방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Immunology and Infection

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Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

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Abstract

Protocol

배양기 항생제 1. 제조, 및 2- [2- 니트로 -4- (트리 플루오로 메틸) 벤조일] -1,3- 시클로 헥산 디온 (NTBC)

  1. 적절한 볼륨으로 LB 액체 배지 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 %의 NaCl의 H 2 O)과 분취 액을 만든다. 오토 클레이브 소독. 실온에서 보관하십시오.
  2. 100 ㎖ LB 한천 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 % 염화나트륨, H 2 O 1.5 % 한천) 250 mL의 플라스크를 만든다. 실온에서 오토 클레이브 및 저장에 의해 소독. 한천 플레이트에 쏟아져 전에 용융되어 있는지 확인합니다.
    주 : 4 판을 수득한다 LB 한천 100 ㎖을 함유하는 플라스크. LB 한천의 양이 분석에 필요한 플레이트의 수에 대응하도록 변경 될 수있다.
  3. (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 mM의 KH 2 PO 4) (16) PBS를 확인합니다. 실온에서 오토 클레이브 또는 여과 및 저장에 의해 소독.
  4. 겐타 마이신에 대한 항생제 재고 솔루션을 준비, 카나마이신,D 토 브라 마이신.
    1. 피에 대한 적절한 항생제 재고 농도를 준비 100 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신 30 ㎎ / ㎖의 카나마이신 및 10 ㎎ / ㎖의 토 브라 마이신을 함유 루기 노자 균주. 4 ° C에서 물 필터 소독 (0.2 μm의)와 저장소에 항생제를 녹인다. 연구 박테리아에 따라 항생제 농도를 변경합니다.
  5. NTBC 재고 솔루션을 준비합니다. DMSO 400 μL에 NTBC 10 mg을 녹이고. 이것은 75.9 mM의 NTBC의 농도를 산출한다. -20 ° C에서 보관 NTBC 스톡 솔루션을 제공합니다. 실온에서 해동 용액은 필요에 따라.
    참고 : NTBC의 다른 소스는 용해도의 차이가 있습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 NTBC을 용해 단계 1.5 따라서를 조정하는 적절한 차량을 결정합니다.

2. 세균 균주의 NTBC 적정의를

  1. 균주의 설정 하룻밤 문화를 테스트합니다. 2 ㎖의 LB 배지에 16 × 150mm 시험관 추가S (주 당 하나) 및 각 변형에서 1 절연 식민지 접종. 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기에 통기로 37 ℃에서 밤새 배양한다.
  2. 다음 날, LB 배지에 NTBC의 적정을 준비합니다. 다른 균주 NTBC에 대한 민감도에 차이가 있기 때문에 0 ~ 900 μm의 NTBC에 초기 범위를 사용합니다.
    1. 변형 당 4 ~ 5 시험관 (16 × 150mm)에 1 ㎖의 LB 배지를 추가합니다.
    2. 농도 범위에서 시험관 (16 × 150mm)에 NTBC 스톡 용액 (75.9 mm)를 추가한다. LB 액체 배지 1 ㎖에 추가 NTBC 농도 및 해당 재고 수량은 표 1을 참조하십시오.
  3. 하룻밤 문화의 OD 600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin 제거하기 위해 OD 600 판독을 복용하기 전에 문화를 씻으십시오.
    1. 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. 뜨는 및 느슨하게 펠렛 세포를 제거micropipettor 및 1 ml의 (LB)에 고체 세포 펠렛을 재현 탁
  4. OD 600 0.05 적정 튜브를 접종. 튜브에 접종하는 데 필요한 세척하고 배양의 양을 계산한다.
    참고 : 존재하지 않아야 pyomelanin 때문에 예방 접종에 대한 세척 문화를 사용합니다.
  5. 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 약 24 시간 동안 적정 튜브 부화.
  6. 적정 튜브 사진 및 MIC 및 산화 스트레스 분석에 사용할 NTBC의 양을 결정하기 위해 내부 및 균주간에 색소 생산을 비교한다. 무 세포 배양 상층 액에서 pyomelanin의 양을 결정하고 세포 밀도를 결정하기 위해 600 OD 판독을 사용한다.
    주 : 세포 배양 상청액에서 pyomelanin OD 600의 비율로 처리 후 NTBC pyomelanin 생산에서의 차이를 정량화하기 위해 계산 될 수있다.

