Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Gli studi di sviluppo palato sono motivate dalla incidenza di palatoschisi, un difetto di nascita che impone un onere sanitario enorme e può lasciare deturpazione duratura. Si dimostra qui una tecnica per scaffali cultura palatali che possono essere utilizzati per studiare diverse vie di segnalazione coinvolti nello sviluppo del palato e fusione.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Labio-palatoschisi sono tra i più comuni di tutti i difetti di nascita. Le forme secondarie palato dagli scaffali mesenchimali coperti di epitelio che aderisce a formare la linea di giunzione linea mediana epiteliale (MES). Le teorie suggeriscono che le cellule MES seguono una epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), l'apoptosi e la migrazione, per un palato fuso 1. Completa disintegrazione delle MES è la fase finale di essenziale palatale confluenza con circostante cellule mesenchimali. Forniamo un metodo per la cultura organo palato. Il protocollo sviluppato in vitro permette lo studio dei processi biologici e molecolari durante la fusione. Le applicazioni di questa tecnica sono numerosi, incluse le risposte di valutazione agli agenti chimici esogeni, effetti di fattori di regolazione e di crescita e proteine ​​specifiche. Cultura organo palatale ha una serie di vantaggi tra cui manipolazione a diversi stadi di sviluppo che non è possibile utilizzare in studi in vivo.

Introduction

Schisi oro-facciali sono i difetti di nascita cranio-facciali più predominanti. Inoltre, prendendo in considerazione tutti i possibili difetti cranio-facciali, questi sono i seconda anomalia nascita più comune nei neonati 2. Labbro leporino si verificano in circa 1 ogni 700 nascite negli Stati Uniti (US) ogni anno, l'incidenza di palatoschisi è pari a 475 bambini nati con labbro leporino al mese o 15 bambini con crepacci al giorno 3. Circa l'1% dei bambini nati in tutto il mondo ogni anno mostra una qualche forma di dismorfologia cranio-facciale.

Clefts del palato e il labbro bisogno di una procedura molto costosa e complicata, con implicazioni permanente per i pazienti che hanno questa anomalia. Il costo stimato per ogni paziente con schisi orale è di circa 100.000 $ 4. Il trattamento di un paziente con labiopalatoschisi richiede un team di medici, tra cui cranio-facciali, chirurghi otorinolaringoiatri, genetisti, anestesisti,discorso in lingua patologi, nutrizionisti, ortodontisti, protesisti, psicologi, neurochirurghi, e oftalmologi.

Nel palatogenesis, il palato secondario si pone come escrescenze accoppiati, che inizialmente si sviluppano verticalmente e subiscono elevazione mensola palatale sopra il dorso della lingua. A seguito di elevazione, gli scaffali palatali appaiati crescono verso la linea mediana (a E14.5 -E15 nei topi e negli esseri umani settimana 9). L'epitelio bordo mediale (MEE), che copre la punta mensola aderisce formando la cucitura linea mediana epiteliale.

Segue la transizione epitelio mesenchimale e / o apoptosi consentire mesenchimali confluenza. Adesione di opporsi MEE è un evento essenziale la cui alterazione provoca palatoschisi. Tuttavia, solo pochi studi hanno esaminato l'adesione iniziale dei ripiani palatali 5. Le forme palato duro di differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti. Lo sviluppo anormale del palato in grado di produrre cleft palati con o senza coinvolgimento del labbro.

Tecniche di coltura di organi palato erano stati utilizzati ampiamente per molti laboratori nel corso degli ultimi 30 anni 6,7.

In questo protocollo si descrive in dettaglio un metodo di dissezione palatale e della cultura d'organo statica. Il vantaggio di una cultura organo immobile è che permette scaffali palatali di fondersi. Questa tecnica è stata utilizzata con successo nel nostro laboratorio per molti di fusione e di segnalazione esperimenti 8,9. Tuttavia l'applicazione della tecnica è vasto e può essere utilizzato ogni volta che è richiesto sistema di coltura organo statico, compresa la valutazione della risposta agli agenti chimici esogeni, gli effetti dei fattori di crescita regolamentazioni di vari percorsi e proteine ​​specifiche.

