Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Bereiding van Culture Media, antibiotica en 2- [2-nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexaandion (NTBC)

  1. Maken LB-bouillon (1% trypton, 0,5% gistextract, 0,25% NaCl in H 2 O) en de hoeveelheid in de juiste hoeveelheden. Steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 100 ml LB-agar (1% trypton, 0,5% gistextract, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H 2 O) in 250 ml kolven. Steriliseren in autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de agar wordt gesmolten voordat gieten in platen.
    OPMERKING: Flessen met 100 ml van LB agar platen 4 zal opleveren. De hoeveelheid LB agar kan worden aangepast om te corresponderen met het aantal platen nodig is voor de test.
  3. Voeg PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Steriliseren in autoclaaf of filtratie en bewaar bij kamertemperatuur.
  4. Bereid het antibioticum voorraad oplossingen voor gentamicine, kanamycine, eend tobramycine.
    1. Bereid geschikt antibioticum voorraad concentraties voor P. aeruginosa stammen bevattende 100 mg / ml gentamicine, 30 mg / ml kanamycine en 10 mg / ml tobramycine. Los de antibiotica in water, filter steriliseren (0,2 urn) en bewaar bij 4 ° C. Verander de antibiotica en concentraties, afhankelijk van de onderzochte bacterie.
  5. Bereid de NTBC voorraad oplossingen. Los 10 mg NTBC in 400 ui DMSO. Dit levert een concentratie van 75,9 mM NTBC. Store NTBC voorraad oplossingen bij -20 ° C. Dooi oplossingen op kamertemperatuur indien nodig.
    LET OP: Verschillende bronnen van NTBC hebben verschillen in oplosbaarheid. Bepaal de juiste voertuig om de NTBC op basis van aanbevelingen van de fabrikant op te lossen en aan te passen stap 1.5 dienovereenkomstig.

2. NTBC Titraties bacteriestammen

  1. Opzetten overnacht kweken van de stammen te testen. Voeg 2 ml LB-bouillon bij 16 x 150 mm testbuiss (één per stam) en te enten met 1 geïsoleerde kolonie van elke stam. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder beluchting op een weefselkweek rotator in een luchtincubator.
  2. De volgende dag, voor te bereiden titraties van NTBC in LB bouillon. Gebruik een eerste bereik van 0 tot 900 uM NTBC omdat verschillende stammen verschillen in gevoeligheid voor NTBC.
    1. Voeg 1 ml LB-bouillon 4 tot 5 reageerbuizen (16 x 150 mm) per stam.
    2. Voeg de NTBC voorraadoplossing (75,9 mM) aan de reageerbuizen (16 x 150 mm) bij een reeks concentraties. Zie tabel 1 voor NTBC concentraties en bijbehorende voorraadvolumes te voegen aan 1 ml LB-bouillon.
  3. Meet de OD 600 van de 's nachts culturen. Was culturen alvorens OD 600 metingen op te heffen in de media pyomelanin.
    1. Was de culturen door centrifugeren 1 ml van de cultuur in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant en eventuele losjes gepelleteerde cellen meteen micropipettor en resuspendeer de vaste cel pellet in 1 ml LB.
  4. Te enten titratie buizen bij OD 600 0,05. Bereken de hoeveelheid gewassen kweek nodig om de buizen te inoculeren.
    OPMERKING: Gebruik de gewassen culturen inentingen sinds pyomelanin mag niet aanwezig zijn.
  5. Incubeer de buizen titratie gedurende ongeveer 24 uur bij 37 ° C onder beluchting met een weefselkweek rotator in een luchtincubator.
  6. Fotograferen titratie buizen vergelijk pigment binnen en tussen stammen om de hoeveelheid NTBC vast te gebruiken voor microfoon en oxidatieve stress assays. Gebruik OD 600 metingen om de hoeveelheid pyomelanin bepalen celvrij kweeksupernatant en celdichtheid te bepalen.
    Opmerking: De OD 600 verhouding pyomelanin in kweeksupernatant van cellen kan worden berekend aan verschillen in pyomelanin productie na behandeling met NTBC kwantificeren.

