Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Immunology and Infection

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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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Abstract

Es gibt eine Reihe von seltenen und daher unzureichend bakterielle Pathogene beschrieben, die schwere Infektionen berichtet werden insbesondere bei immunsupprimierten Patienten zu verursachen. In den meisten Fällen nur wenige Daten, meist als Fallberichte veröffentlicht, zur Verfügung, die die Rolle solcher Krankheitserreger wie ein infektiöses Agens untersuchen. Daher wird, um die pathogene Charakter solcher Mikroorganismen zu klären, ist es notwendig, epidemiologische Studien durchzuführen, die eine große Anzahl dieser Bakterien umfassen. Die verwendeten Methoden in einer solchen Überwachung Studie haben die folgenden Kriterien erfüllen: die Identifizierung der Stämme hat genau zu sein nach der gültigen Nomenklatur, sollten sie leicht sein (Robustheit), sparsam in der Routinediagnostik zu handhaben, und sie haben zu erzeugen, vergleichbar Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Im Allgemeinen gibt es drei Strategien für die Bakterienstämme in einer Routineeinstellung identifiziert: 1) phänotypische Identifizierung der BioChemica charakterisierendenl und metabolischen Eigenschaften der Bakterien, 2) Molekulartechniken wie 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und 3) Massenspektrometrie als neuartige Proteom basierten Ansatz. Da Massenspektrometrie und molekularen Ansätzen die vielversprechendsten Mittel zur Identifizierung einer Vielzahl von Bakterienarten sind, sind diese beiden Methoden beschrieben. Die Fortschritte, Grenzen und mögliche Probleme bei der Anwendung dieser Techniken werden diskutiert.

Introduction

Sichere Identifizierung von seltenen Krankheitserregern in der Routinediagnostik wird durch die Tatsache erschwert, dass die klassische kulturelle und biochemische Methoden sind umständlich und manchmal fragwürdig. Darüber hinaus hat ein diagnostisches mikrobiologischen Labor eine große Anzahl von Krankheitserregern zu verarbeiten, von ein paar hundert bis zu mehreren tausend hin, täglich, die die Verwendung von automatisierten Systemen erfordert. Zusätzlich zu der Verwaltung eines hohen Tagesdurchsatz, die genaue Identifizierung von Bakterienspezies erforderlich. Dies ist gerechtfertigt , da sie in ihrer antimikrobiellen Empfindlichkeitsmuster unterscheiden und damit die korrekte Identifizierung liefert dem Arzt wichtige Informationen geeigneten Antibiotika zu wählen (zB Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Automatisierte mikrobiellen Identifizierungssysteme (AMIS) gelten standardisierte Sätze von enzymatischen Reaktionen, die metabolischen Eigenschaften von bakteriellen Isolate zu charakterisieren Beispiel 47 in der GN - Karte der AMIS in dieser Studie verwendeten 52, diese Strategie erlaubt eine sichere Identifikation nur für eine begrenzte Anzahl von Bakterien. Weiterhin wird die Datenbank, ein fortschrittliches Expertensystem fokussiert klar auf der Erfassung der relevanten und hoch relevanten Bakterien von medizinischer Bedeutung 13,15,16,36. Zwei weitere Systeme, die weithin in Laboratorien verwendet werden, gelten auch für diese biochemische Ansatz zur Identifizierung von Bakterien. Jüngste Studien zeigen eine vergleichbare Identifikationsgenauigkeit zwischen den Amis in dieser Studie und einer der Wettbewerber verwendet (93,7% bzw. 93,0%), während die 3. AMIS eine Identifikationsgenauigkeit von nur 82,4% hat auf Art 35 nivellieren. Solche Abweichungen können von der Qualität der zugrunde liegenden Identifikationsdatenreferenzen, die Versionen von Kits und Software, Unterschiede in metabo erklärt werdenlism und Kenntnisse des technischen Personals 35,36.

Zwei automatisierte MALDI-TOF-MS-Systeme (MALDI-TOF mikrobiellen Identifizierungssystem, MMIS) werden hauptsächlich verwendet. Diese Systeme ermöglichen die Erfassung einer großen Anzahl von Bakterienspezies auf der Grundlage ihrer Protein Fingerabdruck-Massenspektren. Zum Beispiel verwendet die Datenbank des MMIs enthält 6,000 Referenzspektren. Identifikationssysteme basierend auf Massenspektrometrie bieten schnelle und zuverlässige Detektion einer Vielzahl von Mikroorganismen , einschließlich seltene Erreger 11,48,51. Bis heute sind nur wenige direkte Vergleiche zwischen den verfügbaren MMIS in dieser Studie und der Wettbewerber verwendet 19,33. Gemäß Daek et al. Beide Systeme bieten eine ähnlich hohe Rate der Identifikationsgenauigkeit, aber die in dieser Studie verwendet MMIs scheint in Speziesidentifizierung 19 zuverlässiger zu sein.

