Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Damak gelişimi çalışmalar yarık damak, muazzam bir sağlık yük getirmektedir ve şekil bozukluğuna kalıcı bırakabilirsiniz doğum defekti insidansının motive etmektedir. Biz burada damak gelişimi ve füzyon içinde yer alan farklı sinyal yollarını incelemek için kullanılabilecek kültür damak raflarına bir tekniği göstermek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yarık dudak ve damak, tüm doğum kusurları en yaygın arasındadır. Orta hat epitel dikiş oluşturmak yapışır epitel ile örtülü mezenkimal raflardan ikincil damak formları (MES). Teoriler MES hücreler kaynaşmış damak 1 yaparak, mezenkimal geçiş (EMT), apoptoz ve göç bir epitel izleyin öneririz. MES tam parçalanma mezenkimal hücreler çevredeki damak izdiham son temel aşamasıdır. Bu damak organ kültürü için bir yöntem sağlamaktır. In vitro protokol geliştirilen füzyon sırasında biyolojik ve moleküler proseslerin çalışma sağlar. Bu tekniğin uygulamalar harici kimyasal ajanlara değerlendirilmesi tepkiler, düzenleyici ve büyüme faktörleri ve spesifik proteinlerin etkileri de dahil olmak üzere, çok sayıda bulunmaktadır. Palatal organ kültür in vivo çalışmalar ile mümkün değildir farklı gelişim safhalarında manipülasyon da dahil olmak üzere bir dizi avantaj vardır.

Introduction

Orofasial yarıklar en baskın kraniofasyal doğum kusurları vardır. Ayrıca, göz olası tüm kraniofasial kusurları alarak, bu yenidoğanların 2 en sık görülen ikinci doğum anomalisi bulunmaktadır. Yarık damak, yaklaşık 1 Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) her yıl her 700 doğumda meydana, yarık damak insidansı yarık ayda damak veya gün başına 3 yarıkların 15 çocuklu doğan 475 çocuk eşittir. Çocuklar yaklaşık% 1, her yıl sergilediğini dünyada kraniyofasiyal dismorfoloji çeşit doğdu.

Damak ve dudak yarıkları, bu anomali olan hastalarda yaşam boyu etkileri olan bir çok pahalı ve karmaşık prosedür gerekiyor. Oral yarıklı her hasta için tahmini maliyeti yaklaşık 100.000 $ 4'tür. Dudak ve damak bir hastanın tedavisi, kraniofasial cerrahlar, kulak burun boğaz, genetikçiler, anestezist de dahil olmak üzere doktorların bir ekip gerektirirkonuşma-dil patologlar, beslenme, ortodontist, prostodontist, psikologlar, beyin cerrahları ve göz doktoru.

Palatogenesis, ikincil damak başlangıçta dikey büyümeye ve dil sırtında üzerinde damak raf yüksekliği geçmesi eşleştirilmiş çıkıntılar olarak ortaya çıkar. Yükseklik ardından, eşleştirilmiş damak raflar (insanlarda, farelerde E14.5 -E15 ve haftanın 9) orta hat doğru büyür. Raf ucu kapakları medial kenar epiteli (MEE) orta hat epitel dikişi oluşturan yapışır.

Bu mezenkimal izdiham izin vermek için mezenkimal geçiş ve / veya apoptoza epitelyal izlemektedir. Karşıt MEE yapışması olan değişiklik yarık damak neden temel bir olaydır. Ancak, sadece birkaç çalışma damak raflar 5 başlangıç ​​yapışma araştırdık. Osteoblast içine mezenkimal hücrelerin farklılaşması ile sert damak formları. Clef üretebilir damak anormal gelişimt veya dudak katılımı olmadan damakları.

Damak organ kültürü teknikleri, son 30 yılda 6,7 boyunca birçok laboratuvarlar için yaygın olarak kullanılır olmuştu.

Bu protokolde ayrıntıları damak diseksiyon ve statik organ kültürü bir yöntem açıklanmaktadır. Hareketsiz bir organ kültürü avantajı damak raflar kaynaştırmak olanak sağlamasıdır. Bu teknik pek çok füzyon ve sinyalizasyon deneyler 8,9 bizim laboratuvarda başarıyla kullanılmıştır. Tekniğin kapsamı geniş ve statik organ kültürü sistemi eksojen kimyasal maddelere yanıtların değerlendirilmesi de dahil olmak üzere, gerekli olduğunda kullanılabilir Ancak, farklı yollar ve spesifik proteinlerin düzenleyici büyüme faktörlerinin etkileri.

figür 1
Şekil 1. Fare Palatogenesis. Fareler damağın Gelişim aşamaları. (BF) Tarama eletemsili gelişim zamanlarda ikincil damak cTRON mikrograflan (SEM). Kırmızı oklar: damak yapışma ve füzyon ilk bölümünü gösterir. Sarı oklar: füzyon sonra kaybolur birincil ve ikincil damak arasındaki boşluğa gelin (PLoS biri izni ile Kaufman 11 yeniden basıldı).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Açıklanan tüm prosedürler yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onayı dahil olmak üzere, omurgalı hayvanlar, kullanımına yönelik kurallar ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır.

Kesme Aletleri ve Kültür Medya 1. Hazırlık

  1. Ön-yıkama, bütün araçların% 3 hidrojen peroksit ve 20 dakika boyunca 121 ° C'de daha sonra otoklav ile diseksiyon kullanılmak üzere. Bir kaputu vakum emme ile 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre kullanılarak antibiyotik ve antimikotik çözüm ile edilebilen BGJb ortamı Filtre.

Kültür Ekipman 2. Hazırlık

  1. % 70 alkol ile sprey, küçük üçgenler halinde damak organları destekleyecek polikarbonat membran filtreler kesin ve kurumaya bırakın. Organ kültürü plakası üzerinde temiz ve steril eşkenar üçgen şekilli tel ızgara (20 mm) koyarak Merkez-Well Organ Kültür Dish (60x15 mm) hazırlayın. Sonra B 1 ml kuyu doldurunGJB medya kültür ortamı. NOT: Ortam damak batış olmadan ızgara seviyesine ulaşmak için yeterli olmalıdır. Deneye .Depending ızgara üstündeki zar filtreler, parlak aşağı tarafı, (grid başına 3-4 membranlar) koyun, tedavi (proteinler, antikorlar veya inhibitörleri) ortama eklenebilir

3. Fare Embriyo Toplama ve Kültür Hazırlık

  1. Vahşi tip fare embriyoları elde etmek için, kullanım 13.5 gebe CD-1 fare genetik arka plan gerginlik zaman aşımına. % 70 etanol ile diseksiyon alanı temizleyin.
    Not: Farelerin diğer suşları kullanılabilir. Nedeniyle büyük çöp sayısının CD-1 fareleri tercih ederim.
  2. Onaylı protokolleri kullanarak ölüm sigorta servikal dislokasyon tarafından takip% 5 İsofluranın ile E13.5 DPC (gün çiftleşme sonrası) hamile fareler Euthanize.
  3. Araçlara karın saç sopa önlemek için ventral karın yüzeyi üzerinde% 70 etanol püskürtün. Sonra ventral karın boşluğuna açılırkeskin künt bir işletim makas ve mikro-diseksiyon forseps bir kullanarak rahim bulun. Forseps kullanarak, tüm rahim kaldırın ve rahim vücutta kesilerek ve hafif bir işletim makas ile rahim boynuzları ucunda gövdesinden ayırın.
  4. (Bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı için protokol kılavuzuna göre) buz üzerinde temiz bir kağıt havlu üzerine rahim yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için başka bir temiz kağıt havluyla örtün rahim. Önce daha fazla kullanmak% 70 etanol sprey kullanarak aletleri sterilize edin. Uterus ve embriyolar, buz üzerinde laboratuara nakledilebilir.
  5. Açık laminer akış kaputu, dikkatlice keskin künt bir işletim makas ve mikro diseksiyon forseps kullanarak yumurta kesesinde küçük bir açıklık yapmak. Açılış geniş yapın ve ardından yavaşça yolk kesesi embriyo exteriorize itin.
  6. Soğutulmuş fosfat tamponlu salin 1X (PBS), pH 7.4 içeren bir Petri kabı hemen embriyolar aktarın. Doğru sahne, ex sağlamak içinvücut, kafa büyüklüğü ve uzuv morfolojisi için bir mikroskop altında embriyo amin.
    Not: Doğru gelişim aşamasında olmayan embriyolar deney için kullanılmamaktadır.

Şekil 2,
Şekil 2. Ekstremite Bud Morfoloji. Ön ve arka bacaklarda basamak arasında dokuma girinti derecesi için kontrol edilir. E13.5, tüm haneli kondensasyonları rakamlar arasında dokuma ve distal çentikler çok farklı görünen ile belirgindir. Arka basamaklı yarım gün arkasında 12 Üst sıra:. Ön ayakları, alt sıra: arka bacak.

4. damak Diseksiyon

  1. Mikroskop altında PBS ile bir petri çanağı bir seferde bir embriyo yerleştirin. Kullanımı küçük kesme makası ve cımbız embriyo gövdesinden başını ayırın.
  2. Dikkatle forseps ile göz seviyesinden fare kafatası tutarak (kaçınarakmaksiller işlemi) dudak çizgisinin her iki tarafında iki kesiler yapmak. Ardından mandibula ve dilini çıkarın. Göz hizasında bir kesim yaparak maksiller süreç bölgeyi izole edin ve beyin, gözler, burun septum ve bitişiğindeki dokuyu.

Şekil 3,
Şekil 3. Damak doku damak raflar yüksek olan 13.5 embriyolar, toplanan ancak temas sergiledi. Damak raflar statik modeli 72 st için hava ortam maddesi ara kısmında bulunan bir filtrede bir organ kültür içine yerleştirildi. (A) Düzey E13.5 embriyo üzerinde diseksiyon. (B) Mavi yıldız Diseksiyon sırasında forseps ile doku tutmak için sınır alanları. Bir yamuk filtre zarı üzerine yerleştirilir disseke damak raflar (C) Görünüm. kültür çanak (D) Side view yerleştirildikten sonra Diseke damak ve kültür ortamı eklenmesi.

  1. Posterior anterior gelen yönlendirmek ona yardım bağlı primer damak tutarak, damak ağız tarafı yukarı yerleştirin ve burun septum ve çevresindeki doku kaldırmak. Bir kaşık spatula kullanın ve çok dikkatli bir şekilde kültür yemekleri ızgaraları Hazırlanan filtreler (burun tarafı aşağı) damak raflar aktarın. NOT: Doğru hava medya arayüzü sağlamak için medyanın sesini ayarlayın.
  2. Stereo mikroskop altında birincil damak incelemek ve birbirine yakın damak raflara yerleştirmek için cımbız kullanın. Onlar temas edecek şekilde yerleştirilir değilse damak raflar kaynaştırmak olmaz. Damak ön kısmı bulunan üçgen membran filtre kesin. Yamuk şekli damak ön kısmını lokalize yardımcı olacaktır.
  3. Kültür damak raflar tek tek veya iki veya edilebilen BGJb kültür ortamı kullanarak aynı organ kültür çanak üç ile.

5. Kültürleme Fare damak Raflar

  1. Tissu inkübe72 saat boyunca nemlendirilmiş bir gaz karışımı (% 5 CO2 ve% 95 hava), 37 ° C 'de es ve ortam her 24 saatte değiştirin.

Histolojik Analizi 6. Damak İşleme

  1. / N 4 ° 'de% 4 formaldehit / fosfat tamponlu tuz O ile kültür içinde 72 saat sonra damak saptamak   Daha sonra, yumuşak bir transfer pipeti ile PBS ile kültürü çanağı içinde doku yıkayın. Kasetleri gömme laboratuvar mendil ve yerde bir parça damakları sarın.
    NOT: Laboratuvar mendil içinde damak Ambalaj dehidrasyon sürecinde kendi kaybını önlemek.
  2. 70,% 80,% takip eden ve düzenli parafine gömme prosedürü takiben 1 saat boyunca% 100 etanol yıkamadan kadar doku kurutmak. Gömmek için, tepsiyi bakan damak ön kısmını yerleştirin.
  3. Posterior anterior koronal yönde Seri 6 mikron bölümleri kesin. Tam bir bölüm, damak 350-450 SECTI verecektirons. Hematoksilen ve eozin (H & E). 10 Skor daha önce tarif Mean Fusion skoru kullanılarak her 20 inci bölümü (MFS) Ölçek (Tablo 1) bölümleri Leke. 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekniği experiments.The Aşağıdaki çalışma farklı uygulanabilir damak füzyon üzerinde in vitro nikotin teratojenik etkisini test etmek için tasarlanmıştır. Farelerin iki suş Bu deney için kullanılmıştır, CD1 ve C57.Palatal dokusu nikotin hemisülfatın 0.06 6 mM konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Bu damak füzyon desen ve zamanlama iki farklı suşları farklı olduğu görülmüştür. CD1 fareleri, kontrol grubundan damak raflar zamana bağlı bir şekilde füzyon devam etmiştir. Bununla birlikte, özellikle de 6 mM nikotin konsantrasyonu (Şekil 4A) ile muamele edilen grup, nikotin geciktirilmiş füzyon. CD1 fare damak Histoloji bölümleri kontrol örneklerinde 72 saat sonra, toplam füzyon gösterdi. Nikotin alt dozlarda damak raflar bağlı ancak epitelyal hücreler kültür içinde 3 gün sonra kalır. Nikotinin yüksek dozlarda kuluçkaya damak raflar inkübasyon 72 saat sonra temas etmedi.

(Şekil 4B) süreyle, nikotin 0,6 mM konsantrasyonunda kuluçkalanmıştır numuneler ile karşılaştırıldığında 48 saat süre ile inkübe edildi, ancak C57 farelerinde palatinal rafları 6 mM konsantrasyonunda daha yüksek puan saptandı. C57 fareler damak Histoloji bölümleri tedavi gruplarında sürekli epitel dikiş orta hatta devam ettiğini göstermiştir. Fusion 72 saatte kontrol grubunda sadece gözlendi.

Bu farelerin her iki tür damak bu füzyon nikotin yüksek dozlarda etkili olmuştur görülmektedir. Ancak, C57 den damak nikotine daha mantıklı idi. Sonuç olarak, sonuçlar farelerin genetik arka damak dokularda nikotin yanıtları etkilediğini göstermektedir.

Şekil 4,
4. İki 24 nikotin mevcudiyetinde kültürlenmiş fare damak soyları, 48 ya da 72 saat. Fare soyları, farklı derecelerde nikotin verdi. Nikotin yüksek doz (6 mM) maruz Tüm damak kaynaştırmak başarısız ve 24 saat sonra, damak hiçbiri kapalı olduğunu, düşük ortalama füzyon skoru (MFS) çıkan sonuçlardan vardı ve MFS (damak raflar dokunmadan değil) 1 arasında değişmektedir Tüm gruplarda 3 (kısmi füzyon) için. 48 saat tarafından kontrol damak birçok kısmen (3 üzerinde puan) kaynaştığını ve 72. saatte, CD1 damak tamamen (5 puan) erimiş, ancak C57 denetimleri tamamen (3.67) sigortalı değildi. (Maria Serrano ve Dr Kathy Svoboda gelen Yayınlanmamış veriler).

Gol Kriterler
1 Hiçbir yapışma olmayan füzyon.
2 Bazı belirgin yapışma olmayan füzyon.
3 Bazı MEE katmanları dağılması ve net kısmi mezenkimal izdiham ile yapışma.
4 MEE hücreleri veya dikiş kalan bazı izleri ile komple füzyon.
5 MEE hücreleri veya dikiş görünür hiçbir kanıt ile komple füzyon.

Tablo 1: Ortalama Fusion Skoru (MFS) ölçeği (Kang ve Svoboda, 2002). Anterior her damak için puanlarını hesaplamak (bölümler 1-150), orta (150-300 bölümler) ve posterior (bölümler 300-450). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede protokolü embriyonik gün 13,5 olarak embriyolardan damak raflar kesme için bir yöntem sağlar. Fare embriyosu Palatal raflar 37 ° C 'de 95% O 2,% 5 CO2 atmosferi içinde serumsuz kültür ortamı içinde kültürlenmiştir. Başarılı damak diseksiyonu kültürünün tamamlanmasına ötenazi farelerin embriyonik zaman işlem sırasında her adımda birçok faktöre kritik bağlıdır. Damak füzyon etkileyen en önemli faktörlerden biri, organ kültürü başlatmak için harcanan zaman olduğu; Embriyolar embriyonik gün 13.5 ikincil damak raflar yatay olarak olması gerekir, ama (Şekil 1) kaynaştırmak için başlamadım.

İşlem sırasında bir başka kritik nokta yumurta sarısının embriyoların dışına alınmasıdır. Bu adım, yüz yapılarına zarar görmesini önlemek için büyük dikkat gerektirir. Embriyo kesesi çıkarıldıktan sonra, kafa kaldırılırbir petri kabına yerleştirilir gövde ve her iki taraftan fiber optik aydınlatma ile, bir stereomikroskop ile görülebilmesini. Mandibula ve dil damak açığa çıkarılır. Beyin ve artık doku göz hizasına kaldırılır. Bu noktada raflarda etrafında epitel tabakası dikkate almak önemlidir. Bu hücrelerin bütünlüğünü korumak için çok dikkatli bir şekilde doku işlemek için gereklidir. Epitel hücreleri MES yapışması ve oluşumu sorumludur.

Her disseke damak nazal septum herhangi kıkırdak temizlemek için aşağı ağız tarafı açıktır. Bu doku damak ön tarafında ve beyaz ve daha yoğun görünür. Istenmeyen dokuların serbest Palatal raflar bir kültür kabı taşındı ve filtre zarı üzerine yerleştirilir. Rafların pozisyon stereo mikroskop altında tekrar kontrol edilir. Onlar damak füzyon tutunmayı ve daha izin itti gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics