Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Immunology and Infection

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Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Preparación de medios de cultivo, antibióticos, y 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC)

  1. Hacer caldo LB (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl en H 2 O) y alícuota en volúmenes apropiados. Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
  2. Hacer 100 ml de LB agar (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar en H 2 O) en matraces de 250 ml. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el agar se derrita antes de verter en placas.
    NOTA: Los frascos que contienen 100 ml de agar LB producirá 4 platos. La cantidad de agar LB puede ser alterado para que se corresponda con el número de placas necesarias para el ensayo.
  3. Hacer PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Esterilizar en autoclave o filtración y se almacena a temperatura ambiente.
  4. Preparar las soluciones madre de antibióticos para la gentamicina, kanamicina, und tobramicina.
    1. Preparar las concentraciones de valores antibióticos apropiados para P. aeruginosa cepas que contienen 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de kanamicina, y 10 mg / ml de tobramicina. Disolver los antibióticos en el agua, esterilizar filtro (0,2 micras), y se almacena a 4 ° C. Alterar los antibióticos y concentraciones dependiendo de la bacteria estudiada.
  5. Preparar las soluciones madre NTBC. Disolver 10 mg de NTBC en 400 l de DMSO. Esto produce una concentración de 75,9 mM NTBC. Tienda soluciones NTBC acciones a -20 ° C. Soluciones Descongelar a temperatura ambiente, según sea necesario.
    NOTA: Diferentes fuentes de NTBC tienen diferencias en la solubilidad. Determinar el vehículo apropiado en el que se disuelva el NTBC basado en las recomendaciones del fabricante y ajuste Paso 1.5 en consecuencia.

2. NTBC titulaciones de Cepas bacterianas

  1. Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar. Añadir 2 ml de LB tubo de ensayo de caldo de 16 x 150 mms (uno por cepa) y inoculan con 1 aislada colonia de cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación en un rotador de cultivo de tejidos en una incubadora de aire.
  2. El día siguiente, se preparan titulaciones de NTBC en caldo LB. Utilice un rango inicial de 0 a 900 mM NTBC desde diferentes cepas tienen diferencias en la sensibilidad a la NTBC.
    1. Añadir 1 ml de caldo LB a 4 a 5 tubos de ensayo (16 x 150 mm) por cepa.
    2. Añadir la solución madre NTBC (75,9 mM) a los tubos de ensayo (16 x 150 mm) en un intervalo de concentraciones. Ver Tabla 1 para las concentraciones NTBC y volúmenes de valores correspondientes a añadir a 1 ml de caldo LB.
  3. Mida la OD 600 de los cultivos de una noche. Lávese las culturas antes de tomar OD 600 lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación.
    1. Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y las células sedimentadas vagamente conuna micropipeta y resuspender el sedimento celular sólida en 1 ml de LB.
  4. Inocular los tubos de titulación a una DO 600 0,05. Calcular la cantidad de cultivo se lavó necesaria para inocular los tubos.
    NOTA: Utilice las culturas lavadas para inoculaciones desde pyomelanin no debe estar presente.
  5. Incubar los tubos de titulación durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire.
  6. Fotografiar los tubos de valoración y comparación de la producción de pigmento dentro y entre las cepas para determinar la cantidad de NTBC utilizar para los ensayos de MIC y el estrés oxidativo. Utilice OD 600 lecturas para determinar la cantidad de pyomelanin en la celda sobrenadante del cultivo libre y para determinar la densidad celular.
    NOTA: La relación de OD 600 de pyomelanin en el sobrenadante del cultivo de células se puede calcular para cuantificar las diferencias en la producción pyomelanin después del tratamiento con NTBC.

3. antibióticos inhibi mínimoConcentración (MIC) Ensayo tory en placas de 96 pocillos