In ähnlicher Weise Adressieren molekulare Techniken gut konserviert, sondern auch verschiedene Gene ( rpoB) ermöglichen eine eindeutige Identifizierung von Arten 3,22,61. Unter diesen ist die 16S - rDNA der am häufigsten verwendete Housekeeping - Gen wegen seiner Präsenz in allen 34 Bakterien. Seine Funktion unverändert bleibt und schließlich mit etwa 1500 bp, das lang genug ist , für Bio-Informatik 14,34 eignen. Viele Forscher betrachten 16S rRNA - Gen - Analyse als "Gold-Standard" für die Identifizierung von Bakterien 21. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass nur wenige Laboratorien DNA-DNA - Hybridisierungstechniken bisher zur Identifizierung von seltenen oder neue Bakterien 14,34 verwenden. Darüber hinaus werden immer mehr Datenbanken verfügbar , die für die 16S - rRNA - Gen - Analyse 50 verwendet werden kann. Sie hat jedoch berücksichtigt werden, dass 16S rDNA basierten Detektionssystemen haben eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber Standard-PCR-Protokolle. Darüber hinaus ist die molekulare Ansatz anspruchsvoll, zeitaufwendig und erfordert gut ausgebildetes Personal sowiegewidmet Laboreinrichtungen und ist daher nicht so leicht in die Routinediagnostik implementiert 55. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, dass die Kombination von mindestens zwei verschiedenen Methoden der Bakterienidentifikation zur hochgenauen Dehnungs Identifizierung führt. Die Kombination von MALDI-TOF MS und 16S-rDNA-Sequenzierung erlaubt die Identifizierung einer großen Anzahl von verschiedenen Bakterienspezies mit hoher Genauigkeit. Vor kurzem hat die Kombination von MALDI-TOF - MS und 16S rRNA - Gen - Analyse wurde 56 zur Identifizierung von Bakterien studieren epidemiologische Fragestellungen und seltene Krankheitserreger vorgestellt.

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Protocol

1. Extraktion von Bakterien-DNA

  1. Herstellung der PBS-Lösung
    1. Wiegen 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O und 8,80 g NaCl in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml. Den pH-Wert auf 7,4. Für die endgültige Verwendung filtern Sie die Lösung durch eine bakteriendichte (0,22 & mgr; m-Filter).
  2. DNA Extraction of Gram-negative Bacteria
    1. Streak das Patientenmaterial auf geeigneten Kulturmedien (zB Columbia - Blut - Agar), zu identifizieren und potenzielle Krankheitserreger zu isolieren.
    2. Bereiten Reinkultur und führen Gram-Färbung , um Morphotyp zu bestimmen und Reinheit zu bestätigen und der Kultur 49.
    3. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie und übertragen es mit einem 1 ul einmaligen Gebrauch Impföse in eine sterile 2,0 ml Reaktionsröhrchen, die 1 ml PBS-Lösung enthält.
    4. Inkubieren diese Suspension in einem thermomixer bei 95 ° C für 10 min. Nach der Inkubation ließ den Bakterienextrakt auf Raumtemperatur abkühlen (die gelöste DNA enthält) und entweder zur Verstärkung oder bei -20 ° C zur weiteren Verwendung (Abbildung 1a) direkt verwenden.
  3. DNA Extraction of Gram-positive Bakterien
    1. Streak das Patientenmaterial auf geeigneten Kulturmedien (zB Columbia - Blut - Agar), zu identifizieren und potenzielle Krankheitserreger zu isolieren. Führen Gram-Färbung, um Morphotyp der Kultur zu bestätigen.
    2. Bereiten Reinkultur und führen Gram-Färbung, um Morphotyp zu bestimmen und die Reinheit der Kultur zu bestätigen.
    3. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen 1 & mgr; l-Impföse und suspendieren es in 500 ul PBS-Lösung in einem 2,0 ml Reaktionsgefäß.
    4. Hinzufügen, 500 & mgr; l Glaskügelchen und übertragen die Röhre zu einer oszillierenden Homogenisators bei maximaler Frequenz betrieben und Amplitude (50 Hz) für 5 min. Verwenden Sie Glasperlen von 1,0 mm Durchmesserdie Bakterienzellwände zu zerstören.
    5. Inkubieren dieses Röhrchen 10 min bei 95 ° C und auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie den Extrakt entweder direkt für die PCR-Reaktion oder bei -20 ° C zur weiteren Verwendung.

2. 16S rDNA-PCR

  1. Herstellung von Amplifikationsprimern
    1. Verwenden Sie den Primer TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) als Vorwärtsprimer und RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') als Reverse-Primer 25. Bereiten Sie eine Grundierung Stammlösung mit DNAse und RNAse freies Wasser, um eine Konzentration von 100 pmol / ul (100 & mgr; M) und verdünnen Sie es weiter zu einer Arbeitslösung bei 10 pmol / ul. Bewahren Sie die Grundierung Lager und Arbeitslösung bei -20 ° C oder direkt verwendet werden.
  2. Herstellung der PCR-Reaktionsmischung
    1. Pipette 1 & mgr; l jedes Primers, 1 & mgr; l dNTP-Mix (100 mM), 2,5 ul der DNA-Extrakt, 5 & mgr; l 10x PCR-Puffer (enthaltend 25 mM MgCl 2), 0,25 ul Taq-Polymerase (5 Einheiten / ul) und 39,25 ul DNase- und RNase - frei PCR Wasser in einen sterilen 200 ul Reaktionsröhrchen.
  3. PCR-Protokoll
    1. Starten Sie die PCR-Programm wie folgt aufgebaut: Zunächst wird ein anfängliches Inkubationsschritt bei 95 ° C für 5 min, die notwendig ist, die Taq-Polymerase zu aktivieren. Zweitens 35 Amplifikationszyklen, enthaltend eine 1 min. Denaturierungsschritt bei 95 ° C, einer 1 min. Primer Temperschritt bei 50 ° C und einem 1,5 min Primerverlängerungsschritt bei 72 ° C. Drittens wird eine abschließende Extension für 10 min bei 72 ° C. Schließlich wird die PCR-Reaktion auf 4 ° C abgekühlt.
      HINWEIS: Staphylococcus aureus und H 2 O dienen als positive und negative Kontrolle (Abbildung 1b).
    2. Das Röhrchen wird die PCR-Reaktionsmischung in den Thermocycler enthält, und das Programm starten.
  4. Reinigung des PCR-Produkts
    HINWEIS: Um das PCR-Produkt, mehrere Protokolle zu reinigen, entwederEnzymbasis oder mit einem Siliciumdioxid Adsorptionsmatrix verwendet werden. Der einstufige verwendet PCR-Reinigung hier verwendet zwei hydrolytische enzymatische Reaktionen. Während Exonuclease I (Exo I) einzelsträngige DNA entfernt, Garnelen alkalische Phosphatase (SAP) hydrolisiert unincorporated dNTPs. Das zweite Verfahren basiert auf einer Silica-Membran-Adsorptionstechnik mit einem hohen Salz schnelle Bindung - waschen - niedrige Elution Zyklus Salz.
    1. In 1,5 ul einer Enzymmischung, die sowohl Exo I und SAP bis 25 & mgr; l PCR-Produkt, gut mischen und in ein Thermocycler ein einfaches Protokoll der ersten 15 min bei 37 ° C, gefolgt von 15 min bei 80 ° C anwenden. Lagern Sie das gereinigte PCR-Produkt entweder bei -20 ° C oder verwenden Sie es direkt als Ziel für die PCR-Markierung.

3. DNA Agarose-Gelelektrophorese

  1. Herstellung des Elektrophorese-Puffer (TBE-Puffer)
    1. Titrieren 54,0 g (445 mM), Tris-Base, 27,5 g (445 mM) Borsäure und 20 ml einer 0,5 M EDTA (10mM) Lösung bei pH 8,0 mit NaOH in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml. Dann verdünnen diese 5x Puffer 1:10 mit destilliertem Wasser (0,5x TBE) für die Elektrophorese.
  2. Herstellung des Loading Buffer
    1. Mischen Sie 250 mg Bromphenolblau, 250 mg Xylolcyanol FF und 15 g Polysucrose (Werkstoff - Tabelle) in einen Kolben. Dann füllen Sie es mit 0,5x TBE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Aliquot der Lade Farbstoff zu 1 ml-Portionen und bei -20 ° C für die weitere Verwendung.
  3. Gießen des Agarosegels
    1. Wiegen 6 g Standard Elektrophorese Agarose zu 300 ml 0,5x TBE-Puffer (siehe Abschnitt 3.1.1) in einen Kolben, eine 2% (w / v) Agarose-Gel herzustellen. Dann legen Sie die Agarose-Gemisch in einem Mikrowellenofen, erhitzen Sie es in der Nähe von Siedepunkt, bis die Agarose vollständig gelöst ist und die Lösung klar erscheint.
    2. Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen ausreichend und fügen Sie 10 ul einer 1% (w / v) Ethidiumbromid Lager solution. Füllen Sie die Lösung in eine gegossene und legen Sie eine Gelkamm (unter Berücksichtigung von 30 Brunnen) in der Besetzung. Nehmen Sie den Kamm, wenn das Gel vollständig erstarrt ist und setzen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer 0,5x TBE-Puffer enthält.
      HINWEIS: Ethidiumbromid ist toxisch und mutagen. Daher sollten Sie sie mit Vorsicht behandelt werden. Es ist ratsam, Nitril-Handschuhe zu benutzen. Es gibt alternative interkalierende Nukleinsäure Flecken, die als nicht-toxische Alternative verwendet werden kann.
  4. Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte
    ANMERKUNG: Um die richtige Größe der PCR-Amplikons zu überprüfen und die DNA-Konzentration das gereinigte PCR-Produkt in einem Agarosegel aufgetrennt wird zu schätzen.
    1. Pipette 2 ul des Beladungspuffers in ein Reaktionsrohr PCR und aus 8 & mgr; l des PCR-Produktes. Pipettieren diese Mischung in die Vertiefungen des Gels. In 8 ul einer molekularen Größe Marker (DNA-Leiter) in einem separaten gut die Größe des PCR-Produkts zu schätzen.
    2. anwendeneine konstante Spannung bei 10 V / cm und sobald der Bromphenolblau-Marker über die Elektrophorese stoppen ¾ der Gesamtlänge des Gels erreicht hat. Visualisieren Sie die getrennten PCR-Fragmente unter Verwendung eines UV-Transilluminator (Wellenlänge 302 nm) und dokumentieren sie ein Gel-Dokumentationssystem verwendet wird. Schätzen Sie die DNA-Menge durch einen visuellen Vergleich mit der DNA-Leiter. Verwenden Sie ca. 10 ng als Ziel für die Kennzeichnung PCR.

4. Sanger-Sequenzierung

  1. Cycle Sequencing PCR
    HINWEIS: Führen Sie die PCR - Markierung in einer 10 ul Reaktion eines kommerziellen Kits (Werkstoff - Tabelle) verwendet wird .
    1. In 2 ul 5x Reaktion Mastermix, 2 ul der DNA-Präparation wurden 1,5 ul TPU1 oder RTU4 Arbeitslösung (10 pmol / ul) und 4,5 ul DNAse und RNAse freies Wasser.
    2. Setzen Sie diese Sequenzierungsreaktionsmischung in einem Thermocycler und führen Sie eine weitere PCR. Insgesamt bestehend Prozess 25 Zyklen eines Denaturierungsschritt (96 ° C,10 sec), einem Glühschritt (45-60 ° C, 5 sek) und einen Verlängerungsschritt (60 ° C, 2 min). Schließlich Abkühlen der Reaktion auf 4 ° C.
  2. Reinigung der Sequenzierungsreaktion
    1. Reinige die Markierungsreaktion Mix mit kommerziellen Spin - Säulen für die PCR - Reinigung (Werkstoff - Tabelle).
    2. Last 10 ul der Sequenzierungsreaktion auf die vorge hydratisierte Gel-Filtrationsmatrix und führen einen Zentrifugationsschritt bei 750 × g für 3 min.
      Hinweis: Durch die Verwendung dieses Verfahrens nicht eingetragene Farbstoffterminatoren in der Gelmatrix zurückgehalten werden.
    3. Dann trocknen die wässrige Eluat in einem Vakuum-Konzentrator. Zentrifuge bei 2.500 xg für 20 bis 30 min bei 40 ° C zur Vervollständigung Trockenheit.
    4. Zugabe von 10 & mgr; l stark entionisierte Formamid dann 2 min bei 90 ° C denaturieren und die Mischung auf Eis kühlen. Je 10 ul der denaturierten Proben auf einer 96-Well-Platte ul. Das getrocknete und gereinigte PCR-Produkt bei -20 ° C, wenn die Analysewerden zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt.
  3. 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und Analyse der DNA-Sequenz
    ANMERKUNG: Führen Sie Analysesequenz auf einem automatischen Sequenzer (Werkstoff - Tabelle). Der Sequenzer hier ist ein automatisiertes Fluoreszenz-basierten Kapillar - Elektrophorese - System , das gleichzeitig vier Proben analysiert (50 cm 4-Kapillar - Array) mit einem flüssigen Polymer 67 (Abbildung 1c).
    1. Legen Sie die Mikrotiterplatte im Sequenzer. Schreibe eine Probenblatt (Plattensatz) wie in 2 gelegt, speichern und starten Sie die Sequenzierung run / Analyse im Anschluss an die angegebenen Schritte in 1.
      HINWEIS: Die Dauer einer Sequenz Lauf ist 2 Stunden und liefert Daten von 800 bis 1.000 bp.
    2. Öffnen Sie die Sequenzanalyse - Software (Werkstoff - Tabelle). Die Sequenzdaten werden als Textdatei (.seq) und eine Datei mit dem Elektropherogramm einschließlich Qualitätswerte (QV) (.ab1) gegeben.
      HINWEIS: Basistelefonie ist automatisch perdurch die Sequenzanalyse - Software gebildet und die darunter liegende Elektropherogramm wird visuell überprüft (beispielsweise die Peakhöhe, Peaktrennung) vor der Sequenz wird für weitere Anwendungen eingesetzt.
    3. Vergleichen Sie die gespeicherten DNA-Sequenz-Datei in der NCBI-nr Datenbank mit BLAST-Algorithmus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

HINWEIS: Das Massenspektrometer verwendet eine 337 nm N & sub2 ; -Laser und wird durch eine spezifische Steuerungssoftware (Materials Table) betrieben. Spektren werden im linearen Modus und einen Massenbereich zwischen 2.000 bis 20.000 aufgezeichnet Da bedeckt ist. Dateninterpretation und Zuteilung von Noten zu den Proben wird in Echtzeit durch eine Analyse - Software (Materials Table) (1d) durchgeführt.

  1. Herstellung von Bakterien für MALDI-TOF-MS-Analyse
    1. Wachsen die Bakterien von Interesse (zB Myroides odoratimimus) auf dem Columbia Blutagar mit 5% Pferdeblut bei 37 ° C für 18 bis 24 h, je nach Bakterienstamm (Abbildung 2a). Führen Gram-Färbung der Morphotyp des Organismus unter Untersuchung sowie Reinheit der Kultur zu überprüfen.
    2. Verwenden Sie einen Zahnstocher für eine einzelne Bakterienkolonie zu einer Vertiefung einer 96-Well - Stahl Ziel übertragen (Abbildung 2b und 2c). Spot 1 ul 70% iger Ameisensäure auf der Oberseite der Luft getrocknet Organismus auf dem Stahl Ziel und nach etwa 2-3 min trocknen.
    3. Dann überlagert die Stelle mit 1 & mgr; l Matrix - Lösung, enthaltend 50 mg / ml CHCA (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) in einem organischen Lösungsmittel (50% Acetonitril, 2,5% Trifluoressigsäure, 47,5% H 2 O).
      HINWEIS: Die Säure-Overlay-Verfahren (auf Plattenherstellungsverfahren) kann die Qualität der Massenspektren zu verbessern verwendet werden. Es hat sich für Gram-positive Bakterien, wie eine "Säureangriff" erhöht sich die Punktzahl va gezeigtLues der gemessenen Spektren 45.
      HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Probenvorbereitungssystem (Materials Table) kann in dem kontaktlos spots von 1 & mgr; l 70% -iger Ameisensäure - Lösung und nach einem ersten Trocknungszyklus, 1 ul Matrixlösung auf dem Bakterien smear angewendet werden. Die Proben werden dann unter standardisierten Bedingungen bei 60% relativer Luftfeuchtigkeit getrocknet und sind bereit für die Analyse zu verwenden.
    4. Lassen Sie den Abstrich mit Matrix der Luft trocknen wieder für ca. 5 min in einer Haube überlagert. Diese bakterielle Abstrich mit der Matrix aufgebracht ist jetzt stabil für viele Stunden.
      HINWEIS: Bakterielle schmiert ohne Matrix nicht stabil sein kann aufgrund von Proteinabbau.
  2. Die Durchführung der MALDI-TOF-MS-Analyse
    1. Einführung von Proben
      1. Öffnen Sie die Steuerungssoftware unserer MMIS (Werkstoff - Tabelle).
      2. Belüften der Probenladeöffnung des Massenspektrometers durch Drücken der IN / OUT-Taste des Gerätes.
      3. Öffnen Sie die Ladeöffnung nach einem Klick und legen Sie die MALDI-TOF-MS-Zielplatte mit dem getrockneten bakteriellen Abstrich und Matrix.
      4. Schließen Sie den Hafen und evakuieren wieder. Beachten Sie Vakuum und bei Erreichen des 4,5 x 10 -6 mbar Messung starten.
    2. Probenanalyse
      1. Öffnen Sie die Analysesoftware unserer MMIS (Werkstoff - Tabelle) und klicken Sie auf das Menü "Datei". Wählen Sie "Neu-Klassifizierung" und ein neues Fenster "MALDI Biotyper Klassifikation Assistent Echtzeit" wird geöffnet. Geben Sie den Namen des Projekts, zum Beispiel "Myroides Messung project_1, im Bereich" Projektname "und drücken Sie die Schaltfläche" Neu ". Unter dem neuen Dialogfeld mit dem Namen" Neues Projekt "Check Projektnamen und gehen Sie durch Drücken der Taste" OK ".
      2. In der "MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit" beachten Sie die "Analyte Platzierung" Fenster geöffnet. Wählen Sie Zielpositionen (zB A1, A2, A3 ...) mit der rechten click jede gewählte Position (mit einem blauen Quadrat gekennzeichnet) und wählen Sie "Proben". In der automatisch geöffnet Tabellenansicht Art der Probenname, Proben-ID und optional einen Kommentar. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter", um fortzufahren.
      3. In der "MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit" beachten Sie die "Auswahl der MALDI Biotyper-Methoden" Fenster zu öffnen. Wählen Sie "Bruker Taxonomy" von "MSPs von Taxonomie Bäume" und klicken Sie auf "Weiter", um fortzufahren.
      4. In der "MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit" beachten Sie die "Projektübersicht" Fenster zu öffnen. Überprüfen Sie die Einträge eingefügt oben für die eigentliche Klassifizierung Projekt. Starten Sie die Klassifizierung laufen durch Drücken der Taste "Finish" (2d - f). Die Messung wird automatisch gestartet, wenn das entsprechende Vakuum erreicht ist.
      5. Folgen Sie der Klassifizierung laufen, bis die Messung erfolgreich abgeschlossen. Sehen Sie sich die Ergebnistabelle in ter "MALDI Biotyper Realtime Klassifizierung Projekt Myroides Messung project_1" öffnen Sie das Menü "Ansicht" und klicken Sie auf "Ergebnisse".
      6. Sehen Sie sich die "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Klassifikation Ergebnisse" als HTML-Datei im Standard-Web-Browser. Drucken und die Ergebnisse speichern.
    3. Messen Sie einen Teststandard täglich vor Analyse zu probieren das Gerät zu kalibrieren und Gerätevalidierung wöchentlich durchführen (Geräteselbsttest).
      HINWEIS: Bei der Messung MALDI-TOF - Spektren werden in Echtzeit durch die Analysesoftware (Materials Table) analysiert. Eine Liste von zehn Arten mit ihren jeweiligen Noten gegeben und wird in das Laborinformationssystem (LIS) für die Berichterstattung eingespeist.
    4. Kritisch zu bewerten die MALDI-TOF MS-Ergebnisse (siehe repräsentative Ergebnisse) und gegebenenfalls auch andere Tests, wie biochemical- und Antibiotikaempfindlichkeitsprofile oder 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und, falls erforderlich, Gram-Färbung füreiner Bakterienart auf die mikrobiologische Bericht zuordnen.

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Representative Results

MALDI-TOF-MS ist eine neue, schnelle und kostengünstige Methode für die mikrobiologische Routinediagnostik. Bakterielle Artbestimmung durch MALDI-TOF - MS - Spektren produziert hauptsächlich aus ribosomalen Proteinen zusammengesetzt , sondern auch andere "sehr konservierten Proteinen mit Housekeeping Funktionen beeinträchtigt in geringem Umfang durch die Umgebungsbedingungen" 17 .Die Datenbank dieser MMIS enthält eine große Menge von Referenzspektren und sogar Bakterien , die in klinischen Isolaten selten gefunden werden , können sicher 7,56,57 identifiziert werden. Score-Werte zeigen die Zuverlässigkeit der identifizierten Arten. Werte über 2,300 stellen eine höchst wahrscheinliche Artbestimmung, eine Punktzahl zwischen 2,000 und 2,300 weist auf eine sichere Artbestimmung, eine Punktzahl zwischen 1,700 und 2,000 steht für eine wahrscheinliche Artbestimmung und ein Wert unter 1,700 ist nicht zuverlässig. Im Falle von mehr als einer Spezies mit einem Score oberhalb 2.000, zusätzliche TES identifiziertts müssen angewendet werden , und dies ist der Grund , warum wir verschiedene Methoden kombiniert haben wie 16S rDNA - Sequenzierung, API und Techniken , um die bakterielle Morpholin und / oder Phänotyp wie Gram - Färbung, Beweglichkeit usw. Bei Adressierung , wo die Partitur ist unten 1,700 die oben genannten Tests verwendet werden müssen zuverlässige Identifizierung von Arten zu erreichen. Eine Kombination von MALDI-TOF MS und 16S - rDNA - Sequenzierung wurde kürzlich 56-58 demonstriert. Es sollte darauf hingewiesen werden , dass klare Richtlinien für den Artenbestimmung auf Basis von 16S rDNA Sequenzhomologien noch 22,61 fehlen. Für die praktische Auslegung, Homologien von ≥97%, wie von Stacke und Göbel 61 vorgeschlagen werden 56 verwendet. Fortschritte in der DNA-Sequenzierung erlaubt die Bestimmung der gesamten bakteriellen Genomen von der nächsten Generation Techniken zu relativ geringen Kosten, und daher im Prinzip Identifizierung von Bakterien auf der Basis ihrer Genomsequenz. Diese Technik wurde bereits verwendet inGenom basieren Ausbruch Management oder in der Epidemiologie 9,29. Jedoch heute die stärkste Einschränkung ist das Fehlen von einfachen 65 - Softwarepakete für den Endbenutzer zu verwenden.

Sieben Beispiele von seltenen vorkommenden Bakterien, isoliert aus Patientenproben während der Routinediagnostik und sowohl durch MALDI-TOF MS und 16S - rRNA - Gen - Sequenzierung sind in Tabelle 1. MALDI-TOF - Spektren von Stamm # 1 bis # 6 sind dargestellt in Abbildung 3 aufgeführten analysiert , und ein Spektrum von Stamm # 7, Sphingobacterium spiritivorum, ist in Figur 1e gezeigt. Alle Isolate zeigen hohe Werte in MALDI-TOF-MS-Analyse und 99 bis 100% 16S rDNA Sequenzhomologien. Somit führen beide Techniken zur Gattung und Art Identifizierung zu sichern. Wie jedoch auf den Vergleich Identifizierungsmethoden von Myroides sp in einer kürzlich erschienenen Publikation hingewiesen., Führte die Kombination von MALDI-TOF - MS und 16S rRNA - Gen - Sequenzierung zuverlässiger rrgebnisse 56. Diese Daten veranschaulichen, dass ein einziges Verfahren verwendet wird, kann nicht immer ausreichend sein, um eine zuverlässige Identifikation Ergebnis zu erzielen. Die Kombination von zwei unabhängigen Methoden führt zu einer höheren Genauigkeit und erweitert die kommerzielle MALDI-TOF - MS - Datenbank mit eigenen Einträgen ergab eine eindeutige Artbestimmung 56.

Der Stamm # 1 wurde als Chryseobacterium gleum identifiziert (MALDI-TOF MS 2,490, Sequenzhomologie von 99% erzielen). Chryseobacteria sind Gram-negative, nicht-fermentierenden Stäbe und bezogen auf Myroides spp. Chryseobacterium spp. werden als neu auftretender Krankheitserreger angesehen, mit Septikämie, Pneumonie und Infektionen der Harnwege verbunden. Die Gattung Chryseobacterium umfasst eine große Anzahl von Arten und die am besten untersuchten Spezies ist Chryseobacterium Indologenes. Ähnlich wie durch Myroides sp verursachten Infektionen., Meist Patienten mit geschwächtem Immunsystem sind betroffen6,10,60. Der Stamm # 2 wurde als Myroides odoratimimus identifiziert (MALDI-TOF MS 2,436 Score, Sequenzhomologie 99%) und Stamm # 3 als Myroides odoratus (MALDI-TOF - MS - Score 2.237, Sequenzhomologie 99%) Myroides sp. sind Gram-negative, nonfermenting Stäbe, die mit schweren Erkrankungen wie Sepsis, Cellulitis oder Pneumonie assoziiert sind. Meist immunsupprimierten Patienten mit hämatologischen sind zugrunde liegenden oder onkologischen Erkrankungen 8,18,42 betroffen. Stamm # 4 wurde als Sphingobacterium multivorum (2,092, 99% Homologie Sequenzwertung MALDI-TOF MS) identifiziert 32,71.

Die Bakterien sind Gram-negative nicht-fermentierenden stangen, die 5,24,44,53 Septikämie bei immungeschwächten Patienten verursachen kann. Zusätzlich wurde ein Fall von fatal Meningoenzephalitis wurde 70 gemeldet. Die Flecken # 5 (MALDI-TOF-MS-Score 2.282, Sequenzhomologie 100%) und # 6 (MALDI-TOF MS 2,289, Sequenz homolog punkteny 100%) als Wohlfahrtiimonas chitiniclastica identifiziert wurden. Diese Bakterien sind kurz, unbewegliche, gramnegative Stäbchen , die von Larven der parasitären Fliege Wohlfahrtia magnifica ersten isoliert wurden und im Jahr 2008 66 beschrieben. Diese Zoonosebakterien werden als neu auftretender Krankheitserreger angesehen und Erreger für Bakteriämie, Septikämie oder Weichteilinfektionen 4,40,64. Interessanterweise berichteten die meisten Patienten waren entweder obdachlos und / oder litt unter Alkoholismus und damit das Auftreten dieser seltenen Krankheitserreger können durch die höhere Rate von Ektoparasiten in der Obdachlosen 4,54 erläutert. Der Stamm # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS 2,269 Score, Sequenzhomologie 100%), ist ein seltenes Krankheitserreger. Andernfalls kann es zu Infektionen bei immunsupprimierten Patienten und erste menschliche Isolate wurden im Jahr 1982 31,71 beschrieben. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht identifiziert Sphingobacterium spiritivorum als Erreger für einen tödlichen Fall von bacTeremia und Sepsis bei einem Patienten mit akuter myeloischer Leukämie 38.

Abbildung 1
Abb . 1: Workflow zur Nukleinsäure und / oder Massenspektrometrie basierte Erkennung von klinisch relevanten Bakterien in der medizinischen Mikrobiologie Labor Ausgehend von einer Reinkultur (a), Ziel - DNA wird in einem Thermocycler amplifiziert (b). PCR - Produkte werden in einem vier kapillare Sequenzer Sanger - Technologie (c) sequenziert. Die Sequenzierung Ergebnisse sind als prozentuale Homologien von Abfragesequenzen Datenbankeinträge von computergestützten Vergleich bestimmt. Eine zweite, Proteomik basierende Methode verwendet Massenspektrometrie (d) und in der Mitte ein massenspektroskopischen Ergebnis der Stamm # 1 in Tabelle 1, Sphingobacterium spiritivorum, einschließlich der MALDI-TOF MS - Score, gegeben (e </ Strong>). Eine Kombination aus Massenspektrometrie und 16S - rRNA - Gen - Sequenzierung kann notwendig sein, um eine zuverlässige und genaue Artbestimmung zu erreichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Fig . 2: Analyseverfahren unter Verwendung von MALDI-TOF MS zur Identifizierung von klinisch relevanten Bakterien Ein Bediener nimmt bakteriellen Ganzzellen - Material (a) mit einem Zahnstocher aus einer Reinkultur (b) und legt Bakterien Ausstriche auf einem Stahlziel (c). Das Stahl Target wird in die Ladeöffnung des Massenspektrometers eingeführt. Wenn die richtige Vakuum von 5 x 10 -6 mbar erreicht ist, wird das Ziel auf der Ionisationskammer bewegt werden. Verwendung eines N 2 -laser, Ionen werden durch weiche Desorption erzeugt , die in einem elektrostatischen Feld (d) , dann beschleunigt werden und in die Flugröhre (e) getrennt. Die Flugzeit (TOF) für die Ionen benötigt , um den Detektor des Flugröhre (f) zu erreichen ist direkt mit ihrer Masse bezogen und bildet die Grundlage für die weiteren Berechnungen von Massenpeaks. Spezifische Erkennungssoftware (Werkstoff - Tabelle) weist dann Score - Werte zu dem Massenspektrum Fingerabdruck von ionisiertem bakteriellen Proteinen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: MALDI-TOF - Spektren und zugeordneten Werte von seltenen Krankheitserreger In dieser Figur repräsentative MALDI-TOF - Spektren der ersten sechs seltene Erreger lis.ted in Tabelle 1 gezeigt. Artname und entsprechenden MALDI-TOF MS - Score in jedem Spektrum zur Kenntnis genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

#3
Belastung MALDI Identifizierung MALDI - Score 16S rDNA Ergebnis BLAST Homologie
# 1 Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum 99% Identität
# 2 Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus 99% Identität
Myroides odoratus 2,237 Myroides odoratus 99% Identität
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% Identität
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% Identität
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% Identität
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabelle 1: Repräsentative MALDI-TOF Ergebnisse seltener vorkommenden Bakterien im Vergleich zu 16S - rRNA - Gen - Sequenzierung.

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Discussion

Sowohl MALDI-TOF MS und 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bieten die Möglichkeit, eine große Anzahl von verschiedenen Bakterien zu identifizieren. MALDI-TOF-MS ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die leicht zu handhaben und große Datenbanken von bakteriellen Massenspektren zur Verfügung. Aus diesem Grund ist MALDI-TOF MS eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode zum Screening Studien konzentrierten sich auf seltene bakterielle Pathogene 17,20,39,51 zuführen. In einer prospektiven Studie MALDI-TOF - MS mit anderen phänotypischen Identifizierungsmethoden zu vergleichen, Seng et al. Gezeigt , Kosteneffektivität und Geschwindigkeit der MALDI-TOF - MS - 59 und Tan et al. Berichteten über eine Reduktion von Reagenz und die Arbeitskosten für die Identifizierung von Bakterien in ihrem Labor Einstellung um 56,9% jährlich 62. Solche Kostensenkungen durch eine Notiz von Gaillot et al unterstützt. 28

Auf der anderen Seite, 16S rDNA-Sequenzierung ist mehr Zeit in Anspruch, mühsam und Optionsscheine spezialisiert pERSONAL die Analyse 34 durchzuführen. Dennoch sind beide Ansätze geeignet für Routinediagnostik und es konnte gezeigt werden , dass die Kombination dieser zwei Verfahren führt zu einer höheren Zuverlässigkeit und sicherer Identifikationsgenauigkeit, die im Fall von zweifelhafter Ergebnisse 56 besonders vorteilhaft ist. Deshalb schlagen wir die Kombination beider Methoden als der beste Ansatz, um die Identifizierung von seltenen vorkommenden Bakterien in der Routinediagnostik zu überprüfen. Für eine zuverlässige Identifizierung von Arten, ist es absolut notwendig, reine Bakterienkulturen zu verwenden, da Mischkulturen Artbestimmung verhindern. Als Plausibilitätsprüfung, Artbestimmung entweder mit MALDI - TOF - MS oder 16S rDNA - Sequenzierung hat 49 in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Gram-Färbung, biochemische Charakterisierung und der klinischen Präsentation sein.

Massenspektrometrie als ein analytisches Werkzeug für die Identifizierung von Bakterien wurde zuerst 1975 vorgeschlagen,51. Es dauerte jedoch bis zum Ende der 1980er Jahre ein praktikables Konzept für die Proteinanalyse zu etablieren. Die "weichen Desorption Ionisation" Technologie wurde im Jahr 1985 63 von Koichi Tanaka eingeführt, die im Jahr 2002 den Nobelpreis für Chemie erhielt, so dass Analyse intakter Proteine. Zur gleichen Zeit wurde die matrixgestützte Ionisation Flugzeit - Massenspektrometrie von Hillenkamp und Karas eingeführt , da sie die ersten waren , die eine organische Säure zu verwenden , Biomoleküle zu analysieren 37 , und dies ist das Verfahren , die heute noch verwendet wird. Obwohl die MALDI - Technologie hat sporadisch 23,30,41 verwendet wurde, dauerte es bis 2004 , als Bruker Daltonics seine Micro MALDI Biotyper - System eingeführt (Pittcon Conference & Expo 2004 Pressemitteilung), das MALDI-TOF - MS - basierte Identifizierung von Mikroorganismen zur Routine geworden Diagnosetechnik 46. Neue Ansätze in der MALDI-TOF-MS-Techniken die Möglichkeit gab, Hefen zu identifizieren, zu erfassen, multi-resistente Bakterienund führen antimikrobielle Empfindlichkeitstests 17,51. Darüber hinaus bieten bestimmte Verfahren die Möglichkeit, direkt Bakterien aus primären Proben wie Urin oder Blutkulturen 17,51 analysieren.

Obwohl die Verwendung dieses Systems hauptsächlich einfach ist, gibt es einige Gefahren, die die Ergebnisse beeinflussen können. Das Alter der Mikroorganismen beispielsweise wirkt sich auf die bakterielle Protein-Expression und somit die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Erstens Wachstumsbedingungen kann ein Problem sein. Als Beispiel Enterobakterien, wie Escherichia coli wachsen schneller als nicht-fermentierende Bakterien (beispielsweise Pseudomonas aeruginos a) und folglich früher 17 analysiert werden müssen. Zweitens besteht die Matrix verwendet für MALDI-TOF-MS von kleinen organischen Säuremolekülen, die eine starke Laser optische Absorption für die Wellenlänge des verwendeten Lasers aufweisen. Vor der Analyse wird die Matrix zu der Probe zugegeben und beide Komponenten durchlaufen eine crystallization Prozess eine feste Lösung zu bilden.

Dies erklärt , warum Änderungen in der Matrix um die Genauigkeit der Identifizierung von Bakterien 17 beeinflussen können. Daher frisch Matrixlösungen hergestellt, die nicht älter als 7 Tage sollte, verwendet werden. Drittens das Medium , aus dem Bakterien aufgenommen werden , können die Identifizierung beeinflussen ergibt 17,68. Zum Beispiel Kristallviolett, die eine Komponente von MacConkey - Agar ist, interferiert mit Massenspektren 17. Zusätzlich zu viele auf dem Stahl Ziel angewendet Bakterien werden niedrigere Werte führen und damit die Identifikationsgenauigkeit beeinflussen. Daher ist es ratsam, eindeutige Kriterien, wie eine Analyse zu definieren, durchgeführt wird. Allerdings sind irreführende Ergebnisse durchgeführt durch MALDI-TOF MS meist durch unzureichende Referenzspektren in der Datenbank enthalten sind verursacht. ( Zur Zeit der Datenbank enthält> 6.000 Einträge) . Dies ist vor allem noch der Fall für die Identifizierung von anaeroben Bakterien 17. Jedoch einusätzliche Spektren können vom Benutzer hinzugefügt werden. MALDI-TOF MS - Bibliothek beispielsweise enthält 98 zusätzliche Referenzspektren von Isolaten , die nicht ausreichend durch die ursprüngliche Datenbank adressiert werden, wie beispielsweise Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. Und Chryseobacterium sp. Folglich werden zusätzliche Referenzspektren auf eine höhere Identifikationsgenauigkeit 59,69 führen. Schließlich sind in einigen Fällen die Spektren verschiedener Spezies sehr ähnlich. Dies kann in Fällen zu Fehlidentifizierung führen wie die Diskriminierung von Escherichia coli und Shigella spp. oder Streptococcus pneumoniae und Streptococcus mitis 17,51.

Die Sequenzierung der 16S rDNA und weitere Gene wie rpoB haben die molekulare Identifizierung von seltenen oder unbekannten Bakterien vereinfacht. Diese Gene sind häufig in den meisten Bakterien und ihre individuellen Funktion istidentisch. Da sie genügend genetische Variabilität zu Ergebnissen führen , besitzen jedoch, die eine Differenzierung auf Gattung und Art Ebene erlauben, können sie für die Identifizierung von Bakterien 34 verwendet werden. Nach Stacke und Göbel, Homologien <97% repräsentieren unterschiedliche Arten 61. Allerdings Homologien> 97% nicht unbedingt auf eine sichere Artbestimmung 34,47 führen. Diese Unsicherheiten haben mehrere Gründe.

Die Qualität der Datenbanken , welche verwendet werden , um die Homologien zu berechnen ist manchmal zweifel 34. In Fällen, in denen hohe Homologien an der 16S rDNA-Ebene vorhanden sind, können Unsicherheiten bei der Bestimmung von Arten führen. Eine Kombination aus verschiedenen genetischen Regionen können deshalb sicherer Ergebnissen führen. Darüber hinaus gibt es keine allgemeingültigen Richtlinien für die Interpretation der 16S rDNA Sequenzdaten 22,34,61. Allerdings wird die Zuverlässigkeit der vorhandenen Datenbanken Erhöhung zu einer höheren accu führenrassig für die Identifizierung von Bakterien 34 dieses molekularen Ansatz. Im Hinblick auf die Sequenzierungsreaktion wir erwähnen müssen, dass die Genauigkeit der Sequenzierung Ergebnisse meist auf die Qualität des zugrundeliegenden PCR beruht. Da ferner die Ergebnisse, indem sie gewonnen werden, um sie zu den Einträgen aufgelistet in öffentlichen Datenbanken verglichen, die Qualität der Sequenzeinträgen und Wartung der Daten ist von entscheidender Bedeutung.

Im Allgemeinen, wenn auch beide Ansätze, MALDI-TOF MS und 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung, haben Vorteile haben sie auch Schwächen. Die Kombination aus beiden Verfahren führt jedoch zu einer hohen Genauigkeit für die Identifizierung von Bakterien. Beispielsweise in einer früheren Studie konnten wir zeigen , daß MALDI-TOF MS der Lage ist , 56 zwischen Myroides odoratimimus und Myroides odoratus zu unterscheiden. In einigen Fällen schlug der MALDI-Score unzuverlässige Identifizierung von Arten, während die von 16S rDNA-Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse könnten die Spezies bestätigenIdentität. Massenspektraldaten Fingerabdrücke dieser Isolate wurden dann in unser MALDI Referenzspektren Datenbank erstellt und eingeführt. Die zukünftige Forschung auf andere seltene Bakterien konzentrieren kann, die Anwendbarkeit der vorgeschlagenen Strategie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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