جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

قمنا بتطوير بروتوكول تحسين الحالية مضغي الجسم (EB) الثقافة التي تسمح للدراسة التنظيم الذاتي، والتماثل كسر، واستطالة المحورية ومواصفات مصير الخلية باستخدام مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) في الثقافة تعليق. يتم تجميع أعداد صغيرة من mESCs في المتوسط ​​القاعدية لمدة 48 ساعة في لوحات 96-جيدا معاملة غير الأنسجة الثقافة، U القاع، وبعد ذلك هم أكفاء للرد على الإشارات التجريبية. بعد العلاج، وهذه المجاميع تبدأ تظهر علامات الاستقطاب التعبير الجيني وتغيير تدريجيا التشكل من كتلة كروية من الخلايا ل، هيكل منظم بشكل جيد ممدود في غياب إشارات التباين الخارجية. هذه الهياكل ليست فقط قادرة على عرض علامات الطبقات الجرثومية الثلاث، ولكن بنشاط عرض الحركات الشبيهة تكون المعيدة، يتضح من الخلع الاتجاه من الخلايا الفردية من مجموع المباراتين، والذي يحدث بشكل حاسم في منطقة واحدة من هيكل ممدود. هذا protocيوفر رأ طريقة مفصلة لتشكيل استنساخه من هذه المجاميع، والتحفيز مع إشارات مثل تفعيل WNT / β-Catenin وBMP تثبيط وتحليلها من قبل واحدة الوقت نقطة أو الوقت الفاصل بين فلوري المجهر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تعديلات على إجراءات الجنين تلوين كامل جبل الماوس الحالية لتحليل immunocytochemical من علامات محددة ضمن المجاميع الثابتة. التغييرات في مورفولوجية والتعبير الجيني وطول المجاميع يمكن قياسها كميا، وتوفير المعلومات حول كيفية إشارات يمكن أن يغير مصير المحورية. ومن المتوقع أن هذا النظام يمكن تطبيقه على حد سواء لدراسة أحداث التنموية في وقت مبكر مثل تطوير محوري والتنظيم، وعلى نطاق أوسع، وعمليات التنظيم الذاتي واتخاذ القرارات الخلوية. وقد تقدم مكانة مناسبة لتوليد أنواع الخلايا الموجودة في الجنين التي لا يمكن الحصول عليه من ثقافة ملتصقة التقليدية مثل الحبل السري والخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري.

Introduction

دراسة وفهم القرارات خلية مصير في التنمية الثدييات المبكرة يمكن الاستفادة من الثقافات من الخلايا الجنينية الجذعية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، والسكان نسيلي المستمدة من الكيسات الأريمية التي لديها القدرة على الذات تجديد وتميز في جميع أنواع الخلايا في كائن حي أي.، فهي 1،2 المحفزة. في حين كانت هذه الثقافات، وستستمر في أن تكون مفيدة لفهم الأساس الجزيئي للقرارات الخلية مصير، أنهم غير قادرين على إعادة إنتاج بعض الترتيبات المكانية والسلوكيات العالمية التي يتم إنشاؤها في الأجنة أثناء تكون المعيدة. في الجنين، فإن عملية تكون المعيدة تحول طبقة واحدة الظهارية في الطبقات الجرثومية الثلاث المتميزة ويمنح الجنين مع منظمة الأمامي الخلفي العلنية 3-5. وقد وضعت محاولات لتلخيص هذه الأحداث خارج الجسم على توليد المجاميع ثلاثية الأبعاد من المجالس الاقتصادية والاجتماعية، ويشار إلى الهيئات مضغي باسم (EBS)، وتعريضهم رس ظروف التمايز 6،7. هذه المجاميع يمكن أقنع على التمايز إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، وبعضها إما غير قادرين على الحصول عليها أو التي يسببها مع انخفاض الكفاءة في ثقافة ملتصقة أو لا يمكن أن يتم إنتاجها على الإطلاق؛. على سبيل المثال، الدم 8 والجرثومية البدائية خلايا 9. وجود قيود على استخدام EBS ومع ذلك، هو أنهم غير قادرين لعرض السلوك تخلقية، توزيع طبقة الجرثومية أو منظمة المحورية التي هي الخصائص الرئيسية للالجنين النامي، مما أدى إلى سوء التنظيم المكاني 6،10. في تقرير واحد، وعلاج EBS مع WNT يؤدي إلى الاستقطاب ضعيفة في التعبير الجيني في بعض المجاميع ولكن يتم احترام أي التشكل واضح 7. المزيد من التقارير الأخيرة، EBS التي تم تربيتها لفترات طويلة من الزمن في تطوير الهياكل الأمامية مثل شبكية العين، القشرة والخلايا الحسية الأذن الداخلية، والتي تحاكي نظيراتها الجنينية ولكن تتطور دون سياق تنظيم، محوريأيون 11-13.

وقال تقرير ماريكاوا وآخرون 14، بينما تعمل مع مجاميع من الماوس P19 الأجنة سرطان (EC) الخلايا التي شكلتها طريقة اعدام الإفلات، حسبما ذكرت وظهور هياكل ممدود من أصل أرومية متوسطة تذكرنا الاستطالة التي لوحظت مع exogastrulae في البرمائيات والأجنة قنفذ البحر وكيلر إإكسبلنتس 15-18. وبما أن هذا لم وحظ مع الماوس الجنينية الخلايا الجذعية (mESCs)، حاولنا إعادة إنشاء السلوك لاحظ مع P19 خلايا EC باستخدام الركام من mESCs 19 ونفيدكم الظروف والثقافة التي تؤدي إلى التماثل على كسر ومحوري استطالة. فارق هام من العمل مع الخلايا P19 هو أن البروتوكول تجميع الموصوفة هنا يتم تنفيذ في لوحة 96-جيدا، مماثلة لتلك التي وصفها Eiraku وآخرون 20، بدلا من شنقا قطرات. أدى هذا التغيير في زيادة كفاءة من حيث الانتعاش الكلي وفي كل منداخل وبين تجريبي التكاثر. الأهم من ذلك، الحفاظ على المجاميع في الآبار الفردية يضمن أن الاندماج بين الركام (شيوعا عند تجميع الركام من قطرات شنقا) لا يحدث. بالإضافة إلى ذلك، سمة رئيسية من البروتوكول هو 24 ساعة من التعرض للCHI99021 GSK3 المانع (تشي)، منشط قوي للWNT / β-Catenin الإشارات، بعد التجميع.

الطريقة الموصوفة هنا يوفر أساسا لفهم عمليات التنظيم الذاتي، والتنظيم المحوري والجرثومية طبقة المواصفات في الثقافة، والسماح الاستدلالات إلى بذل المتعلقة بالتنمية المحورية في الجسم الحي 19،21. لهذه الأسباب الأسلوب لديه القدرة على إجراء تحليل مفصل الآلية من العمليات التي قد يكون من الصعب للدراسة في الجنين. وعلاوة على ذلك، تطبيق المحتمل في توليد الأنسجة والأعضاء التي لا يمكن الحصول عليها بسهولة في ثقافة ملتصقة نظرا لعدم وجود محراب الخلوية المهيكلة مثلالحبل الشوكي سلائف 21 والحركية الخلايا العصبية. ثقافة الإجمالية ثلاثي الأبعاد يوفر الهيكل المادي والبيئة مما يشير إلى أن قد لا تكون قابلة للتحقيق بالوسائل التقليدية، مما يؤدي إلى اتباع نهج جديد لاشتقاق الأنساب الجنينية بطريقة نظمت مكانيا.

Protocol

1. شروط الثقافة قبل التجميع

  1. الحفاظ على mESCs في ESLIF المتوسطة (انظر الجدول مواد محددة والمعدات اللازمة لصياغة) على قوارير المغلفة الجيلاتين 25 سم 2 يعالج الأنسجة الثقافة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 21-25 فبراير.
  2. تنمو الخلايا لمدة سنتين على الأقل الممرات الرد على ذوبان الجليد قبل استخدامها في هذا البروتوكول. الخلايا في الممرات السفلية عادة ما تكون أكثر نجاحا في توليد خصائص قابلة للتكرار في جميع أنحاء مكررات التجريبية (أي، أي أكثر من 15 فقرات في الثقافة)، والتباين مهما كان طفيفا بين مختلف ES خلية خطوط أمر متوقع (انظر الجدول 2 للخطوط الخلايا اختبار ).
  3. تنمو الخلايا إلى 40-60٪ confluency لا تستخدم خلايا الإفراط في متموجة لتجميع.

2. جيل من المجاميع

  1. PBS قبل الدافئة (+ كا 2+، + المغنيسيوم 2+)، ESLIF، N2B27 26،27
  2. نضح مستنبت من قارورة زراعة الأنسجة (الخطوة 1.3). شطف القارورة بلطف مع 5 مل PBS، مرتين. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 1-2 مل من قبل تحسنت التربسين-EDTA (0.25٪) لفصل الخلايا.
    1. ضع قارورة في الحاضنة لمدة <مدة 5 دقائق أو حتى الخلايا قد فصل تماما من سطح القارورة. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 1 مل لتوليد تعليق خلية واحدة لحساب دقيق وتشكيل موحدة حجم الكلي.
  3. تحييد التربسين مع 5-10 مل ESLIF. غسل أسفل سطح النمو لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخلية ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إزالة قسامة 1 مل من أنبوب الطرد المركزي وعدد الخلايا مع haemocytometer.
  4. تحديد حجم تعليق المطلوبة لتوفير 10 خلية / ميكرولتر (كلها لوحة 96-جيدا تتطلب 5X10 4 الخلايا في 5 مل تعليق). عدد الخلايا بدقة، كما deviat كبيرةالأيونات من عدد الخلايا ذكر يمكن أن يؤثر سلبا على استجابة المجاميع للمؤثرات.
  5. إضافة 5X10 4 الخلايا إلى 5 مل PBS قبل تحسنت في الطازج 50 مل أنبوب الطرد المركزي وتدور في ~ 170 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. نضح بعناية PBS وإضافة 5 مل قبل تحسنت PBS بلطف. لا تعكير صفو بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في ~ 170 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. نضح بعناية PBS للمرة الثانية. إزالة PBS أكبر قدر ممكن من دون إزعاج بيليه كما PBS المرحل يمكن أن تؤثر سلبا التجميع. resuspend الكرية أولا في 1 مل N2B27 دافئة مع ماصة P1000 لتوليد تعليق خلية متجانسة، تليها أخرى إضافة N2B27 إلى الحجم المطلوب (على سبيل المثال، إضافة 4 مل ل5X10 4 خلايا / 5 مل تعليق).
  8. نقل تعليق خلية إلى خزان معقم وماصة قطرات 40 ميكرولتر في الجزء السفلي من كل بئر من غير الأنسجة الثقافة المعالجة، 'U'القاع-96-Wالذراع لوحة باستخدام ماصة الأقنية. تغطية لوحة 96-جيدا مع غطاء المقابل، وتأكد من وجود الخلايا مع مقلوب مقعد بين كبار المجهر (الشكل 1B).
    ملاحظة: من الضروري أن يتم استخدام هذه اللوحات للحد من إمكانية خلايا الانضمام. لا معطف أسفل لوحة 96-جيدا مع الجيلاتين، فيبرونكتين] أو أي طلاء الأخرى التي تعزز التصاق الخلايا.
  9. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لتجميع.

3. تطبيق المحفزات وتغيير المتوسطة

  1. بعد فترة الحضانة 48 ساعة، نلاحظ ظهور mESCs داخل كل بئر من لوحة 96-جيدا لتأكيد تجميع ناجحة (الشكل 1E). ملاحظة: سوف تظهر المجاميع كروية في الطبيعة، وحوالي 150-200 ميكرون في القطر. الرجوع إلى قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا كانت المشاكل تنشأ (الجدول 1).
  2. 0؛ إضافة 150 متوسطة الثانوي الطازجة ميكرولتر (3 ميكرومتر Chi99021 (تشي) في N2B27 19؛ الأسهم التي أعدت في 10 ملم في DMSO) إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. ماصة مع ما يكفي من القوة لطرد أي المجاميع التي ربما تكون قد بدأت في الانضمام إلى الجزء السفلي من الآبار. احتضان المجاميع في المتوسط ​​الثانوي لمدة 24 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (الشكل 1A).
    ملاحظة: يتم إنشاء المجاميع ممدود والاستقطاب للإنتاج باستخدام هذه الوسيلة الثانوي. كما يمكن استخدام التراكيب المتوسطة الثانوية الأخرى حسب الظروف التجريبية المطلوبة ويتم عرض الأمثلة في الشكل (3).
  3. تغييرات المتوسطة لاحقة، واستخدام ماصة الأقنية التي عقدت في زاوية (حوالي 30 درجة) لإزالة بلطف 150 ميكرولتر من المتوسط ​​الثانوي من جانب كل بئر. ثم، ماصة 150 ميكرولتر جديدة N2B27 في كل بئر مع ما يكفي من القوة لطرد أي المجاميع التي قد يكون لها بدايةإد على الانضمام إلى الجزء السفلي من الآبار.
  4. كرر نقطة 3. 3 كل 24 ساعة حتى للدوام كاملة (طول نموذجي من تجربة ثقافة الإجمالية 120 ساعة).
    ملاحظة: تأكد من الركام وتتحرك بحرية بعد التغييرات المتوسطة لضمان استنساخ والاتساق داخل وبين كل لوحة 96-جيدا. يجب تغيير المتوسطة يوميا بعد فترة التجميع.

4. إعداد المجاميع المناعية وتحليل من قبل متحد البؤر المجهر

  1. تثبيت والابتدائي جسم الحضانة
    ملاحظة: تم تعديل بروتوكول صفها AK Hadjantonakis 28 لتناسب المناعية من مسك المجاميع. لالأجسام المضادة المستخدمة عادة في دراساتنا والتخفيفات، وتشير إلى سبق نشرها العمل 19،21،24،25،29 والجدول 3.
    1. استخدام ماصة الأقنية التي عقدت في زاوية (حوالي 30 درجة) لإزالة بلطف 150 ميكرولتر المتوسطة من الجانب سو كل بئر من لوحة 96-جيدا. يغسل مرتين من قبل pipetting 150 PBS ميكرولتر في كل بئر. ترك بضع دقائق بين كل غسل للسماح المجاميع ليستقر.
    2. تعيين ماصة P1000 الاستغناء 200 ميكرولتر، ونعلق المقابلة طرف ماصة وقطع حوالي 3 ملم من نهاية طرف مع زوج من مقص العقيمة. رسم جزء من برنامج تلفزيوني داخل كل بئر من لوحة 96-جيدا بطريقة قصير في تلميح وطرد لتستنهض الهمم مجموع المباراتين.
    3. استخدام نفس تلميح إلى وضع وحدة التخزين بالكامل داخل البئر بما في مجموع المباراتين وماصة صغيرة (30 مم) الزجاج ذبابة الفاكهة تشريح جيدا. نقل جميع المجاميع من لوحة 96-جيدا أن سيخضع الأنظمة المناعية متطابقة في نفس الزجاج تشريح جيدا.
      ملاحظة: استخدام قطع ماصة جديدة طرف عند نقل الركام من ظروف تجريبية مختلفة لمنع ترحيل للركام.
    4. وضع جيد الزجاج الذي يحتوي على aggregatوفاق على المجهر تشريح. دوامة الزجاج جيدا لإجبار المجاميع إلى المركز ونضح PBS من جانب واحد من البئر مع كوب ماصة باستير. استخدام المجهر لضمان عدم يستنشق المجاميع. ترك كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني داخل البئر الزجاج لتغطية الركام لمنعهم من الجفاف.
    5. إضافة 1 مل الطازجة الفورمالديهايد (4٪) الذائب في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة. ومن المعروف امتصاص العرق لتكون حساسية، مسرطنة وسامة: الحذر. ارتداء الحماية المناسبة أثناء المناولة.
    6. بعد التثبيت، نضح الحل الفورمالديهايد بنفس الطريقة كما هو موضح في القسم 4. 1. 4 وغسل الركام مع 1 مل PBS ثلاث مرات، و 10 دقيقة لمع كل غسل، على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة.
    7. نضح PBS كما هو موضح في القسم 4. 1. 4 وإجراء ثلاثة، 10 دقيقة يغسل مزيد مع PBS تحتوي على 10٪ من الجنين مصل بقري و 0.2٪ تريطن X-100 (PBSFT). أداء دقيقة يغسل 10 على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة.
      ملاحظة: استخدام من الجنين مصل بقري (FBS) النتائج في غسل العازلة واضح، والحد من عدد من المجاميع التي لولاها أن تضيع خلال بروتوكول إذا تم استخدام الحليب. ومن المهم أن نلاحظ أنه بعد التثبيت، إجراءات المناعى يمكن القيام بها بطرق مختلفة غير تلك المفصلة أدناه وينبغي تحديد والأمثل من قبل المحقق.
    8. منع المجاميع لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في PBSFT على الروك المداري لتعيين سرعة منخفضة. قد يكون مؤقتا البروتوكول في هذه المرحلة، والمجاميع منعت O / N، مع التحريض المستمر على لفاف الروك الأفقي في 4 درجات مئوية.
    9. نضح PBSFT كما هو موضح سابقا (انظر القسم 1. 4. 4)، واحتضان المجاميع مع 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية اللازمة مخففة في PBSFT O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة. مع تغطية فيلم البارافين لمنع التبخر.
  2. جسم الحضانة الثانوية
    1. نضح حل الأجسام المضادة الأولية ويغسل مع 1 مل PBSFT (في 4 ° C) على النحو التالي: مرتين لمدة 5 دقائق. ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة. و6:56 مرات لمدة 1 ساعة. تنفيذ كل خطوة الغسيل في 4 درجات مئوية، وعلى الروك المداري المقرر أن سرعة منخفضة. ملاحظة: البرد غسل المتوسطة قبل استخدامها. عدم تنفيذ يغسل على الجليد كما يمكن أن يسبب هذا الركام إلى جزء.
    2. نضح المتوسطة غسل النهائي واحتضان المجاميع مع الأجسام المضادة الثانوية المطلوبة في 500 ميكرولتر PBSFT O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام على لفاف الروك الأفقي. إضافة النووية وصمة عار مثل هويشت إذا لزم الأمر.
  3. تصاعد والتصوير التي كتبها متحد البؤر Microcopy
    1. غسل الركام كما هو موضح في القسم 4. 1. 4 مع 4 ° C PBSFT. بعد غسل النهائي، وشطف الركام مع 1 مل PBS تحتوي على 0.2٪ FBS وتريتون X-100 (PBT) على النحو التالي: مرتين لمدة 5 دقائق. ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة. أداء يغسلفي RT على الروك المداري محمية من الضوء.
    2. نضح المتوسطة كما هو موضح سابقا (القسم 4. 1. 4)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام مع 1: الحل 1 من الجلسرين: PBT (1 مل) تليها الثانية الحضانة 30 دقيقة مع 7: حل 3 من الجلسرين: PBT (1 مل).
      ملاحظة: مزيج من الجلسرين والحلول PBT في 4 درجات مئوية باستخدام المدورة.
    3. نضح الجلسرين النهائي: حل PBT واستبدالها مع 1 مل تصاعد المتوسطة 24. قد يكون مؤقتا البروتوكول في هذه المرحلة قبل التركيب (إذا توقفت، وختم الآبار مع فيلم البارافين وتخزين الآبار تلطيخ في 4 درجات مئوية).
    4. جبل المجاميع على الشرائح المجهر من قبل pipetting لهم في 17 قطرات ميكرولتر مع طرف قطع P20 (الشكل 2). أضعاف الشريط على الوجهين مرة أخرى على نفسه أربع مرات لتوليد الفواصل ونعلق على كل نهاية الشريحة. ضع ساترة العليا (22 ملم × 60 ملم) على هذه الفواصل (الشكل 2).
      ملاحظة: من الضروري أن خفض غيضتستخدم في هذه المرحلة حتى لا تتلف العينات. الفواصل تمنع ساترة سحق الركام.
    5. مرة واحدة هي التي شنت على المجاميع، وصورة العينات باستخدام المجهر متحد البؤر باستخدام بروتوكولات الموصوفة سابقا 19،21،24،25. وبمجرد وضعها على المجهر، وترك الشريحة دