Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Immunology and Infection

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Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Preparazione della Cultura Media, antibiotici, e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoile] -1,3-cicloesandione (NTBC)

  1. Rendere brodo LB (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% di NaCl in H 2 O) e aliquota in volumi appropriati. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
  2. Rendere 100 ml LB agar (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H 2 O) in 250 ml beute. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Assicurarsi che l'agar viene fuso prima di versare in piastre.
    NOTA: Boccette contenenti 100 ml di LB agar produrrà 4 piatti. La quantità di LB agar può essere modificato per corrispondere al numero di lastre necessarie per il dosaggio.
  3. Fai la PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilizzare in autoclave o filtrazione e conservare a temperatura ambiente.
  4. Preparare le soluzioni madre di antibiotici per gentamicina, kanamicina, und tobramicina.
    1. Preparare opportune concentrazioni azionari antibiotici per P. aeruginosa ceppi contenenti 100 mg / ml gentamicina, 30 mg / ml di kanamicina, e 10 mg / ml tobramicina. Sciogliere gli antibiotici in acqua, sterilizzare il filtro (0,2 micron), e conservare a 4 ° C. Modificare gli antibiotici e le concentrazioni seconda batterio studiata.
  5. Preparare le soluzioni madre NTBC. Disciogliere 10 mg di NTBC in 400 ml di DMSO. Questo produce una concentrazione di 75,9 NTBC mM. Store Solutions NTBC azionari a -20 ° C. Soluzioni scongelare a temperatura ambiente, se necessario.
    NOTA: diverse fonti di NTBC hanno differenze di solubilità. Determinare il veicolo appropriato per sciogliere il NTBC in base alle raccomandazioni del costruttore e regolare Passo 1.5 di conseguenza.

2. NTBC titolazioni di Ceppi batterici

  1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare. Aggiungere 2 ml di brodo LB a 16 x 150 mm provettas (uno per ceppo) e inoculare con 1 isolato colonia da ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione su un rotatore coltura tissutale in un incubatore dell'aria.
  2. Il giorno seguente, preparare titolazioni di NTBC in LB brodo. Utilizzare una prima serie 0-900 micron NTBC da ceppi diversi hanno differenze nella sensibilità al NTBC.
    1. Aggiungere 1 ml di brodo LB per 4 a 5 provette (16 x 150 mm) per ceppo.
    2. Aggiungere la soluzione di riserva NTBC (75,9 mm) per le provette (16 x 150 mm) in un intervallo di concentrazioni. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di NTBC e corrispondenti volumi delle scorte di aggiungere ad 1 ml di brodo LB.
  3. Misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare le culture prima di OD 600 letture per eliminare pyomelanin presente nei media.
    1. Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante e tutte le cellule senza bloccare in pellet conun micropipettatore e risospendere il pellet cellulare solido in 1 ml LB.
  4. Inoculare tubi di titolazione a OD 600 0.05. Calcolare la quantità di coltura lavato necessari per inoculare le provette.
    NOTA: Utilizzare le culture lavati per vaccinazioni da pyomelanin non dovrebbe essere presente.
  5. Incubare le provette titolazione per circa 24 ore a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell'aria.
  6. Fotografa i tubi di titolazione e confrontare produzione di pigmenti all'interno e tra i ceppi per determinare la quantità di NTBC da utilizzare per MIC e lo stress ossidativo saggi. Utilizzare OD 600 letture per determinare la quantità di pyomelanin in cella libera supernatante di coltura e per determinare la densità cellulare.
    NOTA: Il rapporto di OD 600 pyomelanin nella cultura surnatante in cellule può essere calcolato per quantificare le differenze nella produzione pyomelanin dopo il trattamento con NTBC.

3. antibiotico minima inibizioneConcentrazione tory (MIC) Assay in piastre con 96 pozzetti

  1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC.
    NOTA: Questo protocollo è descritta utilizzando il livello rappresentativo di 300 micron NTBC. Il livello adeguato di NTBC da utilizzare è determinato nel passo 2.6.
    1. Aggiungere 300 micron NTBC a 2 ml LB. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB per la condizione non NTBC.
    2. Utilizzando stuzzicadenti sterili, inoculare provette con uno isolato colonia di batteri. Ci sarà una cultura con NTBC e una cultura senza NTBC per ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell'aria.
  2. Il giorno seguente, fare LB + NTBC e soluzioni maestri LB + DMSO per l'impostazione del test MIC. Aggiungere NTBC ad una concentrazione di 600 mM come questa saranno diluiti due volte quando si aggiunge inoculo, ottenendo una concentrazione finale di 300 mM.
    1. Per provare uno antibiotic per un ceppo, aggiungere 600 micron NTBC a 2 ml di LB e mescolare per rendere la soluzione principale NTBC. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB e mescolare per rendere la soluzione maestro non NTBC. Utilizzare queste soluzioni per la creazione di soluzioni madre di antibiotici, nonché per la creazione di una serie di diluizioni in piastre da 96 pozzetti.
      NOTA: Le formulazioni in soluzione maestri produrrà soluzione in più per tenere conto di errori di pipettamento. Le soluzioni master può essere aumentato o giù come richiesto a seconda del numero di antibiotici e ceppi testati.
  3. Preparare le soluzioni antibiotiche nelle soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
    NOTA: La concentrazione di antibiotico in queste soluzioni dovrebbero essere il doppio della concentrazione finale desiderata. Soluzione abbastanza dovrebbe essere fatto per trasferire 100 ul di quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti.
    1. Preparare gentamicina +/- soluzione madre NTBC a 64 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,288 ml di gentamicina magazzino (100 mg / ml) per 450ul LB + NTBC o soluzione maestro LB + DMSO.
      NOTA: la concentrazione massima di gentamicina per P. aeruginosa PAO1 è 32 mg / ml.
    2. Rendere la kanamicina +/- soluzione di riserva NTBC a 256 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 3,84 ml di kanamicina magazzino (30 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: la concentrazione massima di kanamicina per P. aeruginosa PAO1 è di 128 mg / ml.
    3. Preparare tobramicina +/- soluzione madre NTBC a 8 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,36 ml di tobramicina magazzino (10 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: Per P. aeruginosa PAO1, la massima concentrazione di tobramicina è 4 mg / ml.
      NOTA: Gli antibiotici e le concentrazioni possono essere regolati per i batteri da testare.
  4. Aggiungere 100 ml di ogni soluzione antibiotica 2x a quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti. Mettere queste soluzioni in fila A. Per example, gentamicina deve essere posto in A1 a A4, kanamicina deve essere posto in A5 attraverso A8 e tobramicina deve essere posto in A9 attraverso A12. Vedere Figura 1A per un diagramma di una piastra a 96 pozzetti impostato.
    NOTA: più antibiotici possono essere testati in un piatto, ma solo ceppo devono essere testati per piastra di eliminare il rischio di contaminazione incrociata da altri ceppi.
  5. Aggiungere 50 ml di soluzione di maestro LB + NTBC o LB + DMSO alle righe B attraverso H della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che un piatto è LB + NTBC e un piatto è LB + DMSO. Vedere la Figura 1A.
    1. Utilizzare LB + NTBC per gli antibiotici in LB + NTBC. Utilizzare LB + DMSO per gli antibiotici in LB + DMSO.
  6. Utilizzando un micropipettatore eseguire due diluizioni seriali piega degli antibiotici trasferendo 50 ml di soluzione dalla fila A alla fila B. Mix la soluzione, modificare i puntali, e trasferire 50 ml di soluzione da riga B a remare C. Ripetere l'operazione per il remainirighe ng. Dopo diluizione fila G, rimuovere 50 ml di soluzione da quella riga e scarti. Utilizzare fila H come nessun controllo antibiotico per la crescita batterica. Vedere la Figura 1B.
    NOTA: ogni bene nelle righe da A a G ora contiene 50 ml di antibiotici in LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentrazione finale desiderata. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO con antibiotici.
  7. Misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare tutte le culture prima di OD 600 letture per eliminare pyomelanin presente nei media.
    1. Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante con un micropipettatore e risospendere il pellet cellulare in 1 ml LB.
  8. Diluire le culture durante la notte per 2.75x10 5 CFU / ml in LB.
    NOTA: Si supponga che una OD 600 unità è l'equivalente di 1x10 9 CFU / ml per P. aeruginosa. OD di CFU / ml conversioni può essere different in altri batteri.
  9. Aggiungere 50 ml di coltura batterica diluito nel pozzetto.
    NOTA: Le culture coltivati ​​in NTBC dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti NTBC e culture cresciute in DMSO dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti DMSO. Vedere la Figura 1B.
    1. Aggiungi ai batteri di tre pozzi per ogni ceppo e la concentrazione di antibiotico. Aggiungere 50 ml di LB alla quarta e di agire come un controllo per la contaminazione batterica. Vedere la Figura 1B.
    2. Utilizzare un micropipettatore multicanale per inoculare i pozzi. Assicurarsi che pipetta suggerimenti sono vicino al fondo dei pozzetti quando si aggiunge inoculo per prevenire la contaminazione dei pozzi vicini.
      NOTA: L'aggiunta di coltura batterica ai pozzetti diluire le concentrazioni di antibiotici e NTBC due volte.
  10. Coprire le piastre a 96 pozzetti con parafilm e incubare circa 24 ore a 37 ° C. Incubare le piastre a 96 pozzetti staticamente, in un incubatore dell'aria.
  11. Esaminarele piastre per la crescita batterica nei pozzetti. La MIC è la più bassa concentrazione di antibiotico in cui nessuna crescita batterica è visibile per tutte tre repliche di ciascun ceppo.
    1. Esaminare visivamente la piastra per la crescita o leggere utilizzando un lettore di set piatto di OD 600.

4. Spot Assay Piastra per Stress ossidativo risposta

  1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC come descritto al punto 3.1.
  2. Il giorno successivo, preparare piastre di agar LB contenenti H 2 O 2 come fattore di stress ossidativo. Una gamma di H 2 O 2 concentrazioni da 0 a 1 mm è un buon punto di partenza.
    1. Sciogliere i palloni LB agar. Supporti Raffreddare a circa 50 ° C a temperatura ambiente.
    2. Aggiungere H 2 O 2 direttamente ai media raffreddati alle concentrazioni desiderate. Fiaschi Swirl per mescolare. Vedere la Tabella 2 per le concentrazioni di H 2 O 2e volumi di H 2 O 2 concentrato da aggiungere. Questi valori sono basati su 100 ml di LB agar.
    3. Versare in piastre subito dopo l'aggiunta H 2 O 2 e fiamme la superficie per rimuovere bolle. La resa è di 4 piastre per 100 ml di LB agar. Segnare i piatti con la concentrazione di H 2 O 2.
    4. Posizionare le piastre scoperto in una cappa a flusso biologico con il ventilatore acceso per 30 minuti per rimuovere l'umidità in eccesso dalle piastre.
      NOTA: Utilizzare le lastre lo stesso giorno in cui vengono preparati. In caso contrario si potrebbe causare dati incoerenti.
      NOTA: fattori di stress ossidativo, come il paraquat può essere sostituito per H 2 O 2 in questo saggio. Le concentrazioni utilizzate per altri fattori di stress ossidativi possono variare rispetto a quelli utilizzati per H 2 O 2.
  3. Lavare e misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte come descritto al punto 3.7.
  4. Normalizzare la OD 600 di tutta la cu durante la notteltures al valore più basso per il set di ceppi testati. P. aeruginosa ha generalmente un diametro esterno 600 di circa 2,5 quando cresciuto durante la notte in LB + NTBC o LB + DMSO.
    1. Determinare il volume della cultura necessaria per diluire la coltura al OD più basso 600 in un volume totale di 1 ml. Ad esempio, se una coltura ha un diametro esterno 600 del 3 e l'OD più basso 600 per il set di ceppi è 2.5, eseguire il seguente calcolo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml di coltura saranno collocati in una provetta per microcentrifuga.
    2. Calcolare la quantità di LB + NTBC (300 micron) o LB + DMSO necessaria a portare il volume cultura di 1 ml. Per l'esempio nel passaggio 4.4.1, la quantità di LB + NTBC o LB + DMSO aggiunto alla cultura sarebbe 0.167 ml (1 ml di volume totale - 0.833 ml cultura). Fai soluzioni stock di LB + NTBC e LB + DMSO da utilizzare per queste diluizioni in base al volume necessario per diluire tutti i ceppi.
    3. Mescolare la cultura e LB + NTBC o LB + DMSO nel vortex.
  5. Per mantenere le culture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO, eseguire dieci diluizioni seriali di piegatura delle culture durante la notte normalizzati in PBS + NTBC o PBS + DMSO.
    1. Fai soluzioni stock di PBS + NTBC e PBS + DMSO. Per una serie di diluizioni di un ceppo, mescolare 300 pM NTBC o un volume equivalente di DMSO con PBS per ottenere un volume totale di 720 microlitri. Scala questi stock alto o in basso a seconda di quante ceppi vengono testati.
    2. Tubi Label microcentrifuga per 10 -1 attraverso diluizioni 10 -7 seriali. Aggiungere 90 ml di PBS + NTBC o PBS + DMSO ai tubi appropriati. Usa PBS + NTBC per i ceppi cresciuti in LB + NTBC e utilizzare PBS + DMSO per i ceppi cresciuti in LB + DMSO.
    3. Aggiungere 10 ml di cultura alla competente 10 -1 provetta di diluizione. Mescolare nel vortex e trasferire 10 ml di diluizione 10 -1 al tubo di diluizione 10 -2. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le diluizioni sono stati perfoconfermate. Cambiare puntali tra diluizioni.
  6. Spot 5 ml di 10 -3 attraverso 10 -7 diluizioni su LB + H 2 O 2 piastre in duplicato per ogni ceppo. Utilizzare una punta della pipetta se i punti sono placcati da più diluito al meno diluito (10 -7 a 10 -3). Non ribaltare la piastra fino a quando il liquido si è asciugata nella piastra.
  7. Incubare le piastre per 24-48 ore a 37 ° C (incubatore aria), a seconda del ceppo.
    NOTA: P. aeruginosa PAO1 avrà buone colonie dimensioni su LB dopo 24 ore di incubazione. Incubare ceppi fino colonie hanno approssimativamente la stessa dimensione PAO1.
  8. Fotografare i piatti utilizzando una fotocamera CCD sopra un transluminator. Facoltativamente, modificare le foto per il contrasto e la coltivazione alla stessa dimensione. Contare il numero di colonie in ogni posto per determinare le variazioni di sensibilità allo stress ossidativo.

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Representative Results

Titolazioni NTBC

Le titolazioni NTBC sono stati utilizzati per determinare se NTBC è stata in grado di ridurre la produzione pyomelanin in P. aeruginosa, e anche identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce pyomelanin produzione per uso in test aggiuntivi. Ci possono essere variazioni nei livelli di pyomelanin prodotto in diverse repliche, ma tendenze generali rimanere costante. Il saggio di titolazione NTBC potrebbe anche essere modificato per testare altri composti che possono influenzare la produzione di pigmento in altri batteri. Questo funziona solo, tuttavia, se vi è un cambiamento fenotipico determinabile o quantificato visivamente.

Trattamento di pyomelanin produrre ceppi di P. aeruginosa con NTBC determinato una riduzione dose-dipendente della produzione di pigmento 12. La Figura 2 mostra che diversi ceppi di P. aeruginosa hanno differenze nella sensibilità alla NTBC, come indicato dai livelli di Pyola produzione di melanina. Concentrazioni più elevate di NTBC erano tenuti a ridurre la produzione nella pyomelanin isolato clinico PA1111 17 (ottenuto da Dara Frank) rispetto al ceppo di laboratorio HMGA :: tn 18 (Università di Washington PAO1 trasposoni biblioteca mutante). I ceppi che non producono pyomelanin [PAO1 (ottenuto da Carrie Harwood) e HPD :: tn 18 (Università di Washington PAO1 trasposoni biblioteca mutante)] non ha mostrato alcun cambiamento nella pigmentazione con trattamento NTBC. Abbiamo deciso di utilizzare 300 micron NTBC per i nostri test perché pyomelanin produzione è stata sostanzialmente ridotta nel HMGA ceppo di laboratorio :: tn utilizzando tale concentrazione (confrontare 300 micron a 0 micron NTBC). Tutti i ceppi utilizzati in questo studio sono stati conservati a -80 ° C in 15% glicerolo.

MIC di antibiotici

MIC antibiotici possono essere testati utilizzando diversi metodi. Il metodo micropiastra qui descritto consente l'usor per testare una gamma di concentrazioni di antibiotico ed usare un minimo di risorse. I risultati sono facilmente replicati e il dosaggio può essere modificato per consentire differenze di sensibilità agli antibiotici dell'organismo da testare. Qualche variazione può essere visto tra esperimenti indipendenti, ma le tendenze sono abbastanza consistente. Replicati tecnici dovrebbero presentare lo stesso MIC.

La Tabella 3 mostra i risultati di diverse P. ceppi aeruginosa trattati con e senza NTBC e vari antibiotici aminoglicosidi. Tre colonie indipendenti sono stati testati in triplicato seguendo il metodo descritto. MIC sono state registrate come la concentrazione minima di antibiotico che inibisce la crescita batterica in tutte tre repliche tecniche. Trattamento NTBC ha avuto alcun effetto sui MIC aminoglicosidi per i ceppi testati.

Lo stress ossidativo test piastra posto

Il test Piastra posto per le prove di stress ossidativo dà reproducible risultati utilizzando bassi livelli di H 2 O 2 rispetto a quelli utilizzati in altri test. La piastra senza H 2 O 2 è una piastra di controllo per determinare l'accuratezza della serie di diluizioni per ogni ceppo, nonché determinare le dimensioni delle colonie e numero di colonie in ogni punto senza sottoporre le cellule allo stress ossidativo. In una serie di diluizione, il punto finale dovrebbe avere pochissime colonie, mentre il primo spot avrà una quantità innumerevole di colonie su H 2 O 2 media liberi. Dovrebbe esserci una differenza di dieci volte il numero di colonie in ciascun punto all'interno di una serie di diluizioni. Per tutti i ceppi testati, un numero simile di colonie dovrebbero essere viste nella stessa diluizione al 2 O 2 piastra di controllo gratuito H.

Come diversi ceppi di batteri possono avere diverse sensibilità allo stress ossidativo, una gamma di H 2 O 2 concentrazioni devono essere testati. Concentrazioni crescenti di H 2 O 2 O 2 stress ossidativo indotto. Le caratteristiche di crescita dei diversi ceppi batterici possono essere confrontati per determinare la sensibilità allo stress ossidativo sotto una particolare concentrazione di H 2 O 2. Il dosaggio può essere modificato per determinare gli effetti di un particolare composto o reattivo, come NTBC, su un unico ceppo batterico quando i batteri sono sottoposti a stress ossidativo. Le colonie possono essere contati per determinare la riduzione percentuale in colonia batterica unità formanti tra diverse condizioni sperimentali.

La figura 3 mostra un saggio posto piatto di pyomelanin e non pyomelanin produrre ceppi di P. aeruginosa trattati con e senza NTBC ed esposto ad H 2 O 2 stress ossidativo indotto. C'è una chiara difference nella sensibilità allo stress ossidativo quando pyomelanin batteri che producono sono trattati con NTBC, e anche tra i batteri che non producono pyomelanin rispetto a quelli che producono il pigmento. I ceppi che non producono pyomelanin, naturalmente o causa di trattamento NTBC, erano più sensibili allo stress ossidativo rispetto ai ceppi che hanno prodotto pyomelanin.

Figura 1
Figura 1:. Schema di antibiotico test MIC piastra a 96 ben impostato (A) 100 ml di 2x antibiotici della concentrazione più elevata di partenza sono in fila A. Righe B alla H sono pieni di 50 ml di entrambi LB + NTBC o LB + DMSO senza antibiotici. (B) due diluizioni seriali di piegatura vengono effettuate nelle righe da A a G, con conseguente 50 ml di antibiotico diluito in ogni pozzetto a 2x la concentrazione finale desiderata. Fila H è un controllo bene per bcrescita acterial senza antibiotici. 50 ml di LB o inoculo viene aggiunto ai pozzetti, diluendo gli antibiotici due volte alla concentrazione finale. LB serve come controllo per la contaminazione batterica nei antibiotici. Gm, gentamicina; Km, kanamicina; Tob, tobramicina.

Figura 2
Figura 2: NTBC titolazioni dei produttori pyomelanin e non produttori di P. aeruginosa. NTBC ridotta pyomelanin la produzione in modo dose-dipendente in laboratorio e produttori pyomelanin clinici, ma non ha avuto effetto sulla produzione di pigmento nei ceppi che non producono pyomelanin. Modificato da riferimento 12.

Figura 3
Figura 3: Spot piatto saggio per la risposta allo stress ossidativo ceppi batterici sono stati diluito.d alla stessa OD 600, serial diluito 10 volte, e macchiato su piastre LB contenenti varie concentrazioni di H 2 O 2. I risultati 0 mm H 2 O 2 piastre hanno mostrato che tutti i ceppi sono stati diluiti correttamente, come indicato da un numero simile di colonie in ciascuno dei punti per la stessa diluizione per diversi ceppi. Le piastre contenenti H 2 O 2 mostrano che i ceppi erano più sensibili allo stress ossidativo come la concentrazione di H 2 O 2 è aumentato. Questo è indicato da numeri di colonie diminuito nel macchie rispetto alla no H 2 O 2 condizioni, così come una riduzione delle dimensioni delle colonie. Modificato da riferimento 12.

Concentrazione finale di NTBC (micron) Volume di NTBC (75,9 mm) per aggiungere (ml)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1.318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11.86

Tabella 1: concentrazioni NTBC per la creazione di titolazioni in LB. Questa tabella fornisce diverse concentrazioni NTBC e il corrispondente importo del NTBC magazzino da aggiungere a 1 ml LB.

Concentrazione finale di H 2 O 2 (mM) Quantità di 9,79 MH 2 O 2 (30% in peso) di aggiungere (ml)
0 0
0.2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

Tabella 2:. Le concentrazioni di H 2 O 2 da aggiungere al LB agar per lo stress ossidativo dosaggio posto piatto Questa tabella fornisce vari H 2 O 2 concentrazioni e il corrispondente importo di H concentrato 2 O 2 stock da aggiungere a 100 ml di LB agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicina 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
Kanamicina 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramicina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

Tabella 3: risultati MIC antibiotici Tre colonie indipendenti sono stati testati in triplicato per ogni stra.a. Re-stampato con il permesso di riferimento 12.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

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References

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