Figura 1
Figura 1. Topo Palatogenesis. Stadi di sviluppo del palato topi. (BF) ele Scansionemicrografie CTRON (SEM) del palato secondario, a volte sviluppo rappresentative. Le frecce rosse indicano: la parte iniziale di palatale adesione e fusione. Frecce gialle: punto per lo spazio tra i palati primarie e secondarie che spariranno dopo la fusione (ristampato da Kaufman 11 con il permesso di PLoS One).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui l'approvazione preliminare da parte del Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso locale.

1. Preparazione di dissezione Strumenti e cultura dei media

  1. Prelavaggio tutti gli strumenti da utilizzare in dissezione con 3% di perossido di idrogeno e quindi in autoclave a 121 ° C per 20 min. Filtro mezzi BGJb con soluzione antibiotica e antimicotica usando un filtro pori di dimensioni di 0,22 micron con aspirazione di vuoto in una cappa.

2. Preparazione di apparecchiature Cultura

  1. Tagliare filtri a membrana di policarbonato che sosterranno gli organi palatali in piccoli triangoli, spruzzare con il 70% di alcol e lasciare asciugare. Preparare Centro-Well Culture Organ piatto (60x15 mm) inserendo una griglia pulito e sterilizzato equilatero triangolare fili (20 mm) sopra la piastra di coltura organo. Quindi riempire il pozzo con 1 ml di BGJB mezzi di coltura. NOTA: il materiale dovrebbe essere sufficiente a raggiungere il livello della griglia senza immergere il palato. Posizionare i filtri a membrana, lato lucido verso il basso, sulla parte superiore della griglia (3-4 membrane per griglia) .Depending all'esperimento, trattamento (proteine, anticorpi o inibitori) possono essere aggiunti ai media

3. mouse embrioni Raccolta e preparazione per la Cultura

  1. Per ottenere wild type embrioni di topo, uso cronometrato 13.5 incinta CD-1 topo background genetico sforzo. Pulire l'area dissezione con il 70% di etanolo.
    NOTA: Altri ceppi di topi possono essere usati. Preferiamo topi CD-1 a causa del numero più grande lettiera.
  2. Euthanize topi in gravidanza a E13.5 DPC (giorni dopo il coito) con il 5% isoflurano seguita da dislocazione cervicale per assicurare la morte utilizzando protocolli approvati.
  3. Spray etanolo al 70% sulla superficie ventrale addominale per evitare che il bastone capelli addominale agli strumenti. Quindi aprire la cavità addominale ventraleutilizzando un spigolo smussato forbici operativi e pinze micro-dissezione per individuare l'utero. Utilizzando le pinze, sollevare l'intero utero e separarlo dal corpo tagliando al corpo uterino e alle punte delle corna uterine con una luce forbici operativi.
  4. Posizionare l'utero su un tovagliolo di carta pulito sul ghiaccio (Secondo la guida protocollo per la cura e l'uso di animali da laboratorio). Coprire l'utero con un altro tovagliolo di carta pulito per evitare contaminazioni. Sterilizzare gli strumenti utilizzando etanolo al 70% spray prima di utilizzare ulteriormente. L'utero e gli embrioni possono essere trasportati al laboratorio in ghiaccio.
  5. In una cappa a flusso laminare aperto, fare attenzione una piccola apertura nel sacco vitellino con le forbici affilate operativi-smussato e pinze micro-dissezione. Rendere l'apertura più ampia e quindi spingere delicatamente per esteriorizzare l'embrione dal sacco vitellino.
  6. Trasferire immediatamente gli embrioni di una capsula di Petri con freddo tampone fosfato Saline 1X (PBS) pH 7,4. Per assicurare la corretta fase, exammina dell'embrione sotto un microscopio da dissezione per il corpo, dimensione della testa e degli arti morfologia.
    NOTA: Gli embrioni che non sono in fase di sviluppo destra non vengono utilizzati per l'esperimento.

Figura 2
Figura 2. Arto Bud Morfologia. La parte anteriore e arti posteriori sono controllati per il grado di cinghia rientro tra le cifre. A E13.5, tutte le condensazioni cifre sono importanti, con il nastro e rientranze distale tra le cifre che appaiono molto distinto. Le cifre posteriori sono alle spalle da una mezza giornata 12 Riga superiore:. Zampa anteriore, inferiore fila: arti posteriori.

4. Palate Dissection

  1. Collocare un embrione alla volta in una capsula di Petri con PBS al microscopio da dissezione. Utilizzo di forbicine e pinzette dissezione separare la testa dal corpo degli embrioni.
  2. Tenendo attentamente il cranio del mouse sopra il livello degli occhi con una pinza (evitandoil processo mascellare) fare due incisioni su entrambi i lati della linea del labbro. Quindi rimuovere la mandibola e la lingua. Isolare la regione mascellare processo effettuando un taglio a livello degli occhi e rimuovere il cervello, gli occhi, setto nasale e del tessuto adiacente.

Figura 3
Figura 3. Palato tessuti raccolti da 13,5 embrioni, quando gli scaffali palato erano elevati, ma non in contatto. I ripiani palatali sono stati messi in coltura d'organo su un filtro a livello di interfaccia multimediale ad aria per 72 ore nel modello statico. (A) Livello di dissezione su E13.5 embrione. (B) Blu stelle delimitare aree di tenere il tessuto con una pinza durante la dissezione. (C) Veduta di scaffali palatali sezionato posti su una membrana filtrante trapezoidale. (D) Vista laterale del piatto cultura dopo il posizionamento della palati sezionato e l'aggiunta di coltura.

  1. Posizionare il lato orale palatina e rimuovere il setto nasale e il tessuto circostante, mantenendo il palato primario collegato per aiutarlo a orientarsi da anteriore a posteriore. Utilizzare una spatola cucchiaio e trasferire con molta attenzione gli scaffali palatali (lato nasale giù) per i filtri preparate sulle griglie nei piatti di coltura. NOTA: Regolare il volume dei mezzi di comunicazione per consentire una corretta interfaccia aria-media.
  2. Al microscopio stereo, sezionare il palato primario e utilizzare una pinzetta per posizionare gli scaffali palatali vicini l'uno all'altro. Gli scaffali palatali non fondere se non vengono posti a contatto. Tagliare il filtro a membrana triangolare in cui si trova la parte anteriore del palato. La forma trapezoidale sarà di aiuto nel localizzare la porzione anteriore del palato.
  3. Cultura scaffali singolarmente o con due o tre nello stesso piatto cultura organistica utilizzando BGJb coltura palatali.

5. Ripiani Coltura mouse palatali

  1. Incubare la tissues a 37 ° C in una miscela di gas umidificato (5% di CO 2 e il 95% di aria) per 72 ore, e cambiare il mezzo di ogni 24 ore.

6. Palate di elaborazione per l'analisi istologica

  1. Fissare i palati dopo 72 ore di cultura con il 4% di formaldeide / tampone fosfato salino O / N a 4 °   C. Poi, delicatamente con una pipetta di trasferimento lavare il tessuto nel piatto cultura con PBS. Avvolgere i palati in un pezzo di salviette di laboratorio e luogo di incorporamento cassette.
    NOTA: Spostamento i palati di salviettine laboratorio prevenire la loro perdita durante il processo di disidratazione.
  2. Disidratare il tessuto seguente 70%, 80% e fino al 100% lavaggi etanolo per 1 ora, seguito dalla procedura paraffina regolare. Per incorporare, posizionare la parte anteriore del palato rivolto verso il vassoio.
  3. Tagliare seriali 6 sezioni micron con l'orientamento coronale da anteriore a posteriore. Una sezione palato completa sarà resa 350-450 sections. Macchiare le sezioni con ematossilina eosina (H & E). 10 Nota ogni 20 ° sezione utilizzando il già descritto medio Fusion Score (MFS) Scala (Tabella 1). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La tecnica può essere applicata a diversi tipi di experiments.The seguente studio è stato progettato per testare l'effetto teratogeno della nicotina in vitro su palatale fusione. Due ceppi di topi sono stati utilizzati per questo esperimento, CD1 e tessuti C57.Palatal stata trattata con concentrazioni di nicotina emisolfato 0,06 e 6 mm. È stato osservato che i modelli di fusione palatali e tempi erano differenti nei due ceppi diversi. Nei topi CD1, mensole palatale del gruppo di controllo hanno continuato fusion in maniera dipendente dal tempo. Tuttavia, nel gruppo trattato nicotina fusione ritardata soprattutto a concentrazione di nicotina 6mm (Figura 4A). Sezioni di Istologia CD1 palati di topo hanno mostrato fusione totale dopo 72 ore nei campioni di controllo. A basse dosi di nicotina scaffali palatali aderiscono ma le cellule epiteliali rimangono dopo 3 giorni di coltura. Scaffali palatali incubate ad alte dosi di nicotina non ha fatto contatto dopo 72 ore di incubazione.

(Figura 4B). Sezioni Istologia di C57 palati topi hanno dimostrato che in gruppi di trattamento una cucitura epiteliale continuo persisteva sulla linea mediana. Fusion è stata osservata solo nel gruppo di controllo a 72 hr.

Abbiamo osservato che la fusione del palato in entrambi i tipi di topi è stata colpita da alte dosi di nicotina. Tuttavia, i palati di C57 sono stati più sensibili alla nicotina. In conclusione, i nostri risultati dimostrano che il background genetico dei topi influenza risposte nicotina nei tessuti palatali.

Figura 4
Due ceppi di topo palato coltivate in presenza di nicotina per 24, 48 o 72 ore. I ceppi di topi hanno risposto alla nicotina in diversi gradi. Tutti i palati esposti ad alte dosi di nicotina (6 mm) non è riuscito a fondere e aveva basso punteggio fusione media (MFS) .Si noti che in 24 ore, nessuno dei palati aveva chiuso e la MFS variava da 1 (scaffali palatali non toccare) 3 (fusione parziale) in tutti i gruppi. Entro 48 ore, molti dei palati di controllo erano parzialmente fuse (punteggi oltre 3) e 72 ore, i palati CD1 erano completamente fuso (punteggio di 5), ma i controlli C57 non era completamente fuso (3.67). (Dati non pubblicati da Maria Serrano e il dottor Kathy Svoboda).

Punto Criteri
1 Non-fusione con nessuna adesione.
2 Non-fusione con una certa adesione apparente.
3 Adesione con alcuni disgregazione degli strati MEE e chiaro parziale mesenchimali confluenza.
4 Fusione completa con alcune tracce di cellule MEE o cucitura rimanente.
5 Fusione completa con nessuna evidenza di cellule MEE o cucitura visibile.

Tabella 1: Media Fusion Score (MFS) Scala (Kang e Svoboda, 2002). Calcolare i punteggi per ogni palato per l'anteriore (sezioni 1-150), medie (sezioni 150-300) e posteriore (sezioni 300-450). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il protocollo in questo articolo fornisce un metodo di dissezione scaffali palatali da embrioni al giorno embrionale 13.5. Ripiani palatali da embrioni di topo sono state coltivate in una coltura privo di siero in una atmosfera di 95% O 2 5% CO 2 a 37 ° C. Dissezione palatale di successo è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento embrionali dei topi sacrificati al completamento della cultura. Uno dei fattori più importanti che influenzano palatale fusione è il tempo necessario per avviare la coltura d'organo; embrioni devono essere al giorno embrionale 13.5 come i ripiani secondari palato sono orizzontali, ma non hanno iniziato a fondere (Figura 1).

Un altro punto critico durante la procedura è l'esteriorizzazione di embrioni dal sacco vitellino. Questo passaggio richiede molta attenzione per evitare danni alle strutture facciali. Una volta che l'embrione viene rimosso dalla sacca, la testa viene rimossa dallail corpo e posto in una capsula di Petri per essere visualizzato con uno stereomicroscopio con illuminazione a fibra ottica da entrambi i lati. La mandibola e la lingua vengono rimossi, esponendo il palato. Il cervello e il tessuto residuo vengono rimossi a livello degli occhi. A questo punto è importante considerare lo strato epiteliale tra gli scaffali. È necessario manipolare il tessuto con molta attenzione per mantenere l'integrità di queste cellule. Le cellule epiteliali sono responsabili per l'aderenza e la formazione dei MES.

Ogni palato sezionato è attivata lato orale verso il basso per pulire qualsiasi cartilagine del setto nasale. Questo tessuto è sul lato anteriore del palato e condensata appare bianca e più. Ripiani palatali libere del tessuto indesiderato vengono spostati in un piatto di coltura e posto sulla parte superiore della membrana filtrante. La posizione dei ripiani viene nuovamente controllata al microscopio da dissezione stereo. Essi devono essere uniti per consentire l'aderenza e più avanti palatale fusione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics