A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

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Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. M., Jao, C. C., Buchanan, S. K. From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (113), e53245, doi:10.3791/53245 (2016).

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Abstract

Introduction

β-barril OMPs sólo pueden encontrarse en las membranas externas de las mitocondrias, cloroplastos, y las bacterias Gram-negativas 1-3. Mientras que sirven funciones similares como las proteínas alfa-helicoidal, tienen un pliegue muy diferente que consiste en un dominio de β-barril membrana embebido en el centro que van desde 8-26 ß-hebras antiparalelas con cada filamento está íntimamente conectada a las dos hebras vecinas (Figuras 1 y 2). Los primeros y últimos hilos de dominio β-barril entonces interactúan uno con el otro, casi exclusivamente de una manera anti-paralelo (a excepción de VDAC mitocondrial), para cerrar y sellar el dominio β-barril de la membrana circundante. Todas las OMPs β-barril tienen bucles extracelulares de diferente secuencia y longitud que desempeñan un papel importante en las interacciones de ligando y / o contactos proteína-proteína, con estos bucles a veces ser tan grande como 75 residuos, tales como los encontrados en Neisseria transferrina de unión proUna proteína (TbpA) 4. β-barril OMPs también pueden tener extensiones periplásmicas N-terminales o C-terminales que sirven como dominios adicionales para el propósito funcional de la proteína (por ejemplo, BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Aunque existen muchos tipos de OMPs β-barril 11, dos de los tipos más comunes se describen a continuación como ejemplos para aquellos menos familiarizados con el campo, (1) los transportadores de TonB dependiente y (2) autotransporters.

Transportadores TonB dependientes (por ejemplo, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) son esenciales para la importación de nutrientes y contienen un dominio de enchufe N-terminal que consta de ~ 150 residuos que se encuentra escondido en el interior de un C-terminal de 22 varados-β- barril dominio incrustado en la membrana externa 12 (Figura 3). Mientras que este dominio tapón impide sustrato de pasar libremente a través del dominio de barril, la unión del sustrato induce un cambio conformacional en el dominio de enchufe THpor lo conduce a la formación de poros (ya sea por el enchufe o el reordenamiento por la expulsión parcial / completo del tapón) que luego pueden facilitar el transporte de sustrato a través de la membrana externa en el periplasma. Transportadores de TonB dependientes son especialmente importantes para la supervivencia de algunas cepas patógenas de bacterias Gram-negativas tales como Neisseria meningitidis que se han desarrollado transportadores especializados que secuestran nutrientes como el hierro directamente de proteínas del huésped humanos 4,13,14.

Autotransporters pertenecen al sistema de secreción de tipo V de las bacterias Gram-negativas y son OMP ß-barril que constan de un dominio β-barril (típicamente 12-capítulos como con ESTA y PSA) y un dominio de pasajeros que se secreta o presentados en el superficie de la célula 15,16 (Figura 3). Estas OMPs β-barril sirven a menudo un papel importante en la supervivencia celular y la virulencia con el dominio pasajero servir ya sea como una proteasa, adhesina, y / u otro effector que media la patogénesis.

métodos estructurales, tales como la cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN, y microscopía electrónica (EM) nos permiten determinar los modelos de las OMP en resolución atómica que puede a su vez ser utilizados para descifrar exactamente cómo funcionan dentro de la membrana externa. Esta valiosa información puede entonces ser utilizada para el desarrollo de medicamentos y vacunas, si procede. Por ejemplo, de unión a transferrina de proteína A (TbpA) se encuentra en la superficie de Neisseria y no se requiere para la patogénesis ya que se une directamente transferrina humana y, a continuación extrae e importa el hierro para su propia supervivencia. Sin TbpA, Neisseria no puede secuestrar el hierro del huésped humano y se convierten en no patógenas. Después de la estructura cristalina de la transferrina humana unido a TbpA 4 se resolvió, se hizo mucho más claro cómo asocian las dos proteínas, lo que las regiones de TbpA mediada la interacción, lo que los residuos son importantes para la extracción de hierro por TbpA, ycómo se podría desarrollar terapias contra Neisseria dirigidos TbpA. Por lo tanto, dada la importancia de OMPs β-barril en bacterias Gram-negativas para la supervivencia y la patogénesis, así como en las mitocondrias y la función del cloroplasto, y la necesidad de información estructural adicional sobre esta única clase de proteínas de membrana y los sistemas en los que funcionan , protocolos generales se presentan con el objetivo general de expresar y purificar OMP objetivo en niveles altos para la caracterización por métodos estructurales.

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Protocol

1. Clonación y expresión

Nota: Para habilitar los estudios estructurales, cantidades suficientes de proteína altamente purificada se deben preparar, y esto por lo general comienza con la clonación y sobreexpresión de la proteína de membrana externa de destino β-barril (OMP) en E. coli (Figura 4). Hasta la fecha, todas las estructuras de OMP β-barril, incluidas las estructuras de VDAC mitocondrial, se han derivado de la proteína expresada en bacterias 11. Aquí, los protocolos generales se presentan para la clonación y expresión de OMPs β-barril para (1) la expresión nativo directamente en las membranas bacterianas y (2) expresión en cuerpos de inclusiones para el replegamiento in vitro 17.

  1. El diseño de una construcción de expresión
    1. Obtener o comprar el gen OMP objetivo de codones optimizados.
    2. Compra o obtener un vector de expresión T7 (i) que contiene una secuencia señal de localización periplásmica, una etiqueta 6x-histidina N-terminal,y un sitio de proteasa TEV 4,18,19 para la expresión in vivo a la membrana o (ii) sin una secuencia señal de localización periplásmica para la expresión de los cuerpos de inclusión para el replegamiento in vitro.
      Nota: una proteasa N-terminal escindible etiqueta 6x o 10x-histidina proporcionaría un método fácil para la purificación. Al igual que con las proteínas solubles, variar la elección de la etiqueta de afinidad (histidina, Strep, GST, etc.), la posición de la etiqueta de afinidad, y la inclusión de un sitio de proteasa (TEV, enteroquinasa, trombina, etc.) para la eliminación de la etiqueta posterior .
    3. Amplificar por PCR la secuencia diana con los cebadores y subclón apropiados en el vector de expresión. Utilice la ligadura de la clonación independiente (LIC) 20,21 o convencionales técnicas de clonación (restricción enzimas / ligadura) para la subclonación. Sin embargo, LIC puede facilitar de alto rendimiento, lo que permite un gran número de diversos constructos (truncamientos, variedad de etiquetas, variedad de promotores) para ser clonado en paralelo másfácilmente.
  2. En Expresión-dirigida de membrana Vivo
    1. Usa análisis de secuenciación para verificar la diana β-barril OMP se clona aguas abajo y en marco con una secuencia señal (es decir, pelB, OmpA) en la construcción de expresión.
      Nota: La secuencia señal dirige la cadena naciente a la translocon Sec para la secreción al periplasma y posterior montaje en la membrana externa.
    2. Transformar la construcción en una cepa de expresión de bacterias para la expresión pipeteando 1.0 l de plásmido en 50 l de BL21 (DE3) células químicamente competentes y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. Incubar en hielo durante 30 min.
    3. pulso de calor a 42 ° C durante 30 segundos usando un baño de agua y luego se coloca de nuevo en hielo durante 1 min.
    4. Añadir 1 ml de medio SOC precalentado y agitar a 37 ºC durante 1 hora a 1.000 rpm usando un agitador incubador de sobremesa.
    5. Plate 100 l de células en placas de agar LB que contiene un antibiot apropiadoic e incubar durante la noche a 37 ° C invertida.
    6. Realizar pruebas de expresión a pequeña escala mediante la inoculación de un cultivo + antibiótico 5 ml de LB con una sola colonia. Repita durante 5-10 colonias.
      Nota: Debido a la toxicidad potencial de una OMP β-barril y la dependencia de los niveles de expresión basales, a veces se observa la variabilidad de la colonia a colonia. Por lo tanto, la detección de múltiples colonias se recomienda para cada construcción se está probando. Para las pruebas a pequeña escala, en lugar de expresión convencionales 5 ml de cultivos en crecimiento, 25 ml de cultivos en 125 ml de matraces Erlenmeyer se sugiere. Estas condiciones a menudo reflejan mejor lo que sucederá en un crecimiento a gran escala. Además, es una buena idea también la pantalla diversos tipos de medios de cultivo (TB, LB, 2xYT, M9, etc.), ya que se han reportado diferentes niveles de éxito en función de la proteína diana.
      1. Crecer a 37 ° C con agitación hasta una DO600 de 0,6 ~.
      2. Inducir la expresión de la OMP de destino por el anuncianteding 5 l de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a cada tubo de cultivo y se deja crecer un 1-2 hr adicional.
      3. Comparación de niveles de expresión de todas las colonias mediante la centrifugación de 1 ml de cada cultivo (OD 600 de ~ 0,6) durante 1 min a 15.000 xg utilizando una microcentrífuga.
      4. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de tampón de carga 1x SDS-PAGE. Se calienta a 100 ºC durante 5 min y después se centrífuga de nuevo a 15.000 xg durante 5 min.
      5. Analizar las muestras utilizando SDS-PAGE pipeteando 20 l en cada pocillo de un gel de 10%. Dejar correr el gel durante 35 minutos a 200 V. constante
        Nota: Sería beneficioso en este punto para ser capaz de determinar si la proteína objetivo se está correctamente plegada o no. A menudo, esto se puede lograr haciendo purificaciones pequeña escala o ensayando la modificabilidad de calor.
    7. Seleccione la colonia que muestra la mejor expresión y llevar a cabo la expresión a gran escala usando 12-24 l de medio.
      Nota: Los métodos convencionales suelen crecer los cultivos a 37 ° C con agitación hasta una DO600 de 0,6 ~ y luego inducen con un inductor apropiado (es decir, 0,1-1 mM de IPTG o ~ 0,2% de arabinosa) para un 2-4 horas adicionales . Si se desea, antes de la inducción, reducir la temperatura hasta un mínimo de 20 ° C y extender el tiempo de inducción.
      1. Para el método de filtraciones expresión, crecen a 25 ml de cultivo a 37 inoculan ° C en medio LB que contiene el antibiótico apropiado (s) hasta que OD 600 llega a ~ 0,6. A continuación, añadir 1 ml de inóculo a doce frascos de 1 l de medio TB más antibiótico (s) y crecer a 20 ° C hasta la saturación (~ 3 días).
    8. Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min.
    9. Continúe con el paso de purificación Sección 2.1 o congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -80 ºC.
  3. Expresión de Cuerpos de Inclusión para In Vitro Refoltimbre
    1. Utilizar el análisis de secuenciación para verificar la construcción de expresión no contiene una secuencia señal. La ausencia de una secuencia señal dirigirá la proteína diana a acumularse en el citosol como cuerpos de inclusión.
    2. Transformar la construcción de expresión en una cepa de expresión de bacterias para la expresión. Para la expresión de cuerpos de inclusión, lo mejor es controlar la expresión por inducción (es decir, IPTG, arabinosa, etc.) para minimizar los posibles efectos de toxicidad.
    3. Placa de 100 l de células transformadas sobre las placas de agar LB que contenían un antibiótico apropiado e incubar durante la noche a 37 ° C invertida.
    4. Realizar pruebas de expresión a pequeña escala mediante la inoculación de un cultivo + antibiótico 5 ml de LB con una sola colonia.
    5. 1.3.4 repita el paso para 2-4 colonias adicionales.
    6. Crecer a 37 ° C con agitación hasta una DO600 de 0,6 ~.
    7. Inducir con un inductor apropiado durante 1-2 horas.
    8. Comparación de los niveles de expresión para todo tque las colonias mediante análisis mediante SDS-PAGE (véase el paso 1.2.6). Seleccione la colonia que muestra la mejor expresión y llevar a cabo la expresión a gran escala usando 12-24 l de medio.
      1. Cultivar las células a 37 ° C hasta una DO600 de 0,6-0,8 e inducir a 37 ° C durante 3-5 horas. Mientras que la expresión de los cuerpos de inclusión es más robusto que otros tipos de expresión, como con todos los experimentos de expresión de proteínas, la expresión se puede mejorar mediante la variación de medio de crecimiento, el tiempo de inducción, la temperatura de inducción, y la concentración del agente inductor.
    9. Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min.
    10. Continúe con el paso de purificación Sección 2.2 o congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -80 ºC.

2. purificación

  1. Aislamiento de fracciones de la membrana
    Nota: En contraste con las proteínas solubles, las proteínas integrales de membrana están embebidas en la bicapa lipídica y por lo tantorequieren detergentes para extraerlos para la purificación adicional y el análisis (Figura 5). Después de la expresión, la primera etapa en la purificación de una OMP β-barril es la extracción de la fracción de membrana.
    1. Resuspender las células en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, 10 mM MgCl 2, 50 mg / ml AEBSF, 5 mg / ml de ADNasa I) en una proporción de 5 ml / g de pasta celular.
    2. Lyse las células por medio de una prensa francesa u homogeneizador celular. Girar las células lisadas a 15.000 xg durante 30 min a 4 ºC para eliminar las células no lisadas y restos de células.
    3. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y se centrifuga de nuevo a alta velocidad (200.000 xg) durante 1 hora a 4 ºC. El sedimento resultante es la fracción de membrana que contiene la proteína de interés.
    4. El uso de un homogeneizador Dounce, resuspender la fracción de membrana, primero la transferencia de las membranas y, a continuación la adición de tampón de solubilización (50 mM KH 2 PO 4 pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PH 8,0) (50 ml por 20 g de células) a una concentración 2x, sin detergente.
    5. Verter las membranas se resuspendieron en un pequeño vaso de precipitados y añadir detergente (es decir, n-dodecil-β-D-maltósido (DDM), laurildimetilamina-N-óxido (LDAO), n-octil-β-D-glucopiranósido (OG), Triton X-100, etc.) a una concentración final de ~ 10 veces la concentración micelar crítica (CMC).
    6. Rellenar con agua hasta una concentración final de 1 x tampón de solubilización. Se agita durante 0,5 a 16 horas a 4 ºC, dependiendo de la facilidad con se extrae la proteína diana a partir de las membranas.
      Nota: El detergente se utiliza para solubilizar lentamente las membranas para extraer la proteína diana. Hay 3 tipos de detergentes que se pueden utilizar aquí: iónico (SDS, ácido desoxicólico), no iónico (Elugent, TWEEN, Triton X-100, OG, DDM), y de ion híbrido (LDAO, CHAPS). Un complejo de proteína-detergente que es estable y monodispersa durante la etapa de purificación será de gran ayuda en el éxito de crystallizat proteína de membranaion. Más información acerca de los detergentes, sus propiedades, información de CMC, y su uso en la purificación de proteínas de membrana y otras aplicaciones se puede encontrar en los sitios web de proveedores comerciales.
    7. Centrifugar la muestra solubilizada en 300.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. El sobrenadante contiene ahora el objetivo OMP β-barril solubilizada con detergente.
    8. Continúe con la Sección 2.3 se describen a continuación.
  2. El replegamiento de cuerpos de inclusión
    Nota: para el replegamiento in vitro, el objetivo β-barril OMP se expresa directamente en cuerpos de inclusión. Una ventaja aquí es que estas proteínas se pueden producir en niveles elevados. Sin embargo, la desventaja es que el replegamiento es a menudo ineficaz y varía de un experimento de replegamiento a la siguiente. Sin embargo, hay muchos ejemplos de proteínas que han sido replegadas con éxito para estudios estructurales. Después de la expresión en cuerpos de inclusión, se debe ahora aislar los cuerpos de inclusión para el replegamiento experimentos.
    1. Resuspender las células en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, 10 mM MgCl 2, 50 mg / ml de AEBSF, 5 mg / ml de DNasa I, 4 mM 2-mercaptoetanol (BME)) (5 ml por g pasta celular). Lyse utilizando una prensa, ultrasonidos, u homogeneizador celular francés.
    2. Se precipitan los cuerpos de inclusión de un centrifugado a baja velocidad a 6.000 xg durante 10 min a 4 ºC.
    3. Lavar los cuerpos de inclusión resuspendiendo en 25 ml de 1,0 M urea usando un homogeneizador Dounce. Se precipitan de nuevo de un centrifugado a baja velocidad a 6.000 xg durante 10 min a 4 ºC.
    4. Repita el paso 2.2.3, según sea necesario.
    5. Resuspender los cuerpos de inclusión lavados a una concentración final de 10 mg / ml usando tampón que contiene 8,0 M de urea (o 6,0 M de hidrocloruro de guanidinio (GdCl)), además de detergente (es decir, DDM o LDAO) a 2x CMC o superior.
      Nota: Si se desea, para los objetivos de proteínas de membrana que contienen una etiqueta de histidina, la cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) la purificación puede realizarse usando desnaturalización conditions (en urea 8,0 M o 6,0 M GdCl) como un paso inicial similar a la que se describe a continuación en la Sección 2.3.
    6. Realizar la reacción de replegamiento por lentamente (durante la noche) eliminar el desnaturalizante mediante diálisis en tampón que carece del agente desnaturalizante.
      Nota: Puede tomar varios cambios de tampón de diálisis para lograr esto. Alternativamente, si los cuerpos de inclusión se une primero a una columna de IMAC, uno puede hacer la reacción de replegado mientras que todavía atado a la columna mediante el intercambio de tampones lentamente para eliminar el desnaturalizante. En cualquier caso, hay que recordar que se trata de una proteína de membrana, por lo tanto, el detergente debe estar presente para estabilizar el objetivo. Además, si el detergente que se utiliza es dializable, hay que añadir a la memoria intermedia (s) de diálisis también.
    7. Girar las muestras replegadas a 200.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. El sobrenadante contiene la OMP objetivo β-barril solubilizada con detergente replegada.
    8. Continúe con la Sección 2.3 se describen a continuación.
  3. La purificación usando IMAC, intercambio iónico y filtración en gel
    Nota: cromatografía de afinidad con metal Suponiendo que la proteína ha sido diseñado con una etiqueta de histidina, ya sea expresado o replegada de forma nativa utilizando métodos in vitro, a continuación, inmovilizado (IMAC) se lleva a cabo para la purificación al igual que para etiquetadas con histidina proteínas solubles, con la excepción de detergente debe mantenerse en todos los tampones posteriores para mantener la OMP objetivo β-barril solubilizado y estable.
    1. Preparar una columna IMAC 1-5 ml o utilizar una columna preenvasados. Realice los pasos de cromatografía posteriores a 4 ° C. Enjuague con agua para eliminar cualquier rastro de conservantes. Si se utiliza un sistema de purificación automatizada, instalar la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Preparar 500 ml de IMAC Buffer A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% de DDM) y 250 ml de IMAC Tampón B (50 mM de K 2 HPO 4, pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% DDM, y 1,0 M de imidazol).
      Nota: Otros detergentes que pueden ser usados ​​iNCLUDE cimal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), y LDAO (0,05%).
    3. Equilibrar la columna de IMAC utilizando 10 volúmenes de columna de tampón A. IMAC
    4. Añadir imidazol a la muestra de proteína a una concentración final de 25 mM y mezclar. Cargar la muestra en la columna de IMAC equilibrada a 2 ml / min. Recoger el flujo a través.
    5. Lavar la columna de IMAC con 5 volúmenes de columna cada uno de concentraciones crecientes de imidazol usando tampón B (es decir, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Recoge los lavados en fracciones de 2 ml.
    6. Eluir la muestra con una concentración final de 250 mM para 5 volúmenes de columna. Recoger la muestra eluida en fracciones de 2 ml.
    7. Analizar el flujo a través de, las fracciones de lavado y las fracciones de elución mediante el análisis de SDS-PAGE (véase el paso 1.2.6) en función de su absorbancia a 280 nm. Se combinan las fracciones que contienen el OMP objetivo β-barril que se han verificado mediante análisis de SDS-PAGE.
    8. Retire la etiqueta 6x-histidina mediante la adición de la proteasa TEV a la muestra colectiva (de acuerdocon el protocolo del fabricante) e incubando durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
    9. Cargar la solución de muestra / de la proteasa en una columna de IMAC de nuevo para separar el objetivo OMP β-barril (flujo a través) de las etiquetas escindidas y cualquier muestra no escindido. El flujo a través contendrá la muestra escindida que carecen de la etiqueta.
      Nota: Esto también eliminaría cualquier proteasa como TEV-Su, que también tiene un no escindible etiqueta 6x-histidina en sí. De lo contrario, serán necesarios otros métodos para eliminar la proteasa después de la digestión.
    10. Opcionalmente, realizar cromatografía de intercambio iónico para purificar aún más la muestra. Siga las instrucciones del fabricante para la columna que se utilizará, asegurándose de incluir el detergente en todos los tampones.
    11. Para prepararse para la cristalización, cargar la muestra en una columna de filtración en gel en un tampón que contiene el detergente para ser utilizado para la cristalización, tales como 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, 1% OG.
    12. Recoger fracciones de 1 ml y analizar USIEl análisis ng SDS-PAGE (véase Paso 1.2.6) en función de su absorbancia a 280 nm. fracciones piscina con absorbancias a 280 nm, ya que contienen la proteína diana. Se concentra hasta ~ 10 mg / ml.
      Nota: Si se desea, el plegamiento adecuado puede evaluarse utilizando un ensayo de capacidad de modificación de calor como se indica a continuación.
  4. Ensayo de calor modificabilidad
    Nota: Un método para controlar el plegamiento correcto de la β-barril purificado OMP es llevar a cabo ensayos de modificabilidad de calor utilizando un semi-nativo SDS-PAGE 22. A continuación, las muestras no calentadas que se pliegan correctamente típicamente migrar de forma diferente de los que se desnaturalizan calor. Esta propiedad es única para ß-barril OMP y ampliamente utilizado para estudiar esta familia de proteínas de membrana.
    1. Antes de la preparación de muestras, montar el aparato de gel. Para empezar, coloque el depósito de inercia en un cubo de hielo y rodear completamente con hielo. Inserte un reparto en la empresa o en gel con gradiente nativa comercial en el soporte y colocar en el tanque. llenar tél tanque completamente con 1x frío MES Operando Buffer (50 mM 2- [N-morfolino] etanosulfónico, Tris base 50 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, pH 7,3).
    2. Pipetear 0,25 l de la muestra (10 mg / ml) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiquetar uno como "hervido" y el otro como "RT".
    3. Añadir 9,75 l de tampón de muestra a cada uno y mezclar con la pipeta. Para ambas muestras, añadir 10 l de tampón 2x ​​SDS de carga (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% de azul de bromofenol, y 20% de glicerol) y se mezcla suavemente por pipeteado.
    4. Hervir la muestra 'cocido' a 95 ° C durante 5 minutos, dejando la muestra 'RT' a TA. Girar la muestra brevemente 'cocido'.
    5. Carga de 20 l de las dos muestras en el gel nativo premontado. Correr durante 60 minutos a 150 V. constante Quitar el gel y de inmersión en solución de tinción para visualizar los resultados.

3. La cristalización

Nota: Para la cristalización de ambosdianas proteicas solubles y de membrana, es el protocolo estándar para maximizar la pureza de la muestra y la estabilidad (es decir, mejor detergentes, ligandos, cofactores, etc.). La metodología actual para la cristalización de proteínas diana de membrana, en general, abarca tres enfoques principales que satisfagan los requisitos anfifílicas de proteínas bicapa embebido en: (1) de detergente, (2) bicelle, y (3) la fase cúbica lipídica (LCP) (Figura 6) 23. Se recomienda el uso de un robot de nanolitros cristalización cuando sea posible con el fin de aumentar el número de condiciones que pueden ser seleccionados para un volumen de muestra dado, así como, utilizando los avances recientes en herramientas destinadas a ayudar a determinación de la estructura (Figura 7).

  1. Cristalización utilizando Detergentes
    1. Obtener una muestra de proteína solubilizada de detergente que está en ~ 10 mg / ml de concentración. Opcionalmente, añadir el aditivo 1,2,3-heptanotriol directamente a la muestra a una concentración final de 3% para reducir DetergTamaño de micelas ent.
    2. Se filtra la muestra usando un filtro centrífugo 0,22 micras para eliminar las partículas y la precipitación.
    3. El uso de un robot de cristalización, lleve a cabo la cristalización amplia matriz de cribado utilizando comercialmente disponibles pantallas de 96 pocillos, ya sea colgando o método de vaporización gota sentada con gotas compuestas de ~ 200 muestra de proteína nl y tampón de cristalización nl ~ 200.
    4. Se incuban las placas de cristalización a ~ 21 ° C. Inspeccionar las placas semanales para el crecimiento de cristales usando un microscopio estereoscópico.
    5. Optimizar cables de cristalización mediante la variación de los componentes de la condición de cristalización de una manera sistemática (aumento / disminución de sal o concentraciones precipitantes, pH del tampón, temperatura de incubación, y la concentración / o proteína).
  2. El uso de la cristalización bicelas
    Nota: Una demostración más detallada de las técnicas bicelle ha sido previamente descrito por Ujwal y Abramson 24.
    1. Preparar o comprar un 3Mezcla bicelle 5% que consta de DMPC: CHAPSO en una proporción de 2,8: 1 de acuerdo con los protocolos publicados 25. Otras concentraciones también se pueden ensayar, así como, otros lípidos y detergentes, según sea necesario.
    2. Obtener una muestra de proteína solubilizada de detergente que está en ~ 10 mg / ml de concentración.
    3. Añadir la mezcla de bicelle, en hielo, en una proporción de partida de 4: 1 v / v (proteína: bicelle) (por ejemplo, añadir 10 l de mezcla bicelle a 40 l de proteína y mezclar rápidamente mediante pipeteo).
    4. Incubar en hielo 30-60 min.
      Nota: La proteína: bicelle solución debe permanecer mayormente despejado, pero a menudo puede girar ligeramente opaca. Sin embargo, si la proteína: bicelle solución se vuelve lechoso, indicando la precipitación blanco, a continuación, otras variables deben ser ensayados (es decir, detergente, tampón, etc.). Para las nuevas muestras, haciendo pruebas a pequeña escala (proteína de 8 l y 2 bicelas l) se recomienda para verificar la estabilidad antes de la ampliación de la muestra para evitar la pérdida innecesaria.
    5. El uso de un robot de cristalización, lleve a cabo la cristalización amplia matriz de cribado utilizando comercialmente disponibles pantallas de 96 pocillos, ya sea colgando o método de vaporización gota sentada con gotas compuestas de ~ 200 muestra de proteína nl y tampón de cristalización nl ~ 200.
    6. Se incuban las placas de cristalización a ~ 21 ° C. Inspeccionar las placas semanales para el crecimiento de cristales usando un microscopio estereoscópico.
    7. Optimizar cables de cristalización mediante la variación de los componentes de la condición de cristalización de una manera sistemática (aumento / disminución de sal o concentraciones precipitantes, pH del tampón, temperatura de incubación, y la concentración / o proteína).
  3. El uso de la cristalización fase cúbica lipídico (LCP)
    Nota: Una demostración más detallada de las técnicas de LCP ha sido previamente descrito por Liu y Cherezov 26,27.
    1. Obtener una muestra de proteína solubilizada de detergente que está en ~ 20 mg / ml de concentración.
    2. Pre-caliente el monooleına a ~ 40 ºC. Carga60 l monooleína en una jeringa de 100 l hermética a los gases y 40 l muestra de proteína en otra.
    3. El uso de un acoplador de mezcla, conectar las jeringas, teniendo cuidado de no introducir aire.
    4. Mezclar con cuidado mediante la aplicación de presión alternada sobre los émbolos de la jeringa empujando la mezcla de una jeringa a la otra por completo hasta que la muestra se vuelve traslúcido y homogénea.
    5. El uso de un robot diseñado para la cristalización métodos LCP, lleve a cabo la cristalización amplia matriz de cribado utilizando pantallas disponibles en el mercado, así 96 con placas de cristalización de tipo sándwich (0,1 mm de espesor) y con gotas compuestas por 100 muestra de proteína nl y 750 nl tampón de cristalización.
      Nota: ratios de gota se pueden ajustar si es necesario. Además, se recomiendan cubiertas sólidas (es decir, de vidrio o plástico de espesor) que soportan las gotas muy bien en lugar de películas finas, que tienden a permitir que las gotas se mueven sobre la así como las placas se manejan.
    6. Incubar la cristalización plates a ~ 21 ° C. Inspeccionar las placas semanales para el crecimiento de cristales usando un microscopio estereoscópico.
    7. Optimizar cables de cristalización mediante la variación de los componentes de la condición de cristalización de una manera sistemática (aumento / disminución de sal o concentraciones precipitantes, pH del tampón, temperatura de incubación, y la concentración / o proteína).

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Representative Results

Yiur es un dependiente transportador de hierro TonB que es un objetivo de la vacuna contra la supuesta Yersinia pestis. Originalmente fue identificado usando un ensayo de microarrays. Aquí, los pasos que se tomaron para determinar la estructura de yiur utilizando cristalografía de rayos X se describen (Figura 9). Para la clonación, la secuencia de ADN de yiur (menos la secuencia señal N-terminal) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico y se subclonó en un vector que contiene una secuencia señal N-terminal y pelB etiqueta de afinidad 10x-histidina seguido de un sitio de proteasa TEV. Para la expresión, el plásmido que contiene yiur-se transformó en BL21 (DE3) células competentes y una sola colonia se utiliza para hacer crecer un cultivo de 5 ml de arranque a OD 600 ~ 0,5. Doce matraces que contenían 750 ml de medio TB se inocularon con 1 ml del cultivo iniciador y se dejaron crecer durante 3 d a 20 ºC (agitación a 220 rpm). Las células se recogieron a continuación, produciendo alrededor de 150 hasta 200g de pasta celular total, que fue de flash se enfrió en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ºC hasta su uso.

Para la purificación de yiur, 20 g de las células se resuspendieron en 120 ml de 1x PBS (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, pH 7,4) de agitación a RT con DNasa I y se añade AEBSF. La lisis se lleva a cabo mediante dos pases a través de un homogeneizador. El lisado se centrifugó a 12.000 xg durante 10 min (a girar hacia abajo las células sin romper y los cuerpos de inclusión). El sobrenadante se centrifugó de nuevo a 235.000 xg durante 60 min, con el sedimento que contenía la fracción de membrana (yiur). Las membranas se resuspendieron después en 100 ml de 1x PBS usando un homogeneizador Dounce. Yiur fue solubilizado / extraído de las membranas utilizando Elugent al 5% de concentración final, agitación durante la noche (hasta 16 h) a 4 ºC. Las membranas solubilizadas se centrifugaron después de nuevo a 371000 xg durante 60 min, con la SUpernatant que contiene la fracción solubilizada incluyendo yiur. Para aislar yiur, IMAC se realizó usando el tampón A (1x PBS, 0,1% de DDM) y tampón B (1x PBS, 1 M imidazol, 0,1% de DDM), se lavó con concentraciones de imidazol de 30 a 50 mM y se eluyó con 250 a 500 mM . Para eliminar la etiqueta 10x-histidina N-terminal, la incubación con TEV SU proteasa se ​​realizó durante la noche a 4 ºC durante la diálisis en tampón 1x PBS. Después, la muestra se hizo pasar sobre una columna de IMAC de nuevo, el flujo a través se concentró, se dializó, y después se separa adicionalmente usando un gradiente de 0 a 1,0 M NaCl en una columna de intercambio de iones en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Las fracciones que contenían yiur A continuación, se reunieron, se concentraron y corrieron a través de una columna de filtración en gel utilizando 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, y 0,05% LDAO. Las fracciones que contienen yiur A continuación, se reunieron y se concentraron a 10 mg / ml para la cristalización.

A continuación, se realiza la evaluación de matriz amplia y condiciones determinadaque produjo algunos cristales de difracción iniciales. La optimización adicional dio lugar a cristales más grandes que fueron utilizados para recoger los datos de difracción de rayos X nativas. Los cristales que se muestran en la Figura 8 son representativas de los cristales se puede lograr utilizando los métodos presentados aquí. Cristales de cribado detergente y bicelas pueden ser tan grandes como cristales obtenidos típicamente para proteínas solubles; sin embargo, los de LCP son casi siempre mucho más pequeña. Los datos fueron lo suficientemente bueno para ser utilizado para el reemplazo molecular que llevó a estructurar la determinación a 2,65 Å de resolución.

Figura 1
Figura 1. Los dos tipos de proteínas de membrana totalmente integrados son α-helicoidal y β-barril. aquí mostrados son ejemplos de cada uno con el receptor β2-adrenérgico (AP código 2RH1, α-helicoidal) y el transportador TonB dependiente BtuB (AP código 1NQE,ß-barril). La fila superior muestra la vista extracelular mientras que la fila inferior muestra la vista de la membrana. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. OMP β-barril cumplir muchas funciones diferentes y pueden tener diversas estructuras. Mientras que las proteínas de membrana alfa-helicoidal pueden contener uno o más dominios transmembrana, OMPs β-barril van desde 8-26 hebras y cada hebra interacciona íntimamente con los hilos vecinos. residuos de exterior, que interactúan con la membrana, son típicamente hidrófobo mientras que los residuos interiores, que interactúan con el disolvente, son típicamente polar e hidrófila. Fila superior muestra la vista extracelular, la fila del medio muestra la vista de la membrana, y la fila inferior muestra los periplasmivista c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Ejemplos de dos tipos de OMPs β-barril comunes. Izquierda, la estructura del transportador TonB dependiente de la FEPA (AP código 1FEP), que representa el extracelular (arriba), la membrana (centro) y vistas periplásmicas (abajo). El dominio β-barril se indica en verde mientras que el dominio tapón está en magenta. Derecho, la estructura de la Autotransporter ESTA (AP código 3KVN), que representa el extracelular (arriba), la membrana (centro) y periplásmicas vistas (abajo). El dominio β-barril se indica en oro, mientras que el dominio de pasajeros es de color azul. Por favor, haga clic aquí para conocer el Versi más grandesel de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Representación esquemática de la clonación y de expresión para la producción de tuberías de OMPs β-barril. Esquemática de la tubería utilizado para clonar y expresar una OMP de destino ya sea por expresión en la membrana nativa (izquierda) o por expresión en cuerpos de inclusión para el replegamiento (derecha). Por favor clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Representación esquemática de la tubería de purificación para el aislamiento de OMPs β-barril. Esquemática de la tubería utilizada para la extracción de OMPs que se han expresado directamente en la OM. Aquí, el objetivo OMP tiene que ser extractoed de la membrana mediante solubilización con un detergente apropiado y luego purificado por IMAC, cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Esquema de la tubería de cristalización para cristales de OMPs β-barril crecimiento. Tres métodos puede ser utilizado para la cristalización de OMPs β-barril incluyendo la investigación de detergente, bicelas, y la fase cúbica lipídica (LCP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 Figura 7. Nuevas herramientas en la cristalografía que han contribuido significativamente a la estructura determinación de OMP β-barril. Los ejemplos incluyen los robots de cristalización / robots LCP (A), microscopios UV (B), de segundo orden no lineal de imágenes de cristales quirales (SONICC) visualización (C), discos robóticos / robots (D), los métodos / vector / recopilación de datos helicoidal Barrido de (E ), y las vigas microfoco (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. imagen representativa de los cristales resultantes del protocolo. Cristales de cribado detergente y bicelas puede ser tan grande como cristalesobtenido normalmente para las proteínas solubles; sin embargo, los de LCP son casi siempre mucho más pequeña. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9
Figura 9. A partir de constructos a cristales de estructurar la determinación de la meta vacuna putativa yiur de Yersinia pestis. La tubería general utilizado para la determinación de la estructura de yiur, que ilustra los pasos dados para clonar, expresar, purificar, cristalizar, y resolver la estructura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

β-barril OMP cumplen funciones esenciales en bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos y son objetivos importantes para el análisis estructural que ofrecen una gran cantidad de información acerca de los mecanismos moleculares esenciales en las membranas externas de estos respectivos orgánulos. Sin embargo, la producción de suficiente muestra para el análisis estructural no siempre es sencillo y por lo tanto, una tubería en general se presenta para la producción de cantidades suficientes de destino OMP β-barril para la determinación de la estructura, lo que explica en detalle el proceso a partir de construcciones a los cristales. Mientras que estos protocolos se han probado y comprobado que trabaja para la mayoría de las OMP de bacterias Gram-negativas, existen limitaciones en que hay algunos objetivos, en particular para las mitocondrias y cloroplastos, que pueden requerir otros métodos para la expresión y purificación. Por lo tanto, en este caso los métodos deben ser aplicables para la mayoría de los proyectos que involucran OMP de las bacterias Gram-negativas, sin embargo, el nivel de expresións y la cantidad de muestra purificada variarán dependiendo de la OMP de destino.

Existen dos enfoques generales para la expresión de OMPs β-barril para estudios estructurales, (1) la expresión in vivo directamente en la membrana externa y (2) la expresión de los cuerpos de inclusión para el replegamiento in vitro. Para el enfoque de expresión in vivo, OMPs β-barril se dirigen a la membrana externa de E. coli en el que se forma nativa plegadas y aislar directamente a partir de membranas. Expresión de la membrana es el método preferido ya que los objetivos son más propensos a ser plegada correctamente. Si bien este enfoque típicamente produce niveles bajos de proteína total, que evita las complicaciones asociadas a veces con el replegamiento in vitro. Muchos OMPs β-barril se han expresado con éxito en esta forma para la determinación estructural 4,5,11. El éxito se logra a menudo mediante un sistema que se basa en la expresión constitutiva de bajo nivel de un T7 promuevenr, pero hay otros sistemas que se basan en la inducción (es decir, IPTG, arabinosa) para la expresión también se utilizan de forma rutinaria con éxito.

Expresión directamente en la membrana externa requiere la proteína diana para tener una secuencia de señal N-terminal que dirige el complejo de la cadena de ribosomas naciente a la translocon Sec, para la secreción de la naciente OMP β-barril en el periplasma. La secuencia señal se escinde en el lado periplásmico de la membrana interna, lo que es importante que la secuencia de señal de preceder a cualquier etiquetas N-terminales añadidos a la diana. El OMP β-barril naciente es entonces acompañado por chaperones a través del periplasma al complejo BAM para la inserción en la membrana externa de 2,3.

Para objetivos que no pueden ser sobreexpresados ​​en la membrana, un enfoque alternativo es la expresión en cuerpos de inclusión para el replegamiento in vitro 28-30. Este enfoque da lugar típicamente a nivel alto y robusto expresión of la proteína diana. Sin embargo, puede ser difícil de identificar las condiciones de replegado, como replegamiento puede ser ineficiente. Además, puede ser difícil de analizar cuando el objetivo β-barril OMP se pliega correctamente. Sin embargo, hay muchos ejemplos de proteínas que han sido replegadas con éxito para estudios estructurales, incluyendo OmpA 31, 19 Ail, OmpF 32 y 33 VDAC. Para los clones que no expresan en absoluto (forma nativa o en cuerpos de inclusión) o expresan, pero no se montan correctamente en la membrana (nativa), se podría tratar mutando el β-barril para parecerse más a la de E. coli 34,35. La secuencia de aminoácidos en el β-señal del dominio de barril es importante para el reconocimiento y el montaje por el complejo BAM y las variaciones en la secuencia de β-señal puede afectar significativamente tanto la biogénesis y de expresión adecuados niveles de la OMP objetivo β-barril 11,34 , 35. La integración adecuada de los destinatarios β-Barrel OMP se puede monitorizar mediante el cribado para el fraccionamiento de la membrana y de extracción de detergente seguido por ensayos de modificabilidad calor.

La cristalización de proteínas de membrana en presencia de micelas de detergente es la técnica más antigua y permite una fácil adaptación de los equipos de cristalización de proteínas soluble tradicional y estrategias. Al enmascarar la membrana regiones incrustadas con moléculas de detergente, se concentró la proteína puede ser tratada de una manera similar a las proteínas solubles (por ejemplo, mezclados con aguas madres de cristalización y encerrados en un aparato de difusión de vapor que causa la lenta deshidratación de la gota de proteína). Mientras que es simple en concepto, características propiedades detergentes y añaden una capa significativa de complejidad en la parte superior de los retos de cristalización normales. Específicamente, el carácter molecular de un detergente debe adaptarse empíricamente a una proteína diana dada, incluyendo el tamaño de la micela, la polaridad grupo de cabeza (aniónicos, catiónicos, no iónicos, ode ion híbrido), y la longitud de cadena de hidrocarburo, como cada uno de ellos afectan a la estabilidad de la proteína de la membrana diana en disolución. Los inconvenientes de este enfoque incluyen el ambiente químico no nativo, el potencial de oscurecimiento de zonas superficiales que podrían formar contactos de cristal, y los problemas de concentración de detergente.

Bicelas son una mezcla de lípidos y anfífilos (por ejemplo, detergentes o lípidos de cadena corta) que se ensamblan en partículas individuales que imitan una estructura de bicapa similar a las membranas que se encuentran en las células 36,37. Las máscaras de anfífilo el núcleo hidrofóbico de esta bicapa donde se expone en sus bordes de una manera similar a las micelas en la cristalización de detergente. Esto proporciona un entorno más similar a la nativa para ayudar a estabilizar las proteínas diana.

Dianas de proteínas de membrana también se pueden cristalizar con (LCP) métodos en fase cúbica lipídico 38. LCP es una mesofase formada por la mezcla de lípidos y agua, enel que una bicapa continua está permeado por dos redes que no se cruzan de canales de disolvente. Esta estructura tridimensional permite la difusión de lípidos incrustado proteínas de la membrana en un entorno en gran medida similar a la nativa y permite contactos de cristal para formar entre las superficies hidrófobas e hidrófilas de las proteínas y disminuye el contenido de disolvente total de cristales al tiempo que mejora su pedido. Desde su introducción en la década de 1990, las técnicas de LCP han sido críticos en la determinación de las estructuras de muchas de las metas de proteínas de membrana esquivos, como rhodopsins 39,40 y 41-43 GPCRs. El uso de LCP en pantallas de alto rendimiento requiere disposiciones especiales (es decir, robot-LCP específica, Jeringas de gas, LCP herramienta de dispensación, placas de cristalización sándwich, etc.) como la monooleına gruesa utilizada para el LCP no pueden ser manejados por el manejo de líquidos nanolitros tradicional robots.

cromatografía de filtración en gel es un paso muy importantepara la cristalización de proteínas de membrana en general porque proporciona información sobre cómo estabilizar el detergente elegido es para el objetivo de la proteína de membrana, que puede ser visualizado por el cromatograma. Mediante la comparación de la cantidad de muestra en el volumen vacío, tiempos de retención y formas de los picos, la estabilidad general y monodispersidad de la muestra se puede acceder. Una muestra ideal tendría muy poca o ninguna muestra perdido en el volumen vacío y tendría un solo pico de elución simétrica con una distribución de Gauss. El detergentes C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), y LDAO (0,05%) se utilizan de forma rutinaria para la cristalización de las OMP β-barril con éxito y son buenos para empezar. Idealmente, experimentos a pequeña escala se realizan comparando varios detergentes o mezclas de detergentes para determinar cuáles son los más apropiados para la cristalización. Los que se encuentran para ser más estabilizando luego son utilizados para preparaciones a gran escala del destino β-baOMP RREL y para los ensayos de cristalización.

Una vez que los cristales se forman de la OMP objetivo β-barril, optimización de plomo (es decir, la detección aditivo, crio-detección, la detección aditivo de detergente, etc.) y otras técnicas similares a dianas proteicas solubles puede ser seguido con algunas diferencias. Sin embargo, hay algunos avances recientes que son extremadamente útil cuando se trabaja con proteínas de membrana. Específicamente, los cristales de proteínas de membrana a menudo puede ser difícil de detectar dentro de su licor madre para una variedad de razones. Las proteínas de membrana a menudo se forman cristales relativamente pequeños y los falsos positivos pueden desviar la optimización de cristal. técnicas LCP especialmente presentan retos adicionales, teniendo en cuenta los entornos de alta viscosidad, a menudo opacas en el que se cultivan los cristales. Las estrategias para abordar estos temas incluyen el uso de microscopios ultravioletas (UV) en conjunción con los microscopios de luz, permitiendo que los cristales de proteínas naturalmente fluorescentes para distinguirse from sal no fluorescente y cristales de detergente (Figura 7). Retos siguen siendo, sin embargo, en la identificación positiva de cristales de proteínas que se forman dentro de los campos de precipitación. Los cristales también pueden ser detectados por la explotación del efecto de duplicar la frecuencia de la mayoría de los cristales quirales cuando fotografiada por pulsos láser de femtosegundo de exploración, que se aplica por la tecnología SONICC 44. Esta alta resolución, alto contraste técnica se puede utilizar para distinguir cristales submicrónicas de condiciones que oscurecen.

proteínas de membrana La recolección se realiza mediante técnicas de cristalografía estándar, sobre todo para el detergente y la cristalización bicelle. Bucle se realiza a mano usando un microscopio de bajo aumento y un bucle de cristal de montaje (es decir, fibra de nylon, alambre, o polímero). Que absorbe el exceso de disolvente y la protección crio antes de sumergirse en la congelación de líquido criogénico son también procedimientos estándar cuando se cosecha cristales OMP β-barril. Sin embargo, la cosechaING de cristales de LCP crecido presenta problemas particulares, especialmente si cosechando directamente a partir de placas sándwich, en forma de cristales pueden ser difíciles de acceder y no puede ser fácilmente observado a través del microscopio. Además, los cristales crecidos en LCP a veces se deben cosechar en mayor ya que la mezcla LCP no se puede separar fácilmente dentro del bucle.

La recogida de datos para OMPs β-barril se puede realizar como con cristales de proteínas solubles con sólo unas pocas consideraciones adicionales. Mientras que el tamaño de los cristales cultivados por métodos detergentes y bicelle son a menudo comparables a aquellos cultivados con proteínas solubles, cristales cultivados por el método de LCP son casi siempre significativamente menor. Además, ya que las muestras cosechadas de matriz LCP menudo contienen múltiples cristales que son difíciles de observar, hay que utilizar fuentes de sincrotrón que tienen capacidades de rastering de mini-haz y de bucle que puede escanear sistemáticamente todo el bucle para localizar las posiciones de los cristales sobre la base de Diffracción (Figura 7). El pequeño tamaño de los cristales de LCP también los hace especialmente susceptible al daño por radiación. Por lo tanto, los datos de varios cristales a menudo se fusionan con el fin de recoger un conjunto completo de datos.

Una vez bien cristales de difracción se obtienen y se recoge un conjunto de datos completo, determinación de la estructura para OMPs β-barril se puede realizar usando los mismos procedimientos que para proteínas solubles, teniendo en cuenta que los cristales de proteínas de membrana generalmente exhiben un mayor contenido de disolvente. Al igual que con todos los objetivos de cristalografía, si la proteína soluble o proteína de membrana, cada uno ofrece sus propios desafíos y por eso hay un solo ducto puede aplicar directamente a todos los objetivos. Por lo tanto, es el trabajo del investigador (s) primaria para adaptar estos protocolos generales en consecuencia para garantizar el éxito de su / su proyecto.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystallization Robot TTP Labtech, Art Robbins - Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler Eppendorf, BioRad -
Media Shaker New Brunswick, Infors HT -
UV-vis spectrometer Eppendorf -
SDS-PAGE apparatus BioRad 1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels BioRad, Life Technologies 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime GE Healthcare -
AkTA Purifier GE Healthcare -
Microcentrifuge Eppendorf -
Centrifuge (low-medium speed) Beckman-Coulter -
Ultracentrifuge (high speed) Beckman-Coulter -
SS34 rotor Sorvall -
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter -
Type 70 Ti rotor Beckman-Coulter -
Dounce homogenizer Fisher Scientific 06 435C
Emulsiflex Avestin -
Dialysis tubing Sigma D9652
LCP tools Hamilton, TTP Labtech -
VDX 24 well plates Hampton Research HR3-172
Sandwich plates Hampton Research, Molecular Dimensions HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets Grace Bio-Labs 875238
HiPrep S300 HR column GE Healthcare 17-1167-01
Q-Sepharose column GE Healthcare 17-0510-01
Crystallization screens Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions -
Gas-tight syringe (100 ml) Hamilton 

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References

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