier dette ikke er muligt ved hjælp af in vivo-undersøgelser.

Introduction

Orofaciale kløfter er de mest fremherskende kraniofaciale fosterskader. Også, idet der i hensyn til alle mulige kraniofaciale defekter, disse er den næsthyppigste fødsel anomali hos nyfødte 2. Kløft ganer forekomme på cirka 1 ud af hver 700 fødsler i USA (US) hvert år, forekomsten af ganespalte er lig med 475 børn født med kløvede ganer om måneden eller 15 børn med kløfter per dag 3. Ca. 1% af børn født rundt om i verden hvert år udviser en form for kraniofacial dysmorfologi.

Kløfter af ganen og læben har brug for et meget dyrt og kompliceret procedure med livslang konsekvenser for patienter, der har denne anomali. De anslåede omkostninger for hver patient med oral kløft er ca $ 100,000 4. Behandlingen af ​​en patient med læbe-ganespalte kræver et team af læger, herunder kraniofaciale kirurger, otolaryngologists, genetikere, narkoselæger,tale-sprog patologer, ernæringseksperter, odontologer, prosthodontists, psykologer, neurokirurger og øjenlæger.

I palatogenesis, opstår den sekundære ganen som parrede udvækster, der oprindeligt vokser lodret og undergår palatal hylde højde over tungens dorsum. Efter elevation, de parrede palatinalt hylderne vokser mod midterlinjen (ved E14.5 -E15 i mus og uge 9 i mennesker). Den mediale kant epitel (MEE), som dækker hylden spids klæber danner midterlinjen epithelial søm.

Dette efterfølges af epitelial til mesenkymale overgang og / eller apoptose at tillade mesenchymale konfluens. Vedhæftning af modsatrettede MEE er en vigtig begivenhed, hvis ændring forårsager ganespalte. Men kun få studier undersøgt den indledende vedhæftning af palatinalt hylder 5. Den hårde gane former af differentiering af mesenchymale celler i osteoblast. Den unormal udvikling af ganen kan producere nøglet ganer med eller uden inddragelse af læben.

Ganen orgel kultur teknikker havde været anvendt bredt til mange laboratorier i de seneste 30 år 6,7.

I denne protokol vi beskriver i detaljer en metode til palatal dissektion og statisk orgel kultur. Fordelen ved en ubevægelig organkultur er at det giver palatinalt hylder til at fusionere. Denne teknik er blevet anvendt med succes i vores laboratorium for mange fusion og signaler eksperimenter 8,9. Men omfanget af teknikken er enorme og kan bruges, når statisk orgel kultur-systemet er påkrævet, herunder evaluering af reaktioner på eksogene kemiske stoffer, virkningerne af regulatoriske vækstfaktorer i forskellige veje og specifikke proteiner.

Figur 1
Figur 1. Mus Palatogenesis. Udviklingsmæssige stadier af mus ganen. (BF) Scanning electron mikrografer (SEM) af den sekundære ganen på repræsentative udviklingsmæssige gange. Røde pile: viser den første del af palatal vedhæftning og fusion. Gule pile: punkt til rummet mellem de primære og sekundære ganer, som vil forsvinde efter fusion (genoptrykt fra Kaufman 11 med tilladelse fra PLoS ONE).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beskrevne procedurer skal udføres i overensstemmelse med de retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse af den lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Fremstilling af Dissecting Instrumenter og Kultur Medier

  1. Forvask alle instrumenter, der skal anvendes i dissektion med 3% hydrogenperoxid og derefter autoklave ved 121 ° C i 20 minutter. Filter BGJb medier med antibiotikum og antimykotisk løsning ved hjælp af en 0,22 um pore størrelse filter med vakuumsug i en hætte.

2. Udarbejdelse af kultur Udstyr

  1. Skær polycarbonat membranfiltre, som vil støtte de palatinalt organer i små trekanter, spray med 70% alkohol og lad dem tørre. Forbered center-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) ved at placere en ren og steriliseret ligesidet trekantet trådgitter (20 mm) over organkultur pladen. Derefter fyldes brønden med 1 ml BGJB mediekultur medier. BEMÆRK: Medierne bør være tilstrækkelig til at nå op på nettet uden at nedsænke de ganer. Placer membranfiltrene, blanke side nedad, på toppen af ​​gitteret (3-4 membraner pr gitter) .Depending på eksperimentet, kan tilføjes behandling (proteiner, antistoffer eller inhibitorer) til medierne

3. Mus Embryo Indsamling og til kultur

  1. For at opnå vildtype museembryoer, brug timed 13,5 gravide CD-1 mus genetisk baggrund stamme. Rengør dissektion området med 70% ethanol.
    BEMÆRK: Der kan anvendes andre stammer af mus. Vi foretrækker CD-1 mus på grund af den større kuld nummer.
  2. Aflive gravide mus på E13,5 DPC (dage efter samleje) med 5% isofluran efterfulgt af cervikal dislokation at forsikre døden ved hjælp af anerkendte protokoller.
  3. Spray 70% ethanol på den ventrale abdominale overflade for at undgå at have den abdominale hår pind til instrumenterne. Åbn derefter bughulen ventraltved hjælp af en-stump skarp drifts- saks og mikro-dissekere pincet til at finde livmoderen. Brug af pincet, løfte hele livmoderen og adskille den fra kroppen ved at skære på livmoderen og ved spidserne af livmoderhornene med en lys drifts- saks.
  4. Placer livmoderen på et rent stykke køkkenrulle over is (Ifølge protokollen guide til pasning og anvendelse af forsøgsdyr). Dæk livmoderen med en anden ren køkkenrulle for at forhindre forurening. Sterilisere instrumenterne hjælp 70% ethanol spray før videre brug. Livmoderen og embryonerne kan transporteres til laboratoriet på is.
  5. I et åbent laminær strømning, omhyggeligt gøre en lille åbning i blommesækken hjælp-stump skarpe drifts- saks og mikro-dissekere pincet. Gøre åbningen bredere og derefter forsigtigt skubbe den til eksteriorisere embryonet fra blommesækken.
  6. Overfør embryoner straks til en petriskål med kold phosphatpufret saltopløsning 1X (PBS) pH 7,4. For at sikre den korrekte fase, examin embryo under et dissektionsmikroskop for kroppen, hovedstørrelse og lemmer morfologi.
    BEMÆRK: Embryoer, der ikke er på det rigtige trin i udviklingen ikke anvendes til eksperimentet.

Figur 2
Figur 2. Limb Bud morfologi. For- og bagben kontrolleres for graden af gjord fordybning mellem cifrene. På E13,5, alle cifrede kondensationer er fremtrædende, med gjorden og distale fordybninger mellem cifre vises meget tydelig. Hind cifre er bag ved en halv dag 12 Øverste række:. Forben, nederste række: bagben.

4. Palate Dissektion

  1. Placer en embryo ad gangen i en petriskål med PBS under dissektionsmikroskop. Ved hjælp af små Dissecting saks og pincet adskille hovedet fra kroppen af ​​embryonerne.
  2. Omhyggeligt holde musen kraniet over øjenhøjde med pincet (undgåmaxillary processen) lave to indsnit på begge sider af læbe linje. Derefter fjerne underkæben og tungen. Isoler maxillary proces regionen ved at lave et snit i øjenhøjde og fjern hjerne, øjne, næseskillevæggen og tilstødende væv.

Figur 3
Figur 3. Palate væv indsamlet fra 13,5 embryoer, når ganen hylderne havde forhøjet, men ikke taget kontakt. De palatinalt hylder blev placeret i orgel kultur på et filter på luft medier interface til 72 timer i den statiske model. (A) Niveau af dissektion på E13,5 foster. (B) Blå stjerner afgrænse områder til at holde vævet med en pincet under dissektion. (C) Udsigt dissekerede palatinalt hylder placeret på en trapez-filter membran. (D) Set fra siden af dyrkningsskål efter placering af dissekerede ganer og tilsætning af kulturmedier.

  1. Placer palatal orale opad og fjern næseskillevæggen og vævet omkring det, holde det primære ganen knyttet til at hjælpe orientere det fra forreste til bageste. Brug en ske spatel og meget omhyggeligt overføre palatinalt hylderne (nasal side nedad) til de forberedte filtre på ristene i dyrkningsskålene. BEMÆRK: Juster mængden af ​​medier for at muliggøre ordentlig luft-media interface.
  2. Under stereomikroskop, dissekere primære ganen og bruge pincet til at placere palatinalt hylderne tæt på hinanden. De palatinalt hylder vil ikke smelte, hvis de ikke er i kontakt. Skær trekantede membranfilter hvor forreste del af ganen er placeret. Den trapezform vil hjælpe med at lokalisere den forreste del af ganen.
  3. Kultur palatinalt hylderne enkeltvis eller med to eller tre i samme organ dyrkningsskål hjælp BGJb kulturmedier.

5. Dyrkning Mouse palatal Hylder

  1. Inkubér tissues ved 37 ° C i en befugtet gasblanding (5% CO2 og 95% luft) i 72 timer, og ændre medium hver 24 timer.

6. Palate Behandling for Histologisk analyse

  1. Fastgør ganer efter 72 timer i kultur med 4% formaldehyd / phosphatbufret saltvand O / N ved 4 ° C   C. Derefter forsigtigt med en overførsel pipette vaske vævet i kulturen fad med PBS. Pak ganer i et stykke laboratorie servietter og plads i indlejring kassetter.
    BEMÆRK: Indpakning ganer i laboratorie klude forhindre deres tab i dehydrering proces.
  2. Dehydrere væv efter 70%, 80% og op til 100% ethanol vaske i 1 time, efterfulgt af regelmæssige paraffinindlejring procedure. Til indlejring, placere den forreste del af ganen vender bakken.
  3. Skær Serial 6 um sektioner i koronale orientering fra forreste til posterior. En komplet sektion ganen vil give 350-450 sections. Plette sektioner med hematoxylin og eosin (H & E). 10 Vurdering hver 20. sektion anvendelse af den tidligere beskrevne Mean Fusion Score (MFS) skala (tabel 1). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teknikken kan anvendes til forskellige former for experiments.The følgende undersøgelse blev designet til at teste den teratogene virkning af nikotin in vitro på palatal fusion. To stammer af mus blev anvendt til dette eksperiment blev CD1 og C57.Palatal væv behandlet med 0,06 og 6 mM koncentrationer af nikotin hemisulfat. Det blev observeret, at palatinalt fusion mønstre og timing var forskellige i de to forskellige stammer. I CD1 mus, palatinalt hylder fra kontrolgruppen fortsatte fusion i tidsafhængig måde. Men i den behandlede gruppe nikotin forsinket fusion især ved 6 mM nicotinkoncentration (figur 4A). Histologi sektioner af CD1 mus ganer viste total fusion efter 72 timer i kontrol prøver. Ved lavere doser af nikotin palatinalt hylder klæbe men epitelcellerne tilbage efter 3 dage i kultur. Palatal hylder inkuberet ved høje doser af nikotin ikke komme i kontakt efter 72 timer inkubation.

(figur 4B). Histologi sektioner af C57 mus ganer viste, at i behandlingsgrupper en kontinuerlig epitelial søm varet i midterlinjen. Fusion blev observeret kun i kontrolgruppen efter 72 timer.

Vi observerede, palatal fusion i begge typer af mus blev påvirket af høje doser af nikotin. Men ganer fra C57 var mere fornuftigt at nikotin. Afslutningsvis vores resultater viser, at den genetiske baggrund af mus påvirker nikotin reaktioner i palatinalt væv.

Figur 4
To stammer af mus ganer dyrket i nærvær af nikotin i 24, 48 eller 72 timer. De musestammer reagerede på nikotin i forskellige grader. Alle ganer udsættes for høj dosis af nikotin (6 mM) undlod at smelte og havde lav gennemsnitlig fusion score (MFS) .Bemærk, at der på 24 timer, havde ingen af ​​de ganer lukket og MFS varierede fra 1 (palatinalt hylder ikke røre) til 3 (delvis fusion) i alle grupper. Ved 48 timer, havde mange af de kontrol- ganer delvist smeltet (scores over 3) og ved 72 timer blev de CD1 ganer helt smeltet (score på 5), men C57 kontroller havde ikke helt smeltet (3,67). (Ikke offentliggjorte data fra Maria Serrano og Dr. Kathy Svoboda).

Score Kriterier
1 Ikke-fusion med ingen vedhæftning.
2 Ikke-fusion med nogle tilsyneladende vedhæftning.
3 Adhæsion med nogle opløsningen af ​​MEE lag og klar delvis mesenchymale konfluens.
4 Fuldstændig fusion med nogle spor af MEE celler eller søm tilbage.
5 Fuldstændig smeltning uden tegn på MEE celler eller søm synlige.

Tabel 1: Mean Fusion Score (MFS) skala (Kang og Svoboda, 2002). Beregn scores for hver ganen for den forreste (§§ 1-150), midterste (§§ 150-300) og posterior (afsnit 300-450). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen i denne artikel giver en metode til at dissekere palatinalt hylder fra embryoner på embryonale dag 13.5. Palatal hylder fra musefostre blev dyrket i et serumfrit dyrkningsmedier i en atmosfære af 95% O 2 5% CO2 ved 37 ° C. Vellykket palatal dissektion er kritisk afhængig af flere faktorer på hvert trin i proceduren fra embryonale tidspunktet for aflivet mus til færdiggørelsen af ​​kulturen. En af de vigtigste faktorer, der påvirker palatal fusion er den tid, det tager at starte orgel kultur; embryoner skal være på embryonisk dag 13.5 de sekundære gane hylderne er vandrette, men er ikke begyndt at fusionere (figur 1).

Et andet kritisk punkt under proceduren er eksteriorisering af embryoner fra blommesækken. Dette trin kræver stor omhu for at forhindre skader på ansigtet strukturer. Når fosteret er fjernet fra vej, er hovedet fjernet frakroppen og placeret i en petriskål, der skal ses med et stereomikroskop med fiberoptisk belysning fra begge sider. Underkæbe og tungen fjernes, udsætter ganen. Hjernen og resterende væv fjernes i øjenhøjde. På dette punkt er det vigtigt at overveje epithellaget omkring hylderne. Det er nødvendigt at manipulere væv meget nøje for at holde integriteten af ​​disse celler. Epitelceller er ansvarlige for adhærens og dannelsen af ​​MES.

Hver dissekeret ganen vendes mundtlig nedad for at rense enhver brusk fra næseskillevæggen. Dette væv er på den forreste side af ganen og synes hvidere og mere kondenseret. Palatal hylder fri af uønsket væv flyttes til en kultur skål og anbragt oven på filtermembranen. Positionen af ​​hylderne kontrolleres igen under stereo dissektionsmikroskop. De skal skubbes sammen for at tillade vedhæftning og videre palatal fusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics