Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Immunology and Infection

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Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Preparação de Meios de Cultura, antibióticos e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclo-hexanodiona (NTBC)

  1. Adicione caldo LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl em H 2 O) e alíquota em volumes apropriados. Esterilizar em autoclave. Guarde-o em temperatura ambiente.
  2. Adicione 100 ml de agar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar em H2O) em 250 ml de frascos. Esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o agar é derretido antes de verter em placas.
    NOTA: Os frascos contendo 100 ml de LB agar irá originar 4 placas. A quantidade de agar LB pode ser alterada para corresponder ao número de placas necessárias para o ensaio.
  3. Adicione PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, KH 2 mM 2 PO 4) 16. Esterilizar em autoclave ou filtração e armazenamento à temperatura ambiente.
  4. Preparar as soluções de antibióticos para a gentamicina, a canamicina, umad tobramicina.
    1. Prepare concentrações banco de antibióticos apropriados para P. aeruginosa estirpes contendo 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de canamicina, e 10 mg / ml de tobramicina. Dissolver os antibióticos em água, Esterilizar por filtração (0,2 mm), e armazenar a 4 ° C. Alterar os antibióticos e concentrações, dependendo da bactéria em estudo.
  5. Prepare as soluções estoque NTBC. Dissolve-se 10 mg de NTBC em 400 ul de DMSO. Isto produz uma concentração de 75,9 mM NTBC. Loja soluções estoque NTBC a -20 ° C. Soluções descongelar à temperatura ambiente, conforme necessário.
    NOTA: Diferentes fontes de NTBC têm diferenças de solubilidade. Determinar o veículo apropriado em que para dissolver o NTBC com base nas recomendações do fabricante e ajustar Passo 1.5 em conformidade.

2. NTBC Titulações de Estirpes Bacterianas

  1. Defina-se culturas nocturnas das estirpes a serem testadas. Adicionar 2 ml de caldo LB a 16 x 150 mm tubo de ensaios (um por cepa) e inocular com uma colônia isolada de cada estirpe. Incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento num agitador rotativo de cultura de tecidos em uma incubadora de ar.
  2. No dia seguinte, preparar titulações de NTBC em caldo LB. Use uma primeira série 0-900 mM NTBC uma vez que diferentes cepas têm diferenças na sensibilidade à NTBC.
    1. Adicionar 1 ml de caldo LB a 4 para 5 tubos de ensaio (16 x 150 mm) por estirpe.
    2. Adicionar a solução estoque NTBC (75,9 mM), para os tubos de ensaio (16 x 150 mm) numa gama de concentrações. Ver Tabela 1 para as concentrações e volumes NTBC imagens correspondentes a adicionar a 1 mL de caldo de LB.
  3. Medir a OD 600 das culturas durante a noite. Lave as culturas antes de tomar OD 600 leituras para eliminar pyomelanin presente na mídia.
    1. Lavam-se as culturas por centrifugação de 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante e as células peletizadas com frouxamenteuma micropipeta e ressuspender o pellet celular sólido em 1 ml de LB.
  4. Inocular tubos de titulação em OD 600 de 0,05. Calcula-se a quantidade necessária da cultura lavou-se para inocular os tubos.
    NOTA: Use as culturas lavadas para inoculações desde pyomelanin não deve estar presente.
  5. Incubar os tubos de titulação durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C com arejamento usando um tecido rotador cultura numa incubadora de ar.
  6. Fotografar os tubos de titulação e comparar a produção de pigmento dentro e entre as cepas para determinar a quantidade de NTBC de usar para MIC e estresse oxidativo ensaios. Use OD 600 leituras para determinar a quantidade de pyomelanin na célula livre sobrenadante da cultura e para determinar a densidade celular.
    Observação: A razão OD 600 de pyomelanin no sobrenadante da cultura de células pode ser calculada para quantificar as diferenças na produção pyomelanin após o tratamento com NTBC.

3. Antibiótico Inhibi mínimoConcentração (MIC) Ensaio tory em placas de 96 poços

  1. Configure culturas durante a noite das estirpes a ser testado em LB com e sem NTBC.
    NOTA: Este protocolo é descrito usando o nível representante de 300? M NTBC. O nível apropriado de NTBC a ser utilizado é determinado no passo 2.6.
    1. Adicionar 300 ^ M a 2 ml NTBC LB. Adicionar um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml de LB para a condição não NTBC.
    2. Usando palitos estéreis, inocule os tubos com uma colônia de bactérias isoladas. Haverá uma cultura com NTBC e uma cultura sem NTBC para cada estirpe. Incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento usando um tecido rotador cultura numa incubadora de ar.
  2. No dia seguinte, fazer LB + NTBC e soluções mestre LB + DMSO para a criação do ensaio MIC. Adicionar NTBC a uma concentração de 600 uM como este será diluído duas vezes quando inoculo é adicionado, dando origem a uma concentração final de 300 uM.
    1. Para testar um antibiótica para uma estirpe, adicionar 600 | iM NTBC a 2 ml de LB e misturar para tornar a solução NTBC mestre. Adicionar um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml de LB e misturar para fazer a solução não NTBC mestre. Usar estas soluções para criar soluções-mãe de antibióticos, bem como para a criação de séries de diluição em placas de 96 poços.
      NOTA: As formulações de solução mestre trará solução extra para contabilizar erros de pipetagem. As soluções mestre pode ser escalada para cima ou para baixo, conforme necessário, dependendo do número de antibióticos e estirpes testadas.
  3. Preparar as soluções de antibióticos nas soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
    NOTA: A concentração do antibiótico na Estas soluções devem ser o dobro da concentração final desejada. Deve ser feita solução suficiente para transferir 100 ul de quatro poços de uma placa de 96 poços.
    1. Prepare gentamicina +/- solução estoque NTBC a 64 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 0,288 ul de estoque de gentamicina (100 mg / mL) a 450jil de LB + NTBC ou mestre solução de LB + DMSO.
      NOTA: A concentração máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 32 ug / ml.
    2. Faça a canamicina +/- solução estoque NTBC a 256 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 3,84 l de estoque canamicina (30 mg / ml) a 450 ul soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
      NOTA: A concentração máxima de canamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 128 ug / ml.
    3. Prepare tobramicina +/- solução estoque NTBC a 8 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 0,36 l de estoque tobramicina (10 mg / ml) a 450 ul soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
      NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, a concentração máxima de tobramicina é de 4 ug / ml.
      NOTA: As concentrações de antibióticos e pode ser regulado para as bactérias a serem testadas.
  4. Adiciona-se 100 ul de cada solução de antibiótico 2x para poços quatro numa placa de 96 poços. Coloque essas soluções em linha A. Para example, a gentamicina, deve ser colocado em A1 a A4, canamicina devem ser colocados em A5 a A8 e tobramicina deve ser colocado em meio A9 A12. Ver Figura 1A um diagrama de uma placa de 96 poços configurado.
    NOTA: antibióticos múltiplos pode ser testado em um prato, mas apenas uma estirpe deve ser testado por placa para eliminar o potencial de contaminação cruzada de outras estirpes.
  5. Adicionar 50 ul da solução de mestre de LB + NTBC ou LB + DMSO a linha B a H da placa de 96 poços. Certifique-se que uma placa é LB + NTBC e um prato é LB + DMSO. Veja a Figura 1A.
    1. Use de LB + NTBC para os antibióticos em LB + NTBC. Use de LB + DMSO para os antibióticos em LB + DMSO.
  6. Usando uma micropipeta realizar diluições em série duas vezes dos antibióticos através da transferência de 50 mL da solução de linha A para a linha B. Misturar a solução, mudar as pontas de pipetas, e transferir 50 ul da solução a partir da linha B para a linha C para Repetir o remainilinhas GN. Depois de se diluir linha L, remover 50 ul da solução a partir dessa linha e descarte. Utilize linha H como um antibiótico sem controle para o crescimento bacteriano. Ver Figura 1B.
    NOTA: Cada poço nas filas A a G contém agora 50 uL de antibiótico em LB + NTBC ou LB + DMSO a 2X a concentração final desejada. Fila H contém LB + NTBC ou LB + DMSO sem antibióticos.
  7. Medir a OD 600 das culturas durante a noite. Lave todas as culturas antes de tomar OD 600 leituras para eliminar pyomelanin presente na mídia.
    1. Lavam-se as culturas por centrifugação de 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante com uma micropipeta e ressuspender o pellet celular em 1 ml de LB.
  8. Dilui-se as culturas durante a noite para 2.75x10 5 ufc / mL em LB.
    NOTA: Assume-se que uma unidade DO600 é o equivalente de 1x10 9 CFU / ml para P. aeruginosa. OD para as conversões de UFC / mL podem ser different em outras bactérias.
  9. Adicionar 50 ul da cultura bacteriana diluído ao poço adequado.
    NOTA: As culturas são crescidas em NTBC deve ser adicionada aos poços contendo NTBC e culturas cultivadas em DMSO deve ser adicionado às cavidades contendo DMSO. Ver Figura 1B.
    1. Adicionar bactérias a três poços para cada estirpe e concentração do antibiótico. Adicionar 50 ul de LB para o quarto poço para actuar como um controlo para a contaminação bacteriana. Ver Figura 1B.
    2. Usar uma pipeta de multi-canal para inocular os poços. Assegurar que pipeta pontas estão perto do fundo dos poços, quando a adição de inoculo para evitar a contaminação de poços vizinhos.
      NOTA: A adição de cultura bacteriana aos poços irá diluir as concentrações de antibiótico e NTBC duas vezes.
  10. Cobrir as placas de 96 poços com parafilme e incubar a cerca de 24 horas a 37 ° C. Incubar as placas de 96 poços estaticamente, numa incubadora de ar.
  11. Examinaras placas para o crescimento bacteriano nas cavidades. A MIC é a concentração mais baixa de antibiótico em que nenhum crescimento bacteriano é visto para todas as três repetições de cada estirpe.
    1. Examine visualmente a placa de crescimento ou ler usando um conjunto leitor de placas de DO600.

4. Ponto Ensaio Placa de resposta ao estresse oxidativo

  1. Defina-se culturas nocturnas das estirpes a ser testado em meio LB com ou sem NTBC tal como descrito na etapa 3.1.
  2. No dia seguinte, para preparar as placas de agar LB contendo H 2 O 2 como um estressor oxidativo. Uma gama de H 2 O 2 concentrações de 0 a 1 mM é um bom ponto de partida.
    1. Derreter os frascos de LB-agar. Super meios para aproximadamente 50 ° C à temperatura ambiente.
    2. Adicionar H 2 O 2 directamente sobre o suporte arrefecidos nas concentrações desejadas. Frascos agite para misturar. Ver Tabela 2 para as concentrações de H 2 O 2e volumes de concentrado H 2 O 2 a acrescentar. Estes valores baseiam-se em 100 ml de LB com agar.
    3. Verter em placas imediatamente após a adição de H 2 O 2 e a superfície da chama para remover as bolhas. O rendimento é de 4 placas por 100 ml de LB com agar. Marcar as placas com a concentração de H 2 O 2.
    4. Colocar as placas descoberto numa câmara de fluxo biológico com o ventilador corrida durante 30 min para remover o excesso de humidade das placas.
      NOTA: Use as placas no mesmo dia em que são preparados. Não fazer isso pode resultar em dados inconsistentes.
      NOTA: factores de stress oxidativo, tais como o paraquat pode ser substituído por H 2 O 2 neste ensaio. As concentrações utilizadas para outros factores de stress oxidativo pode ser diferente do que os usados ​​para a H 2 O 2.
  3. Lavar e medir a DO 600 das culturas durante a noite, tal como descrito na etapa 3.7.
  4. Normalizar o OD 600 de todo o cu durante a noiteltures para o menor valor para o conjunto de estirpes que está sendo testado. P. aeruginosa tem geralmente uma DO600 de aproximadamente 2,5, quando crescidas durante a noite em LB ou LB + NTBC + DMSO.
    1. Determinar o volume de cultura necessárias para diluir a cultura para o menor OD 600 num volume total de 1 ml. Por exemplo, se uma cultura tem um OD 600 de 3 e menor do OD 600 para o conjunto de estirpes é de 2,5, executar o seguinte cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (X). x = 0.833 ml. 0,833 ml de cultura vai ser colocado num tubo de microcentrífuga.
    2. Calcular a quantidade de LB + NTBC (300 uM) ou DMSO de LB + necessária para trazer o volume de cultura para 1 ml. Para o exemplo no passo 4.4.1, a quantidade de LB + NTBC ou LB + DMSO adicionado à cultura seria 0.167 ml (1 ml de volume total de 0,833 ml - de cultura). Adicione as soluções concentradas de LB + NTBC e LB + DMSO para utilizar para estes diluições com base no volume necessário para diluir todas as estirpes.
    3. Misture a cultura e LB + NTBC ou LB + DMSO em vórtice.
  5. Para manter as culturas numa concentração constante de NTBC ou DMSO, realizar diluições em série de dez vezes das culturas durante a noite em PBS + normalizados NTBC ou PBS + DMSO.
    1. Faça as soluções concentradas de PBS + NTBC e PBS + DMSO. Para um conjunto de diluições de uma estirpe, misturar 300 NTBC uM ou um volume equivalente de DMSO com PBS para se obter um volume total de 720 ul. Escalar esses stocks cima ou para baixo, dependendo de quantas cepas são testadas.
    2. Etiqueta para tubos de microcentrífuga através de diluições 10 -1 10 -7 série. Adicionar 90 ul de PBS + NTBC ou PBS + DMSO para os tubos apropriados. Use PBS + NTBC para as estirpes cultivadas em LB + NTBC e usar PBS + DMSO para as estirpes cultivadas em LB + DMSO.
    3. Adicionar 10 ul de cultura para o tubo 10 -1 de diluição apropriado. Misturar em vortex e transferir 10 ul da diluição 10 -1 para o tubo de diluição 10 -2. Repetir até que todas as diluições foram Performou. Alterar pontas de pipeta entre diluições.
  6. Spot 5 ul de 10 -3 a 10 -7 através diluições em placas de LB + H 2 O 2 placas em duplicado para cada estirpe. Use uma ponta de pipeta se manchas são banhados de mais diluída para menos diluído (10 -7 a 10 -3). Não ponta ou incline a placa até que o líquido tenha secado na placa.
  7. Incubar as placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de ar), dependendo da estirpe.
    NOTA: P. aeruginosa PAO1 terá bons colônias porte sobre LB após 24 horas de incubação. Incubar estirpes até que colónias têm aproximadamente o mesmo tamanho que PAO1.
  8. Fotografar as placas usando uma câmera CCD acima de um transluminador. Opcionalmente, editar as fotos para o contraste e cultura para o mesmo tamanho. Contar o número de colónias em cada local para determinar alterações na sensibilidade ao estresse oxidativo.

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Representative Results

Titulações NTBC

As titulações NTBC foram utilizados para determinar se NTBC foi capaz de reduzir a produção em P. pyomelanin aeruginosa, e também identificar a concentração de NTBC que elimina ou reduz a produção pyomelanin para utilização em ensaios adicionais. Pode haver variações nos níveis de pyomelanin produzida em diferentes repetições, mas as tendências gerais permanecer constante. O ensaio de titulação NTBC também poderia ser modificado para testar outros compostos que possam afectar a produção de pigmento em outras bactérias. Isto irá funcionar apenas, no entanto, se houver uma alteração fenotípica que pode ser determinado visualmente ou quantificados.

O tratamento de estirpes de P. produzir pyomelanin aeruginosa com NTBC resultou numa diminuição dependente da dose da produção de pigmento de 12. A Figura 2 mostra que diferentes estirpes de P. aeruginosa têm diferenças na sensibilidade ao NTBC, como indicado pelos níveis de pyoa produção de melanina. Concentrações mais elevadas de NTBC foram requerida para reduzir em pyomelanin produção do isolado clínico PA1111 17 (obtido a partir de Dara Frank) em comparação com a estirpe laboratorial HMGA :: TN 18 (Universidade de Washington PAO1 transposão biblioteca mutante). As estirpes que não produzem pyomelanin [PAO1 (obtido a partir de Carrie Harwood) e HPD :: TN 18 (Universidade de Washington PAO1 transposão biblioteca mutante)] mostrou nenhuma alteração na pigmentação com tratamento NTBC. Decidimos usar o 300? M NTBC para os nossos ensaios porque pyomelanin produção foi substancialmente reduzida no HMGA cepa de laboratório :: tn usando essa concentração (compare 300 mM mM a 0 NTBC). Todas as estirpes utilizadas neste estudo foram armazenadas a -80 ° C em glicerol a 15%.

MICs antibióticos

MICs antibiótico pode ser testado utilizando vários métodos diferentes. O método de placas de microtitulação aqui descrito vai permitir a utilizaçãor para testar uma gama de concentrações de antibiótico e utilizar um mínimo de recursos. Os resultados são facilmente replicado e o ensaio pode ser modificado para permitir as diferenças de sensibilidade aos antibióticos do organismo a ser testado. Algumas variações podem ser vistos entre experimentos independentes, mas as tendências são bastante consistentes. Repetições técnicas devem apresentar o mesmo MIC.

A Tabela 3 mostra os resultados para diferentes P. cepas aeruginosa tratados com e sem NTBC e vários antibióticos aminoglicosídeos. Três colónias independentes foram testados, em triplicado, seguindo o método descrito. CIMs foram registadas como a concentração mais baixa de antibiótico que inibiu o crescimento bacteriano em todas as três repetições técnicas. NTBC tratamento não teve efeito sobre os valores de CIM de aminoglicósido para as estirpes testadas.

O estresse oxidativo ensaio de placa de ponto

O ensaio de placa de ponto para o estresse oxidativo teste dá reproducible os resultados obtidos utilizando os níveis mais baixos de H 2 O 2 do que as utilizadas em outros ensaios. A placa sem H2O 2 é uma placa de controlo para determinar a precisão da série de diluições para cada estirpe, bem como determinar o tamanho da colónia e número de colónias em cada local sem sujeitar as células ao estresse oxidativo. Em uma série de diluição adequado, o ponto final deve ter muito poucas colónias, enquanto que o primeiro local terá um número incontável de colónias em H 2 O 2 a meios livres. Não deve haver uma diferença de dez vezes no número de colónias em cada ponto dentro de uma série de diluição. Para todas as estirpes testadas, um número semelhante de colónias devem ser vistos na mesma diluição no 2 O 2 H placa de controlo livre.

Uma vez que diferentes estirpes de bactérias pode ter diferentes sensibilidades ao estresse oxidativo, uma gama de H 2 O 2 concentrações deverão ser testadas. Concentrações crescentes de H2O ao H 2 O 2 induzida estresse oxidativo. As características de crescimento de diferentes estirpes bacterianas podem ser comparadas para determinar a sensibilidade ao stress oxidativo sob um determinado H 2 O 2 a concentração. O ensaio pode ser modificado para se determinar os efeitos de um composto ou de um reagente particular, tal como NTBC, em uma única estirpe bacteriana quando as bactérias são submetidas a stress oxidativo. As colónias também podem ser contadas para determinar a percentagem de redução de unidades de formação de colónia bacteriana entre diferentes condições experimentais.