3. 항생제 최소 Inhibi96 웰 플레이트에 토리 농도 (MIC) 분석

  1. 균주의 설정 하룻밤 문화와 NTBC없이 LB에서 시험한다.
    주 :이 프로토콜은 300 μM NTBC의 대표적인 레벨을 사용하여 설명한다. 사용될 NTBC의 적절한 수준은 단계 260에서 결정된다.
    1. 2 ml의 (LB) 300 μm의 NTBC 추가 더 NTBC 조건에 대해 2 ml의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가합니다.
    2. 멸균 이쑤시개를 사용하여 박테리아의 하나 고립 된 식민지와 튜브를 접종. NTBC 하나의 문화와 각 변형에 대한 NTBC없이 하나의 문화가 될 것입니다. 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 밤새 배양한다.
  2. 다음 날, MIC 분석을 설정하는 LB + NTBC 및 LB + DMSO 마스터 솔루션을합니다. 접종 물이 추가 될 때,이 600 μM의 농도로 추가하기 NTBC 300 μM의 최종 농도를 산출 두 배 희석한다.
    1. 하나 antibi을 테스트하려면하나의 변형, 2 ㎖의 LB 600 μm의 NTBC을 추가하고 NTBC 마스터 솔루션을 만들기 위해 혼합에 대한 귀의. 2 ㎖의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가하고 더 NTBC 마스터 솔루션을하지 않습니다 섞는다. 항생제 원액을 만들뿐만 아니라 96 웰 플레이트에서 희석 시리즈를 설정하는 이러한 솔루션을 사용한다.
      참고 : 마스터 용액 제형은 피펫 오류를 설명하는 별도의 솔루션을 얻을 것입니다. 시험 균주의 항생제와 수에 따라서 필요에 따라 마스터 솔루션은 상하 또는 축소 될 수있다.
  3. LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션의 항생제 솔루션을 준비합니다.
    참고 :이 솔루션의 항생제 농도가 두 배 최종 원하는 농도이어야한다. 충분한 용액을 96 웰 플레이트에 웰에 네 100 μl를 전송해야한다.
    1. 겐타 마이신 + 64 ㎍ / ml의에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 겐타 마이신 (450)의 콘텐츠 0.288 μL (100 ㎎ / ㎖)을 추가하고,이 용액을 만드는μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션입니다.
      참고 : P.에 대한 겐타 마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1는 32 μg의 / ㎖이다.
    2. 카나마이신 + 256 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 확인하십시오. 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션 카나마이신 주식의 3.84 μL (30 ㎎ / ㎖)를 추가,이 솔루션을 확인합니다.
      참고 : P.에 대한 카나마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1 128 μg의 / ㎖이다.
    3. 토 브라 마이신 + 8 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션에 토 브라 마이신 주식의 0.36 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
      참고 : P. 들어 aeruginosa의 PAO1, 토 브라 마이신의 최대 농도는 4 μg의 / ㎖이다.
      주 : 박테리아 시험되어야하는 항생제 농도가 조절 될 수있다.
  4. 96 웰 플레이트에서 네 개의 우물에 각각 2 배 항생제 용액 100 μl를 추가합니다. exampl에 대한 행 A의 이러한 솔루션을 배치즉, 젠타 A4 통해 A1에 배치해야 카나마이신을 통해 A8 A5에 배치되어야하고, 토 브라 마이신을 통해 A12 A9에 배치되어야한다. 설정 96 웰 플레이트의 그림에 대한 그림 1A를 참조하십시오.
    주 : 다중 항생제 한 플레이트에서 시험 할 수 있지만, 단지 하나의 변형은 다른 균주에서 교차 오염의 가능성을 제거하기 위해 접시 당 테스트되어야한다.
  5. 96 웰 플레이트의 H​​를 통해 행 B에 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액 50 μl를 추가합니다. 그 하나의 판을 확인 LB + NTBC이고 하나 플레이트 LB + DMSO입니다. 그림 1A를 참조하십시오.
    1. LB + NTBC에서 항생제에 대한 LB + NTBC을 사용합니다. LB + DMSO의 항생제에 대한 LB + DMSO를 사용합니다.
  6. micropipettor가 피펫 팁을 변경, B를 믹스에게 솔루션을 행하기 위해 행에서 용액 50 μl를 전송하여 항생제의 두 배 연속 희석을 수행하여, 및 행 (B)에서 용액 50 μl를 전송하기위한 C. 반복을 행합니다 remainiNG 행. 행 G 희석 한 후, 그 행과 폐기의 용액 50 μl를 제거합니다. 박테리아 성장을위한 항생제 컨트롤로 행 (H)를 사용합니다. 그림 1B를 참조하십시오.
    참고 : G를 통해 각각의 잘 행은 지금 배에서 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 항생제의 50 μL 최종 원하는 농도가 포함되어 있습니다. 행 H없이 항생제로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO가 포함되어 있습니다.
  7. 하룻밤 문화의 OD 600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin을 제거하기 위해 OD 600 판독을 복용하기 전에 모든 문화를 씻으십시오.
    1. 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. micropipettor으로 뜨는을 제거하고 1 ㎖의 (LB)에있는 세포 펠렛을 resuspend
  8. (LB)에서 2.75x10 5 CFU / ㎖로 하룻밤 문화를 희석
    참고 : 하나의 OD 600 단위 (P)에 대한 1 × 9 CFU / ㎖의 상응이라고 가정 녹농균. CFU / ㎖ 변환에 OD는 거라고 할 수있다다른 박테리아에 ifferent.
  9. 적절한 웰에 희석 세균 배양의 50 μl를 추가합니다.
    주 : NTBC 성장 DMSO 배양에서 성장 및 배양 NTBC DMSO를 함유하는 웰에 첨가한다 함유 웰에 첨가한다. 그림 1B를 참조하십시오.
    1. 각 균주와 항생제 농도 세 우물에 세균을 추가합니다. 세균 오염에 대한 제어 역할을하는 네 번째 우물에 LB의 50 μl를 추가합니다. 그림 1B를 참조하십시오.
    2. 웰 접종 멀티 채널 micropipettor를 사용한다. 이웃하는 웰의 오염을 방지하기 위해 추가 접종 할 때 팁을 웰의 바닥 근처에 있음을 보장 피펫.
      참고 : 우물에 세균 배양을 추가하면 항생제와 NTBC 농도의 두 배를 희석합니다.
  10. 파라 필름으로 96 웰 플레이트를 덮고, 37 ℃에서 약 24 시간 배양한다. 공기 인큐베이터에서 정적으로 96 웰 플레이트를 품어.
  11. 검사우물에 세균 성장​​을위한 판. MIC는 세균의 성장에는 각 균주의 복제에 대해 세 보지되는 항생제의 최소 농도이다.
    1. 시각적으로 성장 판을 검사하거나 (600) 중독에 플레이트 리더 세트를 사용하여 읽기.

산화 스트레스 응답 4. 스팟 플레이트 분석

  1. 3.1 단계에 설명 된대로 균주의 설정 하룻밤 문화 NTBC와 LB와없이 테스트 할 수 있습니다.
  2. 다음날, 산화성 스트레스로 H 2 O 2를 함유하는 LB 아가 플레이트를 준비한다. 0 내지 1 mM의 H의 범위는 2 O 2 농도는 좋은 출발점이다.
    1. LB 한천 플라스크 용융. 실온에서 약 50 ° C로 냉각 매체.
    2. 원하는 농도로 냉각 된 미디어에 직접 O 2 H 2를 추가합니다. 소용돌이 플라스크 혼합합니다. H의 농도는 표 2를 참조하십시오 2 O 2농축 H 2 O 2의 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 이러한 값은 LB 한천 100 ㎖에 기초한다.
    3. 바로 거품을 제거하기 위해 H 2 O 2 불꽃을 표면을 추가 한 후 번호판을 붓고. 수율은 LB 한천의 100 ㎖ 당 4 판입니다. H 2 O 2 농도가 판을 표시합니다.
    4. 플레이트에서 과도한 수분을 제거하는 30 분 동안 실행 팬 생물학적 흐름 후드에서 발견 판을 놓습니다.
      참고 : 판들이 준비되어 같은 날을 사용합니다. 그렇게하지 ​​않으면 일치하지 않는 데이터가 발생할 수 있습니다.
      참고 사항 : 파라쿼트 같은 산화 스트레스는이 분석에서 H 2 O 2를 대체 할 수 있습니다. 다른 산화성 스트레스에 사용 농도는 H 2 O 2에 사용되는 것과 다를 수있다.
  3. 세척 단계 3.7에 설명 된대로 외경에게 하룻밤 문화 (600)을 측정한다.
  4. 모든 하룻밤 CU의 OD 600 정상화균주의 집합의 가장 낮은 값 ltures 테스트중인. P. 녹농균은 일반적으로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO에 하룻밤 성장 약 2.5의 OD 600이 있습니다.
    1. 1 ml의 총 부피에서 낮은 OD 600 문화를 희석하는 데 필요한 배양의 볼륨을 결정한다. 배양 OD (3)의 600 균주의 세트는 낮은 OD (600)가있는 경우, 예를 들면 2.5 인, 다음의 계산을 수행 (2.5) (1 ㎖)을 = (3) (X). X는 = 0.833 ml의. 문화의 0.833 mL의 미세 원심 분리 튜브에 배치됩니다.
    2. 1 ml의 배양 부피를 가지고 필요 LB + NTBC (300 μM) 또는 DMSO LB +의 양을 계산한다. 단계 4.4.1에서 예를 들어, LB + NTBC 또는 LB + DMSO의 양이 0.167 ㎖ (- 0.833 ml의 문화 1 ml의 총 부피) 될 문화에 추가됩니다. LB + NTBC 및 LB + DMSO의 재고 솔루션은 모든 균주를 희석에 필요한 볼륨 근거로이 희석에 사용합니다.
    3. 문화와 LB + N 믹스텍싱에 의해 TBC 또는 LB + DMSO.
  5. NTBC 또는 DMSO의 일정한 농도의 문화를 유지하기 위해, PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 정규화 하룻밤 문화의 열 배 연속 희석을 수행합니다.
    1. PBS + NTBC과 PBS + DMSO의 재고 솔루션을합니다. 하나의 균주에 대한 희석 한 세트의 경우, 720 ㎕의 총 부피를 수득 300 μM의 NTBC 또는 PBS와 DMSO의 동등한 양을 혼합한다. 테스트 얼마나 많은 균주에 따라 위 또는 아래로이 주식을 확장 할 수 있습니다.
    2. 10-7 연속 희석을 통해 10 -1에 대한 라벨의 microfuge 튜브. 적절한 튜브에 PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 90 μl를 추가합니다. LB + NTBC에서 재배 변종에 대한 PBS + NTBC를 사용하여 LB + DMSO에 성장 균주에 대한 PBS + DMSO를 사용합니다.
    3. 해당 10-1 희석 관에 문화의 10 μl를 추가합니다. 텍싱하여 혼합하고 10 -2 희석 튜브에 10 -1 희석의 10 μl를 전송합니다. 모든 희석이 PERFO 때까지 반복rmed. 희석 사이에 피펫 팁을 변경합니다.
  6. 각 변형에 대한 중복에 LB + H 2 O 2 판에 10-7 희석을 통해 10 -3의 자리는 5 μL. 관광 명소 도금하는 경우 대부분은 적어도 희석 (10-7 -3 10) 희석에서 한 피펫 팁을 사용합니다. 팁 또는 액체가 플레이트에 건조 될 때까지 판을 기울이지 마십시오.
  7. 변형에 따라 37 ° C (공기 인큐베이터)에서 24 ~ 48 시간 동안 접시를 품어.
    참고 : P. 녹농균 PAO1는 배양 24 시간 후 LB에 좋은 크기의 식민지를해야합니다. 그들은 콜로니를 PAO1 대략 동일한 크기를 가질 때까지 균주를 배양한다.
  8. transluminator 위의 CCD 카메라를 사용하여 번호판을 사진. 선택적으로, 같은 크기 대비 및 작물에 대한 사진을 편집 할 수 있습니다. 산화 스트레스에 대한 민감도에서의 변화를 결정하기 위해 각각의 스폿에서의 콜로니 수를 카운트.

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Representative Results

NTBC 적정

NTBC가 경찰에 pyomelanin 생산을 줄일 수 있다면 NTBC 적정을 결정하는 데 사용되었다 애 루기 노사, 또한 제거 또는 추가 분석에 사용하기 위해 생산을 감소 pyomelanin NTBC의 농도를 확인한다. 이 다른 복제에서 생성 pyomelanin의 수준에서 변화 될 수 있지만 일반적인 경향은 일정하게 유지 될 수 있습니다. NTBC 적정 분석은 다른 세균 안료 생산에 영향을 미칠 수있는 다른 화합물을 시험하기 위해 수정 될 수있다. 시각적으로 결정되거나 정량화 될 수 표현형 변화가있는 경우에만, 그러나 작동 할 것이다.

P.의 pyomelanin 생산 균주의 치료 NTBC와 aeruginosa에 안료 생산 (12)의 농도 의존적 감소의 결과. 그림 2하여 보여줍니다 P.의 다른 균주 이영표의 수준으로 표시된 바와 같이 녹농균은 NTBC에 대한 민감도에 차이가멜라닌 생성. NTBC의 높은 농도는 실험실 변형 hmgA : TN (18) (워싱턴 대학의 PAO1의 트랜스포존 돌연변이 라이브러리)에 비해 (다라 프랭크에서 얻은) 임상 분리의 PA1111 17 년에 생산을 pyomelanin 줄이기 위해 필요했다. NTBC 치료와 색소 침착의 변화를 보이지 않았다 pyomelanin [18 (워싱턴 대학의 PAO1의 트랜스포존 돌연변이 라이브러리) 테네시 (캐리 우드에서 얻은) PAO1 및 HPD :]를 생성하지 않는 균주. 생산을 pyomelanin하는 것은 실질적으로 실험실 변형 hmgA 감소 되었기 때문에 :: TN을 그 농도를 (300 μm의 0 μm의 NTBC 비교)을 사용하여 우리는 우리의 분석 300 μm의 NTBC를 사용하기로 결정했다. 본 연구에 사용 된 모든 균주는 15 % 글리세롤에서 -80 ° C에서 저장 하였다.

항생제 MIC가

항생제에 대한 MIC는 여러 가지 방법을 사용하여 시험 할 수있다. 여기에 설명 된 미세 적정 플레이트의 사용 방법을 허용R 항생제 농도 범위를 테스트 및 자원의 최소 사용. 결과를 쉽게 복제 및 분석은 시험 될 유기체의 항생제 감수성의 차이를 허용하도록 변경 될 수있다. 일부 변화는 독립적 인 실험의 사이 볼 수 있으나 경향 상당히 일치한다. 복제 기술은 동일한 MIC를 발휘한다.

표 3은 다른 P. 대한 결과를 나타낸다 aeruginosa의 균주와 NTBC 다양한 아미노 글리코 사이드 항생제없이 치료. 3 개의 독립적 인 콜로니 기재된 방법에 따라 중으로 시험 하였다. MIC가이 세 가지 기술 복제에 박테리아의 성장을 억제 항생제의 가장 낮은 농도로 기록되었다. NTBC 처리 시험 균주에 대한 MIC는 아미노 글리코 사이드에 아무런 영향을 미치지 않았다.

산화 스트레스 자리 플레이트 분석

테스트 산화 스트레스에 대한 현장 플레이트 분석은 reproducibl을 제공합니다H 다른 분석에서 사용 된 것보다 2 O (2)의 낮은 레벨을 사용하여 전자 결과. H 2 O 2가없는 플레이트는 각 균주 희석 시리즈의 정확도를 결정할뿐만 아니라, 응력을 산화하는 세포를 실시하지 않고 콜로니 크기 및 각각의 스폿에서의 콜로니 수를 결정하는 제어 판이다. 첫 번째 자리는 H 2 O 2 무료 매체에 식민지의 셀 수없는 수를 가지는 동안 적절한 희석 시리즈, 마지막 자리는 거의 식민지가 있어야합니다. 희석 시리즈 내의 각각의 지점에서의 콜로니 수의 10 배 차이가 있어야한다. 모든 균주는 시험을 위해, 콜로니의 유사한 숫자는 H 2 O 2 자유 제어 플레이트에 동일한 희석으로 이해되어야한다.

박테리아의 다른 변종은 산화 스트레스에 다른 민감도, 2 O 2 농도가 시험되어야한다 H의 범위를 가질 수있다. H 2 O의 농도를 증가시키는 2 O 2에 의한 산화 스트레스 H에 민감한 가정 각 자리에 식민지의 크기와 숫자의 감소로 표시된 바와 같이 성장의 감소 금액을, 보여 주어야한다. 다른 균주의 성장 특성은 특히 H 2 O 2 농도 하에서 산화 적 스트레스에 대한 감도를 결정하기 위해 비교 될 수있다. 분석은 세균이 산화 스트레스에 노출되는 경우에 단일 균주, 예컨대 NTBC 같은 특정 화합물 또는 시약의 효과를 결정하기 위해 수정 될 수있다. 콜로니는 박테리아 콜로니가 다른 실험 조건 형성 유닛 사이의 % 감소를 결정하기 위해 계산 될 수있다.

그림 3은 경찰의 pyomelanin 및 비 pyomelanin 생산 균주의 자리 플레이트 분석을 보여줍니다 aeruginosa에 함께하고 NTBC없이 처리 및 H 2 O 2에 의한 산화 스트레스에 노출. 명확한 differe가있다산화 스트레스에 대한 민감도 생산하는 박테리아를 pyomelanin에 NCE는 NTBC으로 처리하고, 또한 안료를 생산 할 것들에 비해 pyomelanin 생성하지 않는 박테리아 사이에있다. pyomelanin, 자연적 또는 인해 NTBC 처리에 생산하지 않은 균주는 pyomelanin 생산 균주보다 산화 스트레스에 더 민감했다.

그림 1
그림 1 :. 항생제 MIC 분석 96 웰 플레이트의 도식은 설정 (A)를 시작하는 최고 농도의 2 배 항생제 100 ㎕는 H를 통해 B는 LB + NTBC 또는 LB 중 50 μL로 가득 행 A. 행에 + 항생제없이 DMSO. (B) 두 배 희석액을 각각 웰 배속 원하는 최종 농도로 희석 된 50㎕의 항생제의 결과, G의 행을 통해 수행된다. 행 H는 B 잘 제어 할 수 있습니다항생제없이 acterial 성장. LB 또는 접종 물 50 ㎕의 최종 농도로 항생제 두 배 희석 적절한 웰에 첨가한다. LB는 항생제의 세균 오염에 대한 제어 역할을합니다. GM, 겐타 마이신; km, 카나마이신; 돕, 토 브라 마이신.

그림 2
그림 2 : pyomelanin 생산자와 P.의 비 생산의 NTBC 적정 녹농균. NTBC 실험실 및 임상 pyomelanin 생산자에 용량 의존적으로 생산 pyomelanin 감소하지만 pyomelanin를 생산하지 않는 균주 안료 생산에 아무런 영향을 미치지 않았다. 참조 (12)로부터 수정.

그림 3
그림 3 : 산화 스트레스 반응에 대한 스팟 플레이트 분석 박테리아 균주가 희석했다.동일한 OD 600 (D), 직렬 10 배 희석하고, H 2 O (2)의 여러 농도를 포함하는 LB 플레이트 상에 발견. 0 mM의 H 2 O 2 판의 결과는 다른 균주에 대해 동일한 희석 지점의 각 식민지의 비슷한 숫자로 나타낸 바와 같이 모든 균주가 제대로 희석 ​​된 것으로 나타났다. 균주는 H 2 O 2 농도의 산화 스트레스에 더 민감했다 H 2 O 2 표시를 포함하는 플레이트를 증가시켰다. 이것은 아니오 H 2 O 2 조건뿐만 아니라, 콜로니 크기의 감소에 비해 스폿의 감소 집락에 의해 표시된다. 참조 (12)로부터 수정.

NTBC (μM)의 최종 농도 NTBC (75.9 mM)을 추가 (μL)의 볼륨
0 0
50 </ TD> 0.659
(100) 1.318
(200) 2.64
(300) 3.95
(600) 7.91
(900) 11.86

표 1 :이 표는 다양한 NTBC 농도와 NTBC 주식의 해당 금액을 제공합니다 (LB)에 적정을 설정하는 NTBC 농도는 1 ml의 (LB)에 추가

H의 최종 농도 2 O 2 (MM) 9.79 MH 2 O 2 (30 % 중량)의 양 추가 (μL)
0 0
0.2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

표 2 :. H 2 O 2의 농도는 산화 스트레스 자리 플레이트 분석을 위해 LB 한천에 추가 할이 표는 다양한 H 2 O 2 농도 및 2 O 2 주식은 100 ㎖ LB 한천에 추가 할 집중 H의 해당 금액을 제공합니다.

"L65> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC hmgA : TN - NTBC hmgA : TN + NTBC HPD : TN - NTBC HPD : TN + NTBC PA1111 - NTBC
겐타 마이신 1 0.5 (2) (2) 1 1 0.5 0.5
카나마이신 (16) 8 (32) (32) (32) (32) (16) (16)
토 브라 마이신 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

표 3 : 항생제 MIC 결과 3 개의 독립적 인 식민지 각 STRA에 대한 중으로 시험 하였다.인치 기준 (12)로부터 허가를 재 인쇄.

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Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

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References

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