  1. Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC.
    NOTA: Este protocolo se describe utilizando el nivel representativo de 300 M NTBC. El nivel apropiado de NTBC para ser utilizado se determina en el paso 2.6.
    1. Añadir 300 mM NTBC a 2 ml LB. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB para la condición no NTBC.
    2. El uso de palillos de dientes estériles, inocular tubos con una colonia aislada de bacterias. Habrá una cultura con NTBC y una cultura sin NTBC para cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire.
  2. Al día siguiente, hacer que las soluciones magistrales LB + DMSO LB + NTBC y para configurar el ensayo MIC. Añadir NTBC a una concentración de 600 mM como este se diluirá doble cuando se añade inóculo, produciendo una concentración final de 300 mM.
    1. Para probar un solo antibiótica de una cepa, añadir 600 M NTBC a 2 ml de LB y mezclar para que la solución principal NTBC. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB y se mezcla para hacer la solución ningún maestro NTBC. Utilice estas soluciones para crear soluciones madre de antibióticos, así como para la creación de la serie de dilución en placas de 96 pocillos.
      NOTA: Las formulaciones de solución maestros darán solución adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Las soluciones magistrales se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario en función de la cantidad de antibióticos y cepas probadas.
  3. Preparar las soluciones de antibióticos en las soluciones magistrales LB + NTBC o LB + DMSO.
    NOTA: La concentración de antibiótico en estas soluciones debería ser el doble de la concentración final deseada. Suficiente solución se debe hacer para transferir 100 l de cuatro pozos en una placa de 96 pocillos.
    1. Preparar gentamicina +/- NTBC solución madre a los 64 mg / ml. Para hacer esta solución, añadir 0,288 l de Stock gentamicina (100 mg / ml) para 450l LB + NTBC o solución maestro LB + DMSO.
      NOTA: La concentración máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 es 32 mg / ml.
    2. Haga la kanamicina +/- NTBC solución madre a 256 g / ml. Para que esta solución, añadir 3,84 l de kanamicina social (30 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales.
      NOTA: La concentración máxima de kanamicina para P. aeruginosa PAO1 es 128 g / ml.
    3. Preparar tobramicina +/- NTBC solución madre a 8 mg / ml. Para que esta solución, añadir 0,36 l de tobramicina social (10 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales.
      NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, la concentración máxima de tobramicina es 4 mg / ml.
      NOTA: Los antibióticos y concentraciones se pueden ajustar para las bacterias a ensayar.
  4. Añadir 100 l de cada solución de antibiótico 2x para cuatro pozos en una placa de 96 pocillos. Coloque estas soluciones en la fila A. Para example, gentamicina debe ser colocado en A1 a A4, kanamicina debe ser colocado en A5 a A8, y tobramicina debe ser colocado en A9 a través de A12. Ver Figura 1A para un diagrama de una placa de 96 pocillos de configurar.
    NOTA: Múltiples antibióticos pueden ser probados en un plato, pero sólo una cepa debe ser probado por placa para eliminar el potencial de contaminación cruzada de otras cepas.
  5. Añadir 50 l de la solución maestro LB + NTBC o LB + DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que un plato es LB + NTBC y una placa es LB + DMSO. Ver Figura 1A.
    1. Utilice LB + NTBC para los antibióticos en LB + NTBC. Utilice LB + DMSO para los antibióticos en LB + DMSO.
  6. Usando una micropipeta realizar dos diluciones seriadas dobles de los antibióticos mediante la transferencia de 50 l de la solución de la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambiar las puntas de pipeta y transferir 50 l de la solución de la línea B de la fila C. Repita el procedimiento para el remainifilas NG. Después de diluir la fila G, retirar 50 l de la solución de esa fila y descarte. Utilice la fila H como un control de antibióticos para el crecimiento bacteriano. Ver Figura 1B.
    NOTA: Cada Un pozo en filas a G ahora contiene 50 l de antibióticos en LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentración final deseada. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos.
  7. Mida la OD 600 de los cultivos de una noche. Lave todas las culturas antes de tomar OD 600 lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación.
    1. Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante con una micropipeta y resuspender el botón celular en 1 ml de LB.
  8. Diluir los cultivos de una noche de 2.75x10 5 UFC / ml en LB.
    NOTA: Supongamos que un OD 600 unidad es el equivalente de 1x10 9 UFC / ml para P. aeruginosa. OD / a conversiones ml CFU puede ser different en otras bacterias.
  9. Añadir 50 l de cultivo bacteriano diluido al pocillo apropiado.
    NOTA: Los cultivos cultivados en NTBC deben añadirse a los pocillos que contienen NTBC y culturas crecido en DMSO deben añadirse a los pocillos que contienen DMSO. Ver Figura 1B.
    1. Añadir bacterias para tres pozos para cada cepa y la concentración de antibiótico. Añadir 50 l de LB a la cuarta bien para actuar como un control para la contaminación bacteriana. Ver Figura 1B.
    2. Utilice una micropipeta multicanal para inocular los pozos. Asegúrese de que la pipeta consejos son cerca de la parte inferior de los pozos cuando se añade inóculo para evitar la contaminación de los pozos vecinos.
      NOTA: La adición de cultivo bacteriano a los pozos diluirá las concentraciones de antibióticos y NTBC doble.
  10. Cubrir las placas de 96 pocillos con parafilm y se incuba aproximadamente 24 horas a 37 ° C. Incubar las placas de 96 pocillos de forma estática, en una incubadora de aire.
  11. Examinarlas placas para el crecimiento bacteriano en los pocillos. El MIC es la concentración más baja de antibiótico en el que no se observa crecimiento bacteriano para las tres repeticiones de cada cepa.
    1. Examine visualmente la placa para el crecimiento o leer mediante un conjunto lector de placas a OD 600.

Ensayo Placa 4. Punto de Estrés Oxidativo Respuesta

  1. Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC como se describe en el paso 3.1.
  2. Al día siguiente, se preparan placas de agar LB que contenían H 2 O 2 como un factor de estrés oxidativo. Una gama de H 2 O 2 concentraciones de 0 a 1 mm es un buen punto de partida.
    1. Derretir los frascos de agar LB. Frescos medios a aproximadamente 50 ° C a la temperatura ambiente.
    2. Añadir H 2 O 2 directamente a los medios de comunicación enfriados a las concentraciones deseadas. Frascos del remolino para mezclar. Ver Tabla 2 para las concentraciones de H 2 O 2y los volúmenes de H 2 O 2 concentrada para agregar. Estos valores se basan en 100 ml de LB agar.
    3. Vierta platos inmediatamente después de la adición de H 2 O 2 y la llama de la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de 4 placas por cada 100 ml de agar LB. Marque las placas con la concentración de H 2 O 2.
    4. Colocar las placas descubiertos en una campana de flujo biológica con el ventilador funcionando durante 30 min para eliminar el exceso de humedad de las placas.
      NOTA: Utilice las placas el mismo día que se preparan. El no hacerlo puede resultar en datos inconsistentes.
      NOTA: los factores de estrés oxidativo como el paraquat pueden ser sustituidos por H 2 O 2 en este ensayo. Las concentraciones utilizadas para otros factores de estrés oxidativo puede ser diferente de los utilizados para H 2 O 2.
  3. Lavar y medir el OD 600 de los cultivos de una noche como se describe en el paso 3.7.
  4. Normalizar el OD 600 de todo el cu nocheltures al valor más bajo para el conjunto de cepas están probando. P. aeruginosa en general, tiene un OD 600 de aproximadamente 2,5 cuando se desarrolló durante la noche en LB + NTBC o LB + DMSO.
    1. Determinar el volumen de cultivo necesario para diluir la cultura al más bajo OD 600 en un volumen total de 1 ml. Por ejemplo, si una cultura tiene una DO 600 de 3 y el más bajo OD 600 para el conjunto de las cepas es 2.5, realice el siguiente cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. Se colocarán 0,833 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga.
    2. Calcular la cantidad de LB + NTBC (300 mM) o LB + DMSO necesario para llevar el volumen a 1 ml de cultivo. Para el ejemplo en el paso 4.4.1, la cantidad de LB + NTBC o LB + DMSO añade al cultivo sería 0,167 ml (1 ml de volumen total de 0.833 ml - Cultura). Hacer que las soluciones stock de LB + NTBC y LB + DMSO a utilizar para estas diluciones basado en el volumen necesario para diluir todas las cepas.
    3. Mezclar la cultura y LB + NTBC o LB + DMSO mediante agitación con vórtex.
  5. Para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO, realizar diluciones en serie de diez veces de los cultivos de una noche normalizados en PBS + NTBC o PBS + DMSO.
    1. Haga soluciones madre de PBS + NTBC y PBS + DMSO. Para un conjunto de diluciones de una cepa, mezclar 300 mM NTBC o un volumen equivalente de DMSO con PBS para dar un volumen total de 720 l. Escala estas poblaciones hacia arriba o abajo dependiendo del número de cepas se ponen a prueba.
    2. Tubos de microcentrífuga Etiqueta para 10 -1 a través de diluciones 10 -7 serie. Añadir 90 l de PBS + NTBC o PBS + DMSO a los tubos apropiados. Utilice PBS + NTBC para las cepas cultivadas en LB + NTBC y utilizar PBS + DMSO para las cepas cultivadas en LB + DMSO.
    3. Añadir 10 l de la cultura al tubo de dilución 10 -1 apropiado. Mezclar mediante agitación y la transferencia de 10 l de la dilución 10 -1 al tubo de dilución 10 -2. Repita hasta que todas las diluciones han sido performó. Cambie puntas de pipeta entre las diluciones.
  6. Spot 5 l de la 10 -3 a través de 10 -7 diluciones en LB + H 2 O 2 placas por duplicado para cada cepa. Utilice una punta de pipeta si se colocan puntos de la mayoría diluir al menos diluido (10 -7 a 10 -3). No incline o inclinar la placa hasta que el líquido se haya secado en la placa.
  7. Incubar las placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de aire), dependiendo de la cepa.
    NOTA: P. aeruginosa PAO1 tendrá buenas colonias de tamaño en LB después de 24 h de incubación. Incubar las cepas hasta que tienen colonias de aproximadamente el mismo tamaño que PAO1.
  8. Fotografiar las placas utilizando una cámara CCD por encima de un transiluminador. Opcionalmente, editar las fotos para el contraste y la cosecha al mismo tamaño. Contar el número de colonias en cada punto para determinar cambios en la sensibilidad al estrés oxidativo.

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Representative Results

Titulaciones NTBC

Las titulaciones NTBC se utilizaron para determinar si NTBC fue capaz de reducir la producción de pyomelanin en P. aeruginosa, y también identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción pyomelanin para uso en ensayos adicionales. Es posible que haya variaciones en los niveles de pyomelanin producido en diferentes repeticiones, pero las tendencias generales permanecer constante. El ensayo de valoración NTBC también podría ser modificado para probar otros compuestos que puedan afectar a la producción de pigmento en otras bacterias. Esto sólo funciona, sin embargo, si hay un cambio fenotípico que puede ser determinado visualmente o cuantificarse.

Tratamiento de cepas productoras de pyomelanin de P. aeruginosa con NTBC resultó en una disminución dependiente de la dosis en la producción de pigmento 12. La Figura 2 muestra que las diferentes cepas de P. aeruginosa tienen diferencias en la sensibilidad a la NTBC, como se indica por los niveles de pyola producción de melanina. Se requieren concentraciones más altas de NTBC para reducir la producción en el pyomelanin PA1111 clínico aislado de 17 (obtenido de Dara Frank) en comparación con la cepa de laboratorio HMGA :: tn 18 (Universidad de Washington transposón PAO1 biblioteca de mutantes). Las cepas que no producen pyomelanin [PAO1 (obtenido de Carrie Harwood) y hpd :: tn 18 (Universidad de Washington transposón PAO1 biblioteca de mutantes)] no mostraron ningún cambio en la pigmentación NTBC con el tratamiento. Decidimos utilizar 300 M NTBC para nuestros ensayos porque pyomelanin producción se redujo sustancialmente en el HMGA cepa de laboratorio :: tn utilizando esa concentración (compárese 300 M a 0 M NTBC). Todas las cepas utilizadas en este estudio fueron almacenadas a -80 ° C en 15% de glicerol.

PRM antibióticos

PRM antibióticos pueden ser probados utilizando varios métodos diferentes. El método de la placa de microtitulación aquí descrito permitirá el usor para poner a prueba una serie de concentraciones de antibiótico y el uso de un mínimo de recursos. Los resultados se replican fácilmente y el ensayo pueden ser modificados para permitir diferencias en sensibilidad a los antibióticos del microorganismo a ensayar. Alguna variación puede verse entre los experimentos independientes, pero las tendencias son bastante consistentes. Técnico repeticiones deben exhibir la misma MIC.

Tabla 3 muestra los resultados para diferentes P. aeruginosa cepas tratadas con y sin NTBC y varios antibióticos aminoglucósidos. Tres colonias independientes fueron probados por triplicado siguiendo el método descrito. CIMs se registraron como la concentración más baja de antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano en todas las tres repeticiones técnica. NTBC tratamiento no tuvo efecto sobre las MICs aminoglucósidos para las cepas ensayadas.

El estrés oxidativo ensayo de placa de punto

El ensayo de placa de lugar para las pruebas de estrés oxidativo da reproducible resultados utilizando niveles más bajos de H 2 O 2 que los utilizados en otros ensayos. La placa sin H 2 O 2 es una placa de control para determinar la exactitud de la serie de dilución para cada cepa, así como determinar el tamaño de colonia y el número de colonias en cada punto sin someter a las células al estrés oxidativo. En una serie de dilución adecuada, el punto final debe tener muy pocas colonias, mientras que el primer lugar tendrá un incontable número de colonias en H 2 O 2 medios de comunicación libres. No debe haber una diferencia de diez veces en el número de colonias en cada punto dentro de una serie de dilución. Para todas las cepas probadas, similar número de colonias deben ser vistos en la misma dilución en el 2 O 2 placa de control libre de H.

Como diferentes cepas de bacterias pueden tener diferentes sensibilidades al estrés oxidativo, un rango de H 2 O 2 concentraciones deben ser probados. El aumento de las concentraciones de H 2 O 2 O 2 inducida por estrés oxidativo. Las características de crecimiento de diferentes cepas bacterianas pueden compararse para determinar la sensibilidad al estrés oxidativo bajo un particular, H 2 O 2 concentración. El ensayo puede ser modificado para determinar los efectos de un compuesto o reactivo en particular, tal como NTBC, en una sola cepa bacteriana cuando las bacterias se someten a estrés oxidativo. Las colonias también se pueden contar para determinar el porcentaje de reducción en la colonia bacteriana unidades entre diferentes condiciones experimentales de formación.

Figura 3 muestra un ensayo de placa de punto de cepas pyomelanin y no pyomelanin productoras de P. aeruginosa tratada con y sin NTBC y se expuso a H 2 O 2 inducida por estrés oxidativo. Hay una clara difereNCE en la sensibilidad al estrés oxidativo cuando pyomelanin bacterias productoras se tratan con NTBC, y también entre las bacterias que no producen pyomelanin en comparación con aquellos que sí producen pigmento. Las cepas que no produjeron pyomelanin, ya sea de forma natural o debido al tratamiento NTBC, eran más sensibles al estrés oxidativo que las cepas que produjeron pyomelanin.

Figura 1
Figura 1:. Esquema del ensayo de MIC placa de 96 pocillos con antibióticos creó (A) 100 l de antibióticos 2x de la concentración más alta de partida están en fila A. filas B a H se llenan con 50 l de cualquiera de LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos. (B) dos diluciones seriadas de plegado se realizan en las filas A a G, resultando en 50 l de antibiótico diluido en cada pocillo a 2x la concentración final deseada. Fila H es un control bien para bacterial crecimiento sin antibióticos. 50 l de LB o inóculo se añade a los pocillos apropiados, diluyendo los antibióticos doble a la concentración final. LB sirve como control para la contaminación bacteriana en los antibióticos. Gm, gentamicina; Km, kanamicina; Tob, tobramicina.

Figura 2
Figura 2: titulaciones NTBC de productores pyomelanin y no productores de P. aeruginosa. NTBC reducida pyomelanin la producción de una manera dependiente de la dosis en el laboratorio y los productores pyomelanin clínicos, pero no tuvo efecto sobre la producción de pigmento en cepas que no producen pyomelanin. Modificado de referencia 12.

Figura 3
Figura 3: Punto ensayo de placa de respuesta al estrés oxidativo cepas bacterianas fueron diluido.d a la misma OD 600, serial diluida 10 veces, y visto en placas LB que contenían diversas concentraciones de H 2 O 2. Las 0 mM H 2 O 2 resultados placa mostraron que todas las cepas se diluyeron adecuadamente, como se indica por un número similar de colonias en cada uno de los puntos para la misma dilución para diferentes cepas. Las placas que contienen H 2 O 2 muestran que las cepas eran más sensibles al estrés oxidativo como la concentración de H 2 O 2 aumentaron. Esto se indica mediante recuentos de colonias disminuyó en los puntos en comparación con la condición de no H 2 O 2, así como una reducción en el tamaño de la colonia. Modificado de referencia 12.

La concentración final de NTBC (M) Volumen de NTBC (75,9 mM) para agregar (l)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11.86

Tabla 1: Concentraciones NTBC para la creación de titulaciones en LB. Esta tabla da varias concentraciones NTBC y la cantidad correspondiente de NTBC Para añadir a 1 ml LB.

Concentración final de H 2 O 2 (mM) Cantidad de 9,79 MH 2 O 2 (30% en peso) para agregar (l)
0 0
0.2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

Tabla 2:. Las concentraciones de H 2 O 2 para agregar a agar LB para el estrés oxidativo ensayo de placa de punto Esta tabla da varios H 2 O 2 concentraciones y la cantidad correspondiente de H concentrado 2 O 2 stock a añadir a 100 ml de LB agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC hpd :: tn - NTBC hpd :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicina 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
Kanamicina 16 8 32 32 32 32 16 16
La tobramicina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

Tabla 3: Resultados de la MIC antibiótica tres colonias independientes se analizaron por triplicado para cada stra.en. Re-impreso con el permiso de la referencia 12.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

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References

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