A Figura 3 mostra um ensaio de placa de ponto de estirpes pyomelanin e não produzindo pyomelanin de P. aeruginosa tratados com e sem NTBC e expostas a H 2 O 2 induzida por estresse oxidativo. Há uma clara differedno na sensibilidade ao stress oxidativo quando pyomelanin bactérias produtoras são tratadas com NTBC, e também entre as bactérias que não produzem pyomelanin em comparação com aqueles que produzem pigmento. Estirpes que não produzem pyomelanin, pela sua natureza ou devido ao tratamento NTBC, foram mais sensíveis ao estresse oxidativo do que as estirpes que produziram pyomelanin.

Figura 1
Figura 1:. Esquemático de antibiótico ensaio de MIC de 96 poços da placa configurada (A) 100 ul de antibióticos 2x da concentração mais elevada de partida estão na fileira A. Linhas de B a H são cheias com 50 uL de qualquer de LB + NTBC ou LB + DMSO sem antibióticos. (B) Duas diluições em série de dobragem são realizadas em filas A a G, resultando em 50 uL de antibiótico diluído em cada poço a 2 x a concentração final desejada. Row H é um controle bem para bcrescimento acterial sem antibióticos. 50 jil de LB ou inoculo é adicionado aos poços apropriados, diluindo os antibióticos duas vezes, para a concentração final. LB serve como um controlo para a contaminação bacteriana nos antibióticos. Gm, gentamicina; Km, canamicina; Tob, tobramicina.

Figura 2
Figura 2: titulações NTBC de produtores pyomelanin e não-produtores de P. aeruginosa. NTBC reduzida pyomelanin produção de uma forma dependente da dose em laboratório e produtores pyomelanin clínicos, mas não teve nenhum efeito sobre a produção de pigmento em estirpes que não produzem pyomelanin. Modificado de referência 12.

Figura 3
Figura 3: ensaio de placa do ponto por resposta ao estresse oxidativo estirpes bacterianas eram diluído.d para o mesmo DO600, diluída em série de 10 vezes, e manchada em placas de LB contendo várias concentrações de H 2 O 2. Os 0 mM de H 2 O 2 Resultados da placa mostrou que todas as estirpes foram diluídas adequadamente, como indicado por um número semelhante de colónias em cada um dos pontos para a mesma diluição de diferentes estirpes. As placas contendo H 2 O 2 mostram que as estirpes eram mais sensíveis ao stress oxidativo como a concentração de H 2 O 2 aumentou. Isto é indicado pela diminuição da contagem das colónias nos pontos em comparação com o não H 2 O 2 a condição, bem como uma redução no tamanho da colónia. Modificado de referência 12.

A concentração final de NTBC (uM) Volume de NTBC (75,9 mM) para adicionar (ul)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1.318
200 2.64
300 3.95
600 7,91
900 11,86

Tabela 1: As concentrações NTBC para a criação de titulações em LB. Esta tabela dá várias concentrações NTBC ea quantidade correspondente de estoque NTBC para adicionar a 1 ml LB.

A concentração final de H 2 O 2 (mM) Quantidade de 9,79 MH 2 O 2 (30% em peso) para adicionar (ul)
0 0
0,2 2.04
0,4 4.09
0,6 6.13
0,8 8.17
1 10,21

Tabela 2:. As concentrações de H 2 O 2 para adicionar aos LB agar para o ensaio de placa de ponto de stress oxidativo Esta tabela fornece vários H 2 O 2 concentrações e a correspondente quantidade de concentrado H 2 O 2 Para adicionar 100 ml de LB com agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC hpd :: tn - NTBC hpd :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicina 1 0,5 2 2 1 1 0,5 0,5
Kanamycin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramicina 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 0,5

Tabela 3: resultados de MIC antibiótico Três colónias independentes foram testadas em triplicado para cada Stra.no. Re-impresso com a permissão da referência 12.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

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References

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