3. Antibiotica Minimum Inhibitory concentratie (MIC) test in 96-well platen

  1. Opzetten overnacht kweken van de stammen te testen in LB met en zonder NTBC.
    NB: Dit protocol wordt beschreven met behulp van de vertegenwoordiger van 300 uM NTBC. Het passend NTBC te gebruiken wordt bepaald in stap 2.6.
    1. Voeg 300 pM NTBC tot 2 ml LB. Voeg een gelijk volume medium (DMSO) met 2 ml LB de niet NTBC toestand.
    2. Met steriele tandenstokers, te enten buizen met een geïsoleerde kolonie van bacteriën. Zal er een cultuur met NTBC en één cultuur zonder NTBC voor elke stam zijn. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder beluchting met een weefselkweek rotator in een luchtincubator.
  2. De volgende dag maken LB + NTBC en LB + DMSO meester oplossingen voor het opzetten van de MIC-test. Voeg NTBC bij een concentratie van 600 uM zoals dit wordt verdund tweevoudige bij entmateriaal wordt toegevoegd, hetgeen een eindconcentratie van 300 pM.
    1. Één antibi testenotic één stam, voeg 600 uM NTBC tot 2 ml LB en meng met de NTBC meester oplossing. Voeg een equivalent volume van het voertuig (DMSO) tot 2 ml LB en meng met de no NTBC meester oplossing. Met deze oplossingen voor het maken van antibiotische voorraadoplossingen en voor het opzetten van de verdunningsreeks in 96-wells platen.
      OPMERKING: De master oplossing formuleringen zullen extra oplossing om rekening te houden pipetteerfouten opleveren. De master oplossingen kan worden vergroot of verkleind zoals vereist afhankelijk van het aantal antibiotica en geteste stammen.
  3. Bereid het antibioticum oplossingen in de LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossingen.
    Opmerking: De antibioticumconcentratie deze oplossingen moeten verdubbelen de uiteindelijke gewenste concentratie. Genoeg oplossing moet worden naar 100 pl over naar vier putjes in een 96-wells plaat.
    1. Bereid gentamicin +/- NTBC voorraad oplossing bij 64 ug / ml. Aan deze oplossing, voeg 0,288 gl gentamicine voorraad (100 mg / ml) tot 450pi LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossing.
      OPMERKING: De maximale concentratie van gentamicine voor P. aeruginosa PAO1 is 32 ug / ml.
    2. Maak de kanamycine +/- NTBC voorraad oplossing bij 256 ug / ml. Aan deze oplossing, voeg 3,84 ul van kanamycine voorraad (30 mg / ml) tot 450 pi LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossingen.
      OPMERKING: De maximale concentratie van kanamycine voor P. aeruginosa PAO1 is 128 ug / ml.
    3. Bereid tobramycine +/- NTBC stamoplossing 8 ug / ml. Aan deze oplossing, voeg 0,36 ul van tobramycine voorraad (10 mg / ml) tot 450 pi LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossingen.
      NB: Voor P. aeruginosa PAO1, de maximale concentratie van tobramycine is 4 ug / ml.
      Opmerking: De antibiotica en concentraties kunnen worden aangepast voor de bacteriën te testen.
  4. Voeg 100 pi van elke 2x antibioticumoplossing vier wells in een 96-wells plaat. Plaats deze oplossingen in rij A. Voor example, gentamicine dient in A1 tot A4 geplaatst moeten kanamycine A5 worden geplaatst via A8 en A9 tobramycine dienen tot A12 worden geplaatst. Zie figuur 1A een schema van een 96-wells plaat ingesteld.
    OPMERKING: meerdere antibiotica kunnen worden getest in één plaat, maar slechts één stam moeten worden getest per plaat om de kans op kruisverontreiniging van andere stammen te elimineren.
  5. Voeg 50 ul van de LB + NTBC of LB + DMSO stamoplossing rijen B tot H van de 96-well plaat. Zorg ervoor dat ene plaat is LB + NTBC en één plaat is LB + DMSO. Zie figuur 1A.
    1. Gebruik LB + NTBC voor de antibiotica in LB + NTBC. Gebruik LB + DMSO voor antibiotica in LB + DMSO.
  6. Met een micropipettor voeren tweevoudige seriële verdunningen van de antibiotica door de overdracht 50 ul van de oplossing van rij tot rij A B. Meng de oplossing, verandert de pipet tips, en breng 50 pl van de oplossing van rij B naar C. Herhaal voor rij de remaining rijen. Na verdunning van rij G, verwijderen 50 ul van de oplossing van die rij en teruggooi. Gebruik rij H als geen antibiotica controle voor de groei van bacteriën. Zie figuur 1B.
    OPMERKING: Elk goed in rijen A tot en met G bevat nu 50 ul van antibiotica in LB + NTBC of LB + DMSO bij 2X de uiteindelijke gewenste concentratie. Rij H bevat LB + NTBC of LB + DMSO zonder antibiotica.
  7. Meet de OD 600 van de 's nachts culturen. Was alle culturen alvorens OD 600 lezingen aan pyomelanin aanwezig in de media te elimineren.
    1. Was de culturen door centrifugeren 1 ml van de cultuur in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant met een micropipettor en resuspendeer de celpellet in 1 ml LB.
  8. Verdun het 's nachts culturen 2.75x10 5 CFU / ml in LB.
    OPMERKING: Stel dat een OD 600-eenheid is het equivalent van 1x10 9 CFU / ml voor P. aeruginosa. OD CFU / ml conversies worden different in andere bacteriën.
  9. Voeg 50 ul van de verdunde bacteriecultuur op de juiste put.
    OPMERKING: culturen gekweekt in NTBC worden toegevoegd aan de putjes die NTBC en culturen gekweekt in DMSO worden toegevoegd aan de putjes met DMSO. Zie figuur 1B.
    1. Bacteriën toe te voegen aan drie putten voor elke stam en antibiotica concentratie. Voeg 50 ul van LB de vierde en om als controle voor bacteriële verontreiniging. Zie figuur 1B.
    2. Gebruik een multi-channel micropipettor aan de putjes inoculeren. Zorg dat pipetpunten vlak bij de bodem van de wells bij het toevoegen inoculum om verontreiniging van aangrenzende wells te voorkomen.
      OPMERKING: bacteriecultuur toevoegen aan de putjes zal verdunnen het antibioticum en NTBC concentraties tweeledig.
  10. Bedek de 96-well platen met parafilm en incubeer ongeveer 24 uur bij 37 ° C. Incubeer 96 putjes statisch, in een lucht incubator.
  11. Onderzoekende platen voor bacteriële groei in de putjes. De MIC is de laagste concentratie antibioticum waarbij geen bacteriegroei wordt waargenomen voor alle drie replicaten van elke stam.
    1. Visueel onderzoek van de plaat voor groei of gelezen met behulp van een plaat lezer ingesteld op OD600.

4. Spot Plate Assay voor oxidatieve stress respons

  1. Opzetten overnacht kweken van de stammen te testen in LB met en zonder NTBC zoals beschreven in stap 3.1.
  2. De volgende dag bereiden LB agarplaten met H 2 O 2 als oxidatieve stressor. Een reeks H 2 O 2 concentraties 0-1 mM is een goed uitgangspunt.
    1. Smelt de LB-agar kolven. Koel media tot ongeveer 50 ° C bij kamertemperatuur.
    2. Voeg H 2 O 2 direct aan het gekoelde medium naar de gewenste concentraties. Werveling flesjes te mengen. Zie tabel 2 voor de concentratie van H 2 O 2en volumes geconcentreerd H 2 O 2 toe te voegen. Deze waarden zijn gebaseerd op 100 ml van LB agar.
    3. Giet platen onmiddellijk na het toevoegen van H 2 O 2 en vlam het oppervlak om luchtbellen te verwijderen. De opbrengst is 4 platen per 100 ml van LB agar. Markeer de platen met de H 2 O 2 concentratie.
    4. Plaats de platen onbedekt in een biologisch stroomkap de ventilator lopen voor 30 minuten om overtollig vocht van de platen te verwijderen.
      OPMERKING: Gebruik de platen op dezelfde dag dat ze zijn voorbereid. Doet u dit niet kan resulteren in inconsistente gegevens.
      OPMERKING: oxidatieve stressoren zoals paraquat te vervangen H 2 O 2 in deze test. De gebruikte concentraties van andere oxidatieve stressoren kan anders zijn dan die voor H 2 O 2 zijn.
  3. Wassen en meten van de OD 600 van de overnachtcultures zoals beschreven in stap 3.7.
  4. Normaliseren van de OD 600 van de nachtelijke cultures op de laagste waarde voor de set van stammen getest. P. aeruginosa heeft in het algemeen een OD600 van ongeveer 2,5 bij nacht gekweekt in LB + NTBC of LB + DMSO.
    1. Bepaal het kweekvolume nodig cultuur aan de laagste OD 600 verdund in een totaal volume van 1 ml. Bijvoorbeeld, als een cultuur heeft een OD 600 van 3 en de laagste OD 600 voor de verzameling van de stammen is 2,5, voert u de volgende berekening: (2.5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml van de cultuur in een microfugebuis worden geplaatst.
    2. Bereken de hoeveelheid LB + NTBC (300 uM) of LB + DMSO nodig cultuurvolume tot 1 ml te brengen. Bij het voorbeeld in stap 4.4.1, de hoeveelheid LB + NTBC of LB + DMSO toegevoegd aan de kweek zou 0,167 ml (1 ml totaal volume - 0,833 ml kweek). Maak voorraadoplossingen van LB + NTBC en LB + DMSO om voor deze verdunningen op basis van het volume nodig voor het verdunnen van alle stammen.
    3. Meng de cultuur en LB + NTBC of LB + DMSO door vortexen.
  5. Culturen handhaven een constante concentratie van NTBC of DMSO, uitvoeren tienvoudige seriële verdunningen van de genormaliseerde overnachtcultures in PBS + NTBC of PBS + DMSO.
    1. Maak voorraad oplossingen van PBS + NTBC en PBS + DMSO. Voor een reeks verdunningen van een stam, meng 300 pM NTBC of een equivalent volume DMSO met PBS tot een totaal volume van 720 pl werd verkregen. Scale deze voorraden boven of naar beneden afhankelijk van het aantal stammen getest.
    2. Label microcentrifuge buizen voor 10 -1 tot 10 -7 seriële verdunningen. Voeg 90 ul van PBS + NTBC of PBS + DMSO aan de geschikte buizen. Gebruik PBS + NTBC voor stammen gekweekt in LB + NTBC en gebruik PBS + DMSO voor stammen gekweekt in LB + DMSO.
    3. Voeg 10 ul van cultuur aan de juiste 10 -1 verdunning buis. Meng door vortexen en breng 10 pl van de 10 -1 verdunning tot de 10 -2 verdunning buis. Herhaal dit totdat alle verdunningen perfo geweestrmed. Wijzigen pipet tips tussen verdunningen.
  6. Spot 5 pl van de 10 tot 10 -3 -7 verdunningen op LB + H 2 O 2 platen in duplo voor elke stam. Gebruik een pipet tip als plekken zijn bedekt van de meeste verdunde tot minst verdunde (10 -7 10 -3). Niet kantelen of kantelen van de plaat tot het vocht is opgedroogd in de plaat.
  7. Incubeer de platen gedurende 24-48 uur bij 37 ° C (lucht incubator), afhankelijk van de stam.
    OPMERKING: P. aeruginosa PAO1 zal ruime kolonies op LB na 24 uur incubatie. Incubeer stammen tot ze kolonies ongeveer even groot als PAO1.
  8. Fotografeer de platen met behulp van een CCD-camera boven een transluminator. Optioneel bewerken van de foto's voor het contrast en de gewassen op dezelfde grootte. Tel het aantal kolonies op elke plek op veranderingen in gevoeligheid voor oxidatieve stress te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC titraties

De NTBC titraties werden gebruikt om te bepalen of NTBC kon pyomelanin productie te verminderen in P. aeruginosa, en ook de concentratie van NTBC elimineert of vermindert pyomelanin produktie voor extra assays identificeren. Er kunnen variaties in het niveau van pyomelanin geproduceerd in verschillende herhalingen, maar algemene trends constant blijft. De NTBC titratie assay kan ook worden aangepast om andere verbindingen die pigment productie in andere bacteriën kunnen beïnvloeden testen. Dit werkt alleen, maar als er een fenotypische verandering die visueel kan worden vastgesteld of gekwantificeerd.

Behandeling van pyomelanin stammen van P. aeruginosa met NTBC resulteerde in een dosisafhankelijke verlaging van pigment productie 12. Figuur 2 toont dat verschillende stammen van P. aeruginosa hebben verschillen in gevoeligheid voor NTBC, zoals aangegeven door niveaus van pyomelanine productie. Hogere concentraties NTBC moesten pyomelanin in het klinische isolaat PA1111 17 (verkregen van Dara Frank) vergeleken laboratoriumstam HMGA :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutant bibliotheek) verlaging van de productiekosten. Stammen die niet produceren pyomelanin [PAO1 (verkregen van Carrie Harwood) en HPD :: tn 18 (Universiteit van Washington PAO1 transposon mutant bibliotheek)] toonde geen verandering in pigmentatie met NTBC behandeling. We besloten om 300 pM NTBC voor onze testen omdat pyomelanin productie aanzienlijk gereduceerd in de laboratoriumstam HMGA :: tn gebruikt die concentratie (vergelijk 300 uM tot 0 uM NTBC). Alle stammen die in deze studie werden bewaard bij -80 ° C in 15% glycerol.

Antibiotica MIC

Antibiotica MIC kan worden getest met behulp van verschillende methoden. De microtiterplaat hier beschreven methode zal het gebruik toestaanr een reeks antibioticumconcentraties testen en gebruik een minimum aan middelen. De resultaten zijn gemakkelijk gerepliceerd en de assay kan worden gewijzigd om verschillen in antibiotische gevoeligheid van het organisme te testen. Wat variatie kan gezien worden tussen onafhankelijke experimenten, maar trends zijn vrij consistent. Technische herhalingen moeten dezelfde MIC vertonen.

Tabel 3 toont de resultaten voor verschillende P. aeruginosa stammen behandeld met en zonder NTBC en verschillende aminoglycoside antibiotica. Drie onafhankelijke kolonies werden in drievoud getest volgens de beschreven werkwijze. MIC's werden geregistreerd als de laagste concentratie antibioticum dat bacteriegroei geremd in alle drie technische replicaten. NTBC behandeling had geen invloed op de aminoglycoside MIC voor de geteste stammen.

Oxidatieve stress spot plaat assay

De plek plaat assay voor het testen van oxidatieve stress geeft reproducible resultaten met behulp lagere H 2 O 2 dan in andere assays. De plaat zonder H 2 O 2 is een stuurplaat om de juistheid van de verdunningsreeks voor elke stam te bepalen, alsmede vast koloniegrootte en het aantal kolonies in elke omgeving zonder het onderwerpen van de cellen aan oxidatieve stress. In een goede verdunning serie, moet de laatste plek weinige kolonies hebben, terwijl de eerste plaats een ontelbaar aantal kolonies zal hebben op de H 2 O 2 vrije media. Er moet een tienvoudige verschil in het aantal kolonies op elke plek binnen een verdunningsreeks zijn. Voor alle geteste stammen moeten vergelijkbare aantallen kolonies te zien in dezelfde verdunning van de H 2 O 2 vrij stuurplaat.

Aangezien verschillende bacteriestammen kunnen verschillende gevoeligheden voor oxidatieve stress, een reeks H 2 O 2 concentraties worden getest. Toenemende concentraties van H 2 O 2 O 2 oxidatieve stress vertonen. De groeikenmerken van verschillende bacteriële stammen kunnen worden vergeleken met de gevoeligheid voor oxidatieve stress te bepalen van een gegeven H 2 O 2 concentratie. De test kan worden aangepast om de effecten van een bepaalde verbinding of reagens zoals NTBC bepalen op één bacteriestam wanneer de bacteriën worden blootgesteld aan oxidatieve stress. Kolonies kunnen worden geteld om het percentage reductie in bacteriële kolonievormende eenheden tussen verschillende experimentele condities te bepalen.

Figuur 3 toont een spot plaattest van pyomelanin en non-pyomelanin stammen van P. aeruginosa behandeld met en zonder NTBC en blootgesteld aan H 2 O 2 oxidatieve stress. Er is een duidelijke difference in gevoeligheid voor oxidatieve stress bij pyomelanin bacteriën behandeld met NTBC en tussen bacteriën die niet produceren pyomelanin vergeleken met die doen produceren pigment. Stammen die niet produceren pyomelanin, hetzij natuurlijk of als gevolg van NTBC behandeling, waren gevoeliger voor oxidatieve stress dan stammen die pyomelanin geproduceerd.

Figuur 1
Figuur 1:. Schema van antibiotica MIC assay 96-wells platen opgezet (A) 100 pi 2x antibiotica van de hoogste uitgangsconcentratie in rij A. rijen B tot H zijn gevuld met 50 ul van ofwel LB + NTBC of LB + DMSO zonder antibiotica. (B) Tweevoudige seriële verdunningen worden uitgevoerd in rijen A tot G, resulterend in 50 pl verdund antibioticum in elk putje 2x de uiteindelijke gewenste concentratie. Rij H is een controle goed voor bacterial groei zonder antibiotica. 50 pi LB of inoculum toegevoegd aan de geschikte putjes, verdunnen antibiotica tweevoudige de eindconcentratie. LB dient als controle voor bacteriële besmetting in het antibiotica. Gm, gentamicine; Km, kanamycine; Tob, tobramycine.

Figuur 2
Figuur 2: NTBC titraties van pyomelanin producenten en niet-producenten van P. aeruginosa. NTBC verminderde pyomelanin productie op een dosis afhankelijke manier in het laboratorium en klinische pyomelanin producenten, maar had geen effect op pigment productie in stammen die geen pyomelanin produceren. Gewijzigd uit referentie 12.

Figuur 3
Figuur 3: Spot plaat test voor oxidatieve stress respons Bacteriestammen waren verdund.d dezelfde OD 600, serieel verdund 10-voudig, en gespot op LB platen met verschillende concentraties H 2 O 2. De 0 mM H 2 O 2 plaat resultaten toonden aan dat alle stammen behoren werden verdund, zoals aangegeven door een vergelijkbaar aantal kolonies in elk van de spots van dezelfde verdunning van verschillende stammen. De platen met H 2 O 2 blijkt dat de stammen waren gevoeliger voor oxidatieve stress de concentratie van H 2 O 2 verhoogd. Dit wordt aangegeven door verminderde aantal kolonies in de vlekken in vergelijking met de niet H 2 O 2 staat, evenals een vermindering van koloniegrootte. Gewijzigd uit referentie 12.

Eindconcentratie van NTBC (uM) Volume van NTBC (75,9 mM) toe te voegen (pl)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11.86

Tabel 1: NTBC concentraties voor het opzetten van titraties in LB. Deze tabel geeft verschillende NTBC concentraties en het overeenkomstige bedrag van NTBC voorraad toe te voegen aan 1 ml LB.

Uiteindelijke concentratie van H 2 O 2 (mM) Hoeveelheid van 9,79 MH 2 O 2 (30% gew) toe te voegen (pl)
0 0
0.2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

Tabel 2:. Concentraties van H 2 O 2 LB agar te voegen voor de oxidatieve stress plaatse plaatassay Deze tabel geeft verschillende H 2 O 2 concentraties en de overeenkomstige hoeveelheid geconcentreerd H 2 O 2 voorraad te voegen aan 100 ml LB agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicin 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
Kanamycine 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramycin 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

Tabel 3: MIC Antibiotic results drie onafhankelijke kolonies werd getest in drievoud voor elke stra.in. Re-bedrukt met toestemming van referentie 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics