小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法 * These authors contributed equally

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LaMonte, G., Walzer, K. A., Lacsina, J., Nicchitta, C., Chi, J. T. Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum. J. Vis. Exp. (106), e53214, doi:10.3791/53214 (2015).

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Abstract

鎌状赤血球対立遺伝子(HBS)を担当する遺伝的変異 、P、マラリア原虫による感染に抵抗するために赤血球を可能にします熱帯熱マラリア原虫 。多因子性であることが知られており、この抵抗の分子的基礎は、完全には理解されたままです。最近の研究では、遺伝子調節や寄生虫の成長の両方に影響を与え、一度マラリア原虫に転位、赤血球マイクロRNAの発現差異ことがわかりました。これらのmiRNAは、後寄生虫mRNAの控えめなサブセットと5 'RNAの融合を介してキメラRNA転写物を形成することによりmRNAの翻訳を阻害することが示されました。ここで、技術はPの遺伝子調節および翻訳可能性に赤血球マイクロRNAの基礎となる機能的役割と推定されるメカニズムを研究するために使用されたこと熱帯熱マラリア原虫 、宿主赤血球に変性合成マイクロRNAのトランスフェクションを含め、詳細に説明します。最後に、ポリソーム勾配法は、TRAの程度を決定するために使用されますこれらの転写物のnslation。一緒に、これらの技術は、私たちは赤血球マイクロRNAの調節不全のレベルは鎌状赤血球の細胞固有のマラリア耐性に寄与することを実証することができました。

Introduction

マラリア原虫のアピコンプレクサ寄生虫によって引き起こされるマラリアは、世界的に毎年約200万人が感染し、約60万死亡1を引き起こし 、最も一般的な人間の寄生虫疾患です。ヒトに感染するマラリア原虫 5 のうち、ヒトの疾患に最も関連があるP.熱帯熱マラリア原虫と P.彼らの広範囲の分布および重症マラリアの合併症の可能性のために三日熱マラリア原虫 、。マラリア原虫のライフサイクルは蚊と人間の両方の感染を必要とします。感染した蚊が人間をかむときに、寄生虫は複製の最初のラウンドが発生し、肝臓への血流を通って移動します。ホスト肝細胞からのメロゾイトが破裂した後、彼らは無性や性的いずれかの複製を開始し、近くの赤血球に感染します。 Pに 48時間持続する複製の無性段階、それはほとんどの発作の原因でもあるので、 熱帯熱マラリア原虫は 、この研究の焦点でありますアリアの症状とは、簡単に、in vitroで再現されています。

改善された抗マラリア治療を含む公衆衛生の取り組みの数は、多少グローバルマラリアの負担を低減しているが、薬剤耐性寄生虫の継続的な出現は、マラリア対策への取り組みのための問題を提起します。新しい治療法を提案することができる1つの領域は、遺伝的変異がマラリアに対する耐性を付与する方法、各種の研究です。マラリア流行地域では、赤血球の多型の様々な2,3非常に一般的です。これらの変異は、鎌状赤血球は、おそらく最も顕著であることと、多くの場合、症候性マラリア感染4の発症に対する実質的な抵抗と関連しています。これらはマラリア感染に抵抗するために、赤血球を引き起こすことにより、基礎となるメカニズムは完全には理解されています。ヘモグロビン変異を有する寄生赤血球は、強化された細胞の剛性との脱水反応によってどの強化食作用の対象となりますP.減少侵入に関連しています熱帯熱マラリア原虫 5。 HBCアレルまた、寄生虫の開発6,7を阻害 、赤血球表面および細胞骨格のリモデリングにタンパク質の発現に影響を与えます。最後に、P。熱帯熱マラリア原虫は、(HBSS)ホモ接合鎌内不十分成長マラリア耐性の固有赤血球要因を示唆し、in vitroで 8,9を赤血球。これらのメカニズムのすべてが役割を果たしているように見えるがしかし、それらは完全にマラリアに鎌状赤血球性の背後にあるメカニズムを説明していません。

よくわかっていないまま赤血球要因の一つの潜在的なセットは、成熟赤血球内に存在するmiRNAの大きなプールです。マイクロRNAは、3 'UTR内の塩基対形成による翻訳および/または標的mRNAの安定性を仲介するサイズの小さな非コードRNA、19-25 ntのです。それらは、抑制Oを含む、哺乳動物の免疫応答の制御に関与していますFウイルス複製10、及び植物中で、ウイルスに対する抵抗性を付与することが示されたが、それらはまた、赤血球11,12と鉄代謝13を含むいくつかの赤血球のプロセスを調節することが示されています。以前の研究では、表情劇的HBSS赤血球14,15に変更された赤血球のmiRNAの豊富で多様な集団を同定しました。成熟赤血球が活性転写および翻訳を欠いているので、これらの赤血球のmiRNAの機能的役割は不明なままです。重要な物質交換は、宿主細胞との間で発生するようにP.赤血球内発育サイクル(IDC)16時の熱帯熱マラリア原虫は 、それがのHBs赤血球内の変更されたmiRNAプロファイルは、直接細胞固有のマラリア耐性に寄与する可能性があることが推測されました。

これらの研究は、最終的には、単離し同定および機能m以内のヒトmiRNAの役割を研究するためにパイプラインの開発につながっalaria寄生虫、P。これらのホスト/ヒトmiRNAは、最終的に共有結合ヒューズ、その後翻訳寄生虫mRNA転写物17を抑制することが示された熱帯熱マラリア原虫 、。これは、トランススプライシングにより形成された第1の交差種のキメラ転写物の例を提供し、このmiRNAをmRNAの融合は、他の寄生虫を含む他の種で発生することができることを含意します。すべてのトリパノソーマmRNAはポリシストロン性転写物18の分離を調節するためにスプライスリーダー(SL)とトランス-スプライスされています。 P.ので、 熱帯熱マラリア原虫は、ダイサー/アゴー19,20のためのオルソログを欠いている、それは赤血球のmiRNAがPに類似したSLの機械をハイジャックすることが可能です熱帯熱マラリア原虫は、標的遺伝子に統合します。 P.における最近の研究熱帯熱マラリア原虫は、実際には 5 'スプライスリーダー配列21の存在を示しています。本研究では、トランスクリプトームとtranslaの両方を含む、人間の寄生虫のmiRNAのmRNA融合転写物の発見につながった方法を詳述的な制御技術。これらの方法の全体的な目標は、Pの遺伝子調節、表現型と翻訳電位の低分子RNAの効果を調査するためにあります熱帯熱マラリア原虫の転写産物。

人間寄生虫キメラ転写物の最初の同定は、リアルタイムPCR、トランスクリプトーム配列決定およびESTライブラリ合計と小の両方のRNAを含まキャプチャ、だけではなく、小さなRNAを単離した技術を使用してのようなRNA解析技術の利用に依存。むしろ別々にするよりも、一つの大きなプールで一緒にすべてのRNAを単離する、より大きな配列の一部として、寄生虫の両方に転位し、人間の小さなRNAだけでなく、これらの小さなRNA配列の存在の同定を可能にしました。これは、これら融合体の機能的結果を決定するために、これらの融合mRNAの翻訳状態の分析を必要としました。

寄生虫のゲノムANの特性に関する広範な取り組みながらDのトランスクリプトームは、はるかに少ないPのライフサイクル全体でのmRNAトランスクリプトームの翻訳調節についてはほとんど知られていない、寄生虫の生物学22-25の理解に追加しました熱帯熱マラリア原虫 26。寄生虫のプロテオームのこの限られた理解は寄生虫の生物学の理解と抗マラリア治療薬の次の世代のための新たな標的を同定する能力の両方を妨げてきました。寄生虫の細胞生物学の理解のこのギャップ 、Pの並進規制を調査するために十分な技術の不足によるところが大きい続いています熱帯熱マラリア原虫 。一つの最近の論文ではPのリボソームフットプリントを使用することを記載して熱帯熱マラリア原虫は、グローバル翻訳ステータス21を決定します 。転写物の翻訳可能性の1つのよく確立された測定値は、ポリソームプロファイリングによって決定関連するリボソームの数です。しかし、この技術は、Pに印加されたとき熱帯熱マラリア原虫</ em>の、それはほとんどのポリソームを回復することができず、主にモノソームをキャプチャします。最近、いくつかのグループ27,28は、P 最適化しましたポリソームを維持し、ホスト赤血球28での無性開発中にこれらのマラリア原虫のリボソーム占有および翻訳可能性を特徴づけるために、同時に赤血球および寄生虫を溶解することにより熱帯熱マラリア原虫ポリソーム技術。

まとめると、これらの方法は、ヒトmiRNAおよび寄生虫mRNAの観察された融合が以前に報告された方法27を使用して実証されたものを融合するmRNAの寄生虫タンパク質翻訳を調節する、およびHBAでマラリア抵抗性の主要な決定要因であるとHBSSは17赤血球ことを示しています。これらのメソッドは、それらの融合RNAは、P内にあるかどうかを識別し、機能的RNAスプライシング事象を探求しようとして任意のシステムにおいて有用であろう熱帯熱マラリア原虫または他の真核生物系。

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Protocol

1:Pから小型RNAの単離IDCの間に熱帯熱マラリア原虫

  1. 無性文化29にマラリア原虫を取得します。
    注:必要な培養サイズは、所望の用途に基づいて変化します。しかし、3〜5%の寄生虫血と5%のヘマトクリットで10ミリリットルの文化は、リアルタイムPCR(RT-PCR)のための十分なRNAを提供します。技術は当初、非同期の文化のために最適化されたが、感染サイクル中の特定の時点が所望されるとき、リング段階の寄生虫は、遅くとも10〜12時間後に侵攻よりソルビトール同期で同期することができません。同期は1サイクル(約48時間)29の後に繰り返す必要があります。
  2. プールは一緒に細胞を感染させた(3〜5%の寄生虫血で〜5×10 9個のRBC)と赤の細胞をペレットにブレーキなしで5分間800×gでチューブと遠心分離機の上部に冷PBSを埋めます。
  3. 遠心分離した後、添付、慎重に吸引ピペットを用いて上清を除去し真空に、赤血球ペレットので、取り除くことは容易です。冷たい1×PBSでもう一度、ペレットを洗浄します。
  4. 氷上で30分間再懸濁した細胞(1×PBS中)の冷0.15%サポニンでペレットと場所。
  5. 4℃で12分間、1,500×gで遠心分離細胞は、冷PBSで(色が暗赤色になります)、上清とペレットを再懸濁しを削除します。もう一度この手順を繰り返します。
    注:現在のマイクロRNAは、寄生虫内でマイクロRNAの反射ではなく、赤血球汚染したことを確実にするためには、寄生虫の分離条件の数を試験した:1)サポニン溶解、2)サポニン溶解RNアーゼA宿主細胞miRNAの治療及び3と組み合わせホスト赤血球から寄生虫を除去するための)メチル-β-シクロデキストリン治療。すべての処置は、同様の結果が得られました。
  6. 溶解する溶解緩衝液の推奨600μLを用いて単離し寄生虫ペレット。溶解バッファーのこのボリュームは、1〜2%のヘマトクリットおよび5%の寄生虫で30 mlまでの文化のために十分です。
    注:より大きな寄生虫培養の場合、このボリュームを増加させることができます。それは、少なくとも1分間、徹底的にボルテックスで寄生虫ペレットの完全な溶解を確実にすることが重要です。また、抽出を容易にするために、溶解したサンプルを、1.7 mlのマイクロ遠心チューブに移すことができます。
  7. ホモジネート添加物の60μlの、またはステップ6で使用し、溶解緩衝液の1/10量、(2 M酢酸ナトリウム、pHは4)を追加します。
  8. 10分間氷上でサンプルを残します。
  9. 600μlの、または1分間の各サンプルと渦に酸フェノールクロロホルムの、ステップ6で追加した溶解バッファーの量と同じ量を追加します。
  10. 5分間万×gでサンプルを遠心分離することにより、水相と有機相を分離します。このスピンは、すべてのヘモグロビン/ヘモゾインが有機相であることを保証するために長いキットによって提案よりもです。
  11. 上側(水性)層を回収し、新しいチューブに移します。水相は、白または(可能性が高い)色が茶色である場合は、手順9と10を繰り返して、プロを示唆していますテイン汚染。
  12. ピペットで得られた上清の量を決定した後、100%エタノール(〜800μL)の1.25ボリュームを追加1.7 mlのマイクロ遠心チューブを5回転倒混和。
  13. 14,000×gで遠心分離1分間または真空マニホールドを使用するか、いずれかの方法で(市販されているいくつかの異なるいる)提供RNA結合フィルターカートリッジを通して各サンプルを渡します。
  14. 1分間14,000×gでスピンし、微量を使用してのmiRNA洗浄バッファー1の700μlのフィルターカートリッジを洗浄します。
  15. 1分ごとに14,000×gで遠心分離することによって、二回500μlの洗浄バッファー2/3にフィルターカートリッジを洗浄します。
  16. 1分ごとに14,000×gで遠心分離し、50μlの二回の洗浄では、95ºCに予熱した100μlのDEPC水、で溶出RNA。 260nmでのUV吸光度を介したRNAの濃度を測定します。
    注:RNAゲル(TBE尿素アクリルアミドまたは変性ホルムアルデヒドアガロースゲルのいずれか)は、BができEは、単離されたRNAのサイズ分布を評価するために使用されます。
    注:このRNAは、マイクロアレイ、RNA配列決定、ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイによる分析に適しています。

2:Pから小型RNAの定量IDCの間に熱帯熱マラリア原虫

  1. 260 nmのUV分光光度計を使用して、ステップ1で単離された個々のサンプルの濃度を決定します。
  2. 所望のRNA種のためのリアルタイムPCRプライマーを生成します。 mRNAまたは融合のmiRNA-mRNAについて我々はSYBRグリーンのためのプライマーを設計しながら、一人でのmiRNAのために、我々は、あらかじめ作られたmiRNA定量PCRアッセイを使用していました。逆mRNA配列におけるmiRNA(:ATCGAACATGCTGTGAACAT PKA-R)の下流約100 bpの遺伝子特異的プライマーであった:融合RNAのために、フォワードプライマーは、miRNA配列自体(AAACCGTTACCATTACTGAGTTのmiR-451)でした。
  3. mRNAおよび/またはmiRNAのためのヘアピンのmiRNAのためのプライマー(RNAの20〜40 ngのを使用)単独で、またはランダムヘキサマーのいずれかを使用してRNAサンプルからcDNAを作ります(1μgのRNAを使用して)-mRNA融合種。その後室温までクール、65℃で5分間、RNAおよびプライマーを混ぜます。その後、逆転写酵素ミックスを追加(0.5μlの逆転写酵素を、0.5μlのRNase阻害剤、1μlのdNTPを(各2.5mM)を、4μlの5×バッファー、2μlの0.1M DTT、1μlのH 2 O)。
    1. SYBR緑、TaqMan(登録商標)プローブのいずれかを検出することが可能なサーマルサイクラーで実行したサンプル。 40サイクルの30秒間15秒、30秒、5℃マイナス最小のプライマーアニーリング温度、及び68°Cのための特定の遺伝子のためのSYBRグリーン定量PCR 30 3ステップPCRとして実行され、95°C、用い商業SYBRグリーンマスターミックス。 miRNAのリアルタイムPCRを40サイクル、1分間、二段階PCRとして15秒間95°Cと60°Cを行いました。
    2. ΔΔCT法を用いたアッセイを定量化し、いずれかのRab GTPアーゼ(PF08_0110)または18S rRNAの31に対してそれらを正規化します。

3:はじめにマラリア原虫に小さなRNAの

  1. トランスフェクションあたりの赤血球300μlのペレットブレーキ1で5分間、800×gで遠心分離することによって、完全なマラリア媒体に(RBCの250μlを、約1.5×10 9細胞を、最終的に使用されます)。
  2. RPMI完全なcytomixで再懸濁(120mMのKClで二回赤血球を洗浄し、0.15 mMの塩化カルシウム、10mMのK 2 HPO 4 / KH 2 PO 4、pHが7.6、25mMのHEPES、pHが7.6; 2mMのEGTA、pHが7.6; 5mMのMgCl 2、ブレーキ1で5分間、800×gで遠心分離した後、50%のヘマトクリット値で)KOHを用いてpH調整。
  3. 0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに細胞を移します。
  4. キュベットにカスタム合成オリゴヌクレオチドを​​10μg、または適切な量を、追加して、文化を再懸濁します。
  5. 310 V / 950μFのエレクトロを調整し、各キュベットにパルスを提供します。
  6. 予め温めておいた完全な発作でキュベット内のRBCの300μLを再懸濁アリアメディアおよび24ウェルプレートにプレートして、マラリアの血液ガス混合物(3%O 2、5%CO 2)と密閉容器中、37℃でインキュベートします。
  7. 4時間後、1%のおおよその最終寄生虫に同期後半栄養体でトランスフェクトされた赤血球に感染します。
  8. 感染した培養液に毎4-6日たてのトランスフェクトされた赤血球を追加し、4章で示したように、ヨーヨー-1染色を用いてFACSによる%の寄生虫を決定します。

4:寄生虫感染率に赤血球マイクロRNA効果の決意

  1. 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブにピペットと場所により再懸濁培養物100μlを取ります。 5分間800×gで遠心分離することによって卓上微量で1×PBSおよび遠心分離機の1ミリリットルで二回洗浄します。
  2. 0.025%のグルタルアルデヒド1mlの再懸濁ペレット。室温で20分間サンプルをインキュベートします。
    注:サンプルは、4℃で数週間のためにここに保存することができます。その後、感染したRをペレット5分間800×gで遠心分離することによってのBC。 1×1mlのPBSで二回洗浄します。
  3. 0.015%サポニンの1ml中に再懸濁ペレット。 15分間4℃でインキュベートします。ペレットを5分間800×gで遠心分離することにより赤血球を感染させました。 1×1mlのPBSで二回洗浄します。 Repeat.4.3。 1μL(1,000倍)DNA染色を含む1×1mlのPBSで細胞を再懸濁し。
  4. 488 nm励起と〜530 nMの(FL-1)の発光で、フローサイトメーター上の寄生虫の程度を決定します。
  5. まず、ゲートFSCおよびSSCに基づいて、フローサイトメーターは、赤血球に焦点を当てます。そして、FL-1チャネル内の蛍光によってゲートRBCにおける寄生虫の度(感染赤血球)を測定。
    注:後の段階の寄生虫は、初期段階の寄生虫よりも10倍以上の蛍光であり、非感染赤血球以上〜100倍。また、低速で収集するノイズを低減する傾向があります。最後に、このアプローチは、3 H-ヒポキサンチン取り込みおよびギムザ染色を、以前に報告された13の両方として、すべての技術のGAVと比較されています同様の結果を電子。

5:ビオチンタグおよび溶出のmiRNA-mRNAの融合製品の

  1. 直接共有5 '末端に連結されたデスチオビオチン(DB-)でカスタム合成RNAオリゴヌクレオチドを​​注文。
  2. ステップ3に示すように、デスチオビオチンコンジュゲート(DB-)miRNAおよび未修正のmiRNA(ネガティブコントロール)と非感染赤血球をトランスフェクト。
  3. Pでトランスフェクトされた赤血球に感染0.5%(ステップ1.1)の開始寄生虫に熱帯熱マラリア原虫
  4. ステップ1で前述したように、4日(96時間)後に寄生虫のRNAを抽出します。
  5. 、ストレプトアビジンビーズを充填した50μlの寄生虫RNAの10μgのインキュベートマイクロピペットを介して添加し、4℃で1時間マイクロチューブローテーターで回転させます。
  6. 30秒間800×gでビーズをペレット化し、20mMのKClおよび1 /千のRNase阻害剤で洗浄します。
  7. 2 mMのビオチンとし、200μlのRNAキャプチャ溶出緩衝液(20mMのKCl、1月1日との競合によってビーズから溶出するRNA4で、000のRNase阻害剤および2 mMのビオチン) ℃で一晩回転に。
  8. 示されたPの濃縮度を決定しますステップ2に示すようにのTaqMan qPCRにより、SYBRグリーン定量RT-PCRを用いて、マイクロRNA濃縮(ポジティブコントロール) 熱帯熱マラリア原虫の転写産物。

6:Pのリボソーム占有を決定するためにポリソームの分離熱帯熱マラリア原虫

  1. 15%スクロース溶液5ml(400mMの酢酸カリウム、25mMのカリウムHEPES、pH7.2の、15mMの酢酸マグネシウムを配置し、200μMシクロヘキシミド、1mMのDTT、1mMのPMSF、40 U / mlのRNase阻害剤、及び15%スクロース)SW41超遠心チューブに(14×89ミリメートル)。
  2. 5 mLの注射器を使用して、50%スクロース溶液5ml(400mMの酢酸カリウム、25mMのカリウムHEPES、pH7.2の、15mMの酢酸マグネシウムを追加し、200μMシクロヘキシミド、1mMのDTT、1mMのPMSF、40 U / mlのRNase長いスチール針を使用して、15%のショ糖の下に阻害剤、および50%ショ糖)は、その後、針を取り除きます。
  3. 2時間後、ゆっくりと戻って直立管を傾け、氷にチューブを移す、それは(ステップ14)をロードサンプリングする前に少なくとも15分間冷却すること。
  4. 100〜500の全RNAのμgの、または3〜5%の寄生虫でおよそ100ミリリットル非同期文化を生成するのに十分なマラリア原虫に感染した血液ステージ文化を収集します。 10倍(2ミリモル)、シクロヘキシミド(CHX)を含む培養培地の体積1/10を加え、10分間37℃でインキュベートします。
    1. 遠心分離機(ブレーキ1)で7分間500×gで遠心分離によってペレット培養は、その後、PBSは、200μMのCHXを含む1X室温で二回洗浄します。 200μMのCHXを含む1×PBS中で寄生虫の文化を再懸濁し、氷上で保存します。
    RBCペレットの量を見積もります。溶解緩衝液(400mMの酢酸カリウム、25mMのカリウムHEPES、pH7.2の、15mMの酢酸マグネシウム、200μMのCHX、1mMのDTT、1mMのPMSF、40 U / mlのRNase阻害剤、1%(v / v)のIGEPAL CAを追加4.25 mlの最終容積にRBCペレットを-630、および0.5%(w / v)のDOC)。 4での溶解物をインキュベート 10分間C°回転させながら。
  5. マイクロ遠心チューブにライセートを移し、その後、16,000×gで微量でサンプルを遠心分離し、4 10分間°C。
  6. 冷たい0.5の1.25ミリリットルMショ糖クッション溶液(400mMの酢酸カリウム、25mMのカリウムHEPES、pHが7.2、15 mMの酢酸マグネシウム、200μMのシクロヘキシミド、1mMのDTT、1mMのPMSF、40 U / mlのRNaseをピペットでショ糖クッションを準備SW55の超遠心管(13×51ミリメートル)に阻害剤、および0.5 Mショ糖)。
  7. 慎重に注射器と小さい(〜27)ゲージの針を用いて、スクロースクッションの上に(ステップ7から)溶解液上清の3.75ミリリットルをレイヤー。 STORセクション1に示すように、電子-80℃で残りの溶解液(〜500μl)を、トータルRNAレベルを抽出します。
  8. 4予備冷却、超遠心ローターにサンプルをロードします 13.2ミリリットルのチューブを保持することができます°C、。 366000×gでサンプルを遠心分離し、146分間、4℃。
  9. ピペットを使用して、15mLのコニカルチューブに上清を移します。無料(リボソームによって結合していない)RNAのRNA単離のために-80℃で上清を保管してください。
  10. リボソーム再懸濁緩衝液(400mMの酢酸カリウム、25mMのカリウムHEPES、pHが7.2、15 mMの酢酸マグネシウム、200μMのシクロヘキシミド、1mMのDTT、1mMのPMSF、および40 U / mlのRNase阻害剤)の500μlのリボソームペレットを再懸濁5分間ピペッティングすることによって。
  11. 遠心サンプル16,000×gで微量で4   10分間°C。
  12. パラフィルムを除去し、氷の上でステップ#4から勾配を維持しながら、慎重勾配USIの上にリボソームサスペンションレイヤngの注射器と小さい(〜27)ゲージの針。
  13. 180分200,000×gで4℃でロードされた勾配あらかじめ冷却超遠心ロータと遠心機にチューブをロードします。回転が完了すると、ストアが4で勾配を遠心分離しました ℃の精留塔にロードする直前まで。
  14. 100×10の速度で5分間のRNaseフリー水で洗浄した後、(これは前回の実行で使用するチューブでもよい)、勾配分画に空の超遠心管をロードします。
  15. ステップ6.16で洗浄中は、UV吸光度検出器の感度を設定します。良い出発感度は0.2であるが、これはで調整する必要があり、後(寄生虫番号などによって異なります)、A 254の信号に応じて動作します。
  16. 検出器の感度が設定されると、水が検出器を通過中に、ゼロにベースライン信号を設定します。
  17. フラクションコレクターを洗浄した後、行が空になるまで、流体の流れを逆にして、レム空の超遠心管をOVE。
  18. それは針装置を終了するまでの精留塔を通じて60%スクロース溶液を実行します。
  19. 締めの上にないように注意して、ローディングチャンバの上部に第1の傾きを含むチューブを挿入し、シールを締めます。その後、針でチューブの底を貫通。
  20. 12.5×10への流体の流れの速度をリセット(ポンプの前面に流速コントロールノブによって制御される)、その後、マイクロ遠心チューブに18秒の画分(〜330μL/分数)を収集するために自動化されたフラクションコレクターを設定します。
  21. 前方に60%ショ糖溶液の流れを開始します。
  22. 勾配液の最初の一滴が、マイクロ遠心チューブに低下すると、すぐにフラクションコレクションとA 254信号のライブ録音の両方を開始します。
  23. 急激な低下が50%及び60%スクロース溶液との間のインターフェースに対応して、A 254シグナルにおいて観察されると、流体の流れと254の両方を停止します
  24. -80勾配画分を保存 後で使用するため°C。
  25. 60%ショ糖溶液は、超遠心管から空になるまで、100×10速度で流体の流れを逆にします。
  26. 分画するための追加の勾配が存在する場合、ロード室から空の超遠心管を削除し、ステップ6.21から再起動します。すべてのサンプルが完了している場合はステップ6.16と6.19で行ったように、装置を洗浄します。

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Representative Results

P.中のヒトマイクロRNAのグローバルプロファイリング熱帯熱マラリア原虫

ここに提示された技術は、様々な条件に寄生虫からマイクロRNAを抽出するために使用されました。もう一つ注意すべきは、多くの場合、この記事を最初の研究29の双方に提示マイクロRNAデータの基準点を務め32に示すように、非感染赤血球のためのRNA抽出を行ったということです。これらの以前の研究はまた、HBSS赤血球は、特に、特定のmiRNAのはるかに高いレベルを有したmiR-451ことを実証しました。上に示された技術は、HbSを(のHBAまたはHBSS)感染寄生虫におけるmiRNA豊富の変化を実証するのに十分でした。上に示さおよび18SのrRNAに対して標準としてRNAサンプルを抽出しました。 HBSS赤血球の寄生虫のサンプルは、例えば、のmiR-451( 図1)を含むいくつかのマイクロRNAのレベルの有意な増加を示さありません。ホストerythrからのmiRNAの取り込みocyteも以前の研究34,35と一致しています。

miR-451とHbAA赤血球のトランスフェクションは、HBSS赤血球( 図1)と同様のレベルにHbAAのmiR-451を増加させました。フローサイトメトリーは、その後、寄生虫の成長の際に転位のmiRNAの効果を評価するために、寄生虫感染を測定しました。それに基づいて、のmiR-451、のmiR-223及びmiR-181Aを用いてトランスフェクトHbAA赤血球は、一本鎖DNAオリゴとともに、寄生虫の成長時にマイクロRNAの効果を調べました。のみによって軽減することができたのmiR-451著しく減少寄生虫、とトランスフェクションアンチセンスのmiR-451オリゴを共トランスフェクトしながら- (D図2A)のssDNA又はmiR-181Aのトランスフェクションは、寄生虫に何ら影響を及ぼさありませんでした。

2'-O-MeのアンチセンスマイクロRNAのトランスフェクションによるマイクロRNAのブロッキングは、相反効果を示しました。 HBSS赤血球は、自然に高いのmiR-451のレベルで、トランスフェクトしましたアンチセンスのmiR-451または2'-O-メチルオリゴヌクレオチド( 図3)を有します。 miR-451の阻害は、両方のHBSS赤血球( - F図3C)で寄生虫の増殖を増加させました。寄生虫の割合を平均し、HBSS成長( 図3F)に倍数変化の相対パスとして提示した後、少なくとも3つの独立したトランスフェクションから計算しました。

ビオチン捕獲アッセイによりmiRNAをmRNAの融合RNAのキャプチャー

方法の項5に示すように、5'-デスチオ-のmiR-451(5'Db-のmiR-451)と5'Db-のmiR-181のトランスフェクションの後、それが観測されたmiRNA配列は、ヒトのマイクロRNAと発信することを決定しました。定量RT-PCR分析は5'Db-のmiR-451のトランスフェクションは、PKA-R融合転写物の豊富化( 図4)をもたらしたことを示しました。

Pのリボソーム占有率を決定するためにポリソームの分離熱帯熱マラリア原虫

10トン">典型的な254トレースは最初のA 254。端数密度はグラフ(左へすなわち軽い画分)に左から右に増加すると、( 図5BでのrRNAのコンテンツの北の確認と)、図5(a)に示されています初期の画分中のヘモグロビンによる吸光度に非常に高いですが、すぐにベースラインに低下します。最初の小さなピークが小さいリボソームサブユニット(40S)に対応し、わずかに大きいと大に対応する第2のピークですぐに続きますリボソームサブユニット(60S)。一般的に熱帯熱マラリア原虫の最大である第3のピークは、モノソームピーク(80S)に対応しています。これにより、その高さに、80Sは、UV検出器の感度を調整するためのガイドとして使用してください60Sは60Sと80Sの両方の場合、モノソームピークの開始に「肩」のようにあいまいに知らせるために後続の実行(ステップ6.17)のために。また、原因80Sピークの大きさに、それが一般的です信号が大きいです。

モノソームピークに続いてポリソームに対応するピークです。連続する各ピークは、リボソームの徐々に大きく番号(2,3,4、 等)を表すポリソーム画分を表します。各ポリソームピークは各連続ポリソーム番号が2-3倍の高さに減少させること、また前のピークよりも小さくなります。典型的な実行は、出発物質の大規模な量のいくつかの実行で観察された9マーのポリソームまでのしかし解像度、5-7リボソームからなるポリソームの解像度を可能にします。高次ポリソームは、トレースの残りの部分を構成し、これらの勾配条件下では解決できません。

図1
図1:MIR-451はHBSS赤血球において上昇する IntraparasiticのmiR-451のレベルを、リアルタイムPCRにより測定し、18S rRNAのに対して正規化として、示されているから分離された寄生虫から赤血球タイプ。値は平均±SEです。

図2
図2:通常の赤血球中のmiR-451の過剰発現は、寄生虫の増殖を阻害するには、(A - C)感染率を示す代表的FACSプロットは、合計RBCのパーセンテージとして、示さ赤血球タイプのために、M1で示されています。 (D)複合感染率FACSに由来し、トランスフェクションされていないHbAA赤血球に対して正規化。 Dは平均値±SEである一方で、パネルのACの値は、代表的なFACSプロットされています。

図3
図3:鎌状赤血球中のmiR-451の阻害は寄生虫の増殖を上昇させる(A - E)感染率を示す代表的FACSプロットは、総赤血球の割合として、示さERのために、M1で示されていますythrocyteタイプ。 (F)複合感染率は、FACSに由来し、トランスフェクションされていないHbAA赤血球に対して正規化した値としてプロットしました。パネルA〜Eの値は、代表的なFACSプロットであり、Fは平均±SEです。

図4
図4:のmiR-451のトランスフェクションは、PKA-R融合転写物について豊かと融合したmiRNAが起源で赤血球であることを示しているストレプトアビジンによって捕獲された示されたデスチオビオチンコンジュゲートのmiRNAのmRNA融合転写物の豊富化値は、リアルタイムPCRを用いて測定し、非トランスフェクト寄生虫に対する相対値としてプロットしました。値は平均±SEです。

図5
図5:寄生虫リボソームは、ショ糖勾配を経由して単離することができる(A - B)Examp。熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)から抽出されたポリソームプロファイルのル痕跡。 (関連するリボソームの数を示す#Sと)40S、60S、80Sおよびポリソームピークと熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)から抽出されたポリソームプロファイルの(A)トレース表示。 (B)、リボソーム画分全体の18Sおよび28S rRNAのノーザンブロット。値は平均±SEです。

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Discussion

HbSを、それがPによって引き起こされる重症マラリアに対する保護を提供する主な理由、マラリア流行地域で最も一般的なヘモグロビン変異体の一つであります熱帯熱マラリア原虫P.の遺伝子調節におけるヒトマイクロRNAの役割を特徴づけるために必要な技術熱帯熱マラリア原虫は、この原稿全体に詳述されています。すべての低分子RNAを含むような方法で総RNAを抽出し、かつ比較的簡単寄生虫溶解手順を実行することにより、これらの融合RNAは、独立した、種々の技術により同定することができました。

これらの手順は比較的簡単ですが、適切に従わない場合の問題、汚染に敏感です。寄生虫抽出中、ホスト赤血球を汚染除去するためのサポニンの溶解を行うことが重要です。これは、RNA単離のサポニン溶解工程中に特に当てはまります。宿主赤血球のmiRNAの成分は、大きさGの数オーダーでありますほとんどの赤血球が感染していないことに部分における寄生虫のよりreater、それは、できるだけ多くの赤血球汚染を除去することが重要です。 (感染サイクルの特定のポイントが必要な場合)には、正確なmiRNAプロファイルを得るために、健康な、適切な段階でマラリアの培養を維持することも重要です。同様に、フェノール - クロロホルム抽出の際には、水相がない場合は、残りの汚染を避けるために、フェノール - クロロホルム抽出を繰り返し、明確であると確認するために極めて重要です。

また、デスチオビオチン取り込み実験では、ビオチンの過剰で溶出して、適切な特定の溶出を確実にするように、ストレプトアビジンビーズの最小値を使用することが重要です。ビーズのビオチンとの競争ではなく、完全な変性そのものを介して結合されたRNAの溶出は、飛躍的背景のRNA濃縮を減らすのに役立ちました。最後に、デスチオビオチンの取り込み実験は、強調されましたこれらのmiRNAは、捕獲されたが、いくつかの他の技術はまた、ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイ29としてこれらの融合RNAを、実証するために、以前の研究で使用されたかを実証するための一つの重要な方法をね。修正された転写物を取得するためにトランスフェクトされたマイクロRNAを用いてこのような方法は、トランスフェクトされたmiRNAの輸送およびプロセシングを媒介することができる結合タンパク質複合体の精製などの広い応用を有することができます。

様々なゲノムワイドなアプローチは、マラリアのプロテオームとトランスクリプトーム22-25を研究するために使用されてきたが、Pに翻訳制御を調べるグローバルにいくつかの方法があります21,26 熱帯熱マラリア原虫 。この方法論的制約 、Pの並進規制のグローバルな分析を排除熱帯熱マラリア原虫 。翻訳調節を研究するための最も一般的な実験的アプローチの一つは、全体の翻訳を評価するポリソームプロファイリングであり、アル活動は、関心のある特定のmRNA上にロードされたリボソームに基づきます。この原稿で詳細は、感染赤血球と内寄生虫の両方を溶解するマラリア原虫での使用に最適化されたポリソームプロファイリング方法です。従来の方法は、ポリソームの大部分を回収し、マラリア原虫は、ポリソームの実質的な集団を持っていなかったかのようにそれが見えるまったく見られませんでした。無傷のポリソームの捕捉を可能にする膜結合リボソームを可溶化しながら、酢酸カリウムおよびマグネシウムの高濃度の溶解緩​​衝液を使用することは、赤血球および寄生虫の両方を溶解することが可能となります。

リボソーム精製およびプロファイリングのこの費用対効果の高い方法は、マラリアのトランスクリプトームとプロテオームの間の既存の知識のギャップを埋め、Pの翻訳状態のゲノムワイドな解析を可能にするのに役立ちます熱帯熱マラリア原虫 。このアプローチは、初期および後期段階bの変換状態を比較するために使用されていますloodステージはしっかり遺伝子発現を調整している28、寄生虫。転写物のリボソーム荷重のデータが容易に得られ、特定のmRNAにリボソームの濃度を決定するために分析することができます。ソルビトールの同期と組み合わせるとさらに、リボソーム密度の変化は、翻訳は、寄生虫のライフサイクル全体にわたって調節される方法を確立するために使用することができます。このアプローチを使用してリボソームの単離は、残念ながら、それは実行可能なマラリアのライフサイクルの各段階を制限する培養物を大量に必要とします。入力された大量の材料はまた、 熱帯熱マラリア原虫インビトロ実験室株の両方の使用を制限し、他の感染性生物への適用性を制限することができます。この手順を使用して誰もがまた遺伝子調節の代替モードを反映して、リボソームに関連付けられていない特定の転写産物で、珍しい変換プロファイルを示す遺伝子をスクリーニングすることができるようになります。最後に、このアプローチは、新規抗マラリア薬は、タンパク質の翻訳にどのように影響するかを評価することを可能にし、薬剤耐性の翻訳ベースのメ​​カニズムを識別するために。このパイプラインは、多くの実験系での転写後調節を特定し、決定する際に大きな有用性を有します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.
Diethyl pyrocarbonate Sigma D5758 DEPC
DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)
Yoyo-1 DNA fluorescent dye Thermo Fisher
Gene Pulser II electroporator Bio-Rad
0.2 cm Electroporation cuvettes
4 M potassium acetate Mallinckrodt 6700
2 M potassium HEPES Sigma H0527 pH 7.2
1 M magnesium acetate Sigma M-2545
1 M dithiothreitol Research Products International D11000 DTT
100 mM phenylmethylsulfonate fluoride Sigma P7626 PMSF, dissolved in isopropanol
10% (v/v) Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
10% (w/v) sodium deoxycholate Sigma D-6750 DOC
Cycloheximide Sigma C-7698 CHX
Sucrose Mallinckrodt 8360-04
RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840) Invitrogen 100000840
RPMI-1640 w/ L-glutamine Cellgro 10-040-CV
10% AlbuMAX I Invitrogen 11020-039 w/v in sterile water
Gentamicin Gibco 15750-060
HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)
45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)
1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)
1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)
Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)
Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)
Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)
mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).
5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)
Biotin powder (Sigma-Aldrich)
1 M Potassium Chloride
Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)
Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)
Lysis buffer (see REAGENT SETUP)
15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)
50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)
0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)
60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)
Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)
RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)
RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)
REAGENT SETUP
Solutions
Plasmodium cell culture media
500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine
0.5 ml gentamicin
5 ml HT supplement
2.5 ml 45% glucose
25 ml 10% AlbuMAX I
12.5 ml 1 M HEPES
Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.
Plasmodium cell culture media containing 10x CHX
Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:
2 mM cycloheximide
Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter. 
1x PBS containing cycloheximide
Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.
Ribosome resuspension buffer
400 mM potassium acetate
25 mM potassium HEPES, pH 7.2
15 mM magnesium acetate
200 mM cycloheximide (add fresh)
1 mM DTT (add fresh)
1 mM PMSF (add fresh)
40 U/ml RNaseOUT (add fresh)
Lysis buffer
Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:
1% (v/v) Igepal CA-630
0.5% (w/v) DOC
Sucrose solutions
Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:
15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution
50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution
0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion
As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.
The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components
60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution
RNA Capture Wash Buffer
20 mM  KCl
5 unit/ml Rnase Out (Invitrogen)
RNA Capture Elution Buffer
Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:
2 mM Biotin
EQUIPMENT
SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)
SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)
Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)
Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)
L8-80M ultracentrifuge (Beckman)
Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16 G (Aldrich, cat. no. Z261378)
1 ml syringe with 27 G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)
5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)
Parafilm
Tube rotator, end-over-end
Microcentrifuge, refrigerated
Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)
TracerDAQ (Measurement Computing)
Eppendorf 5810R centrifuge
Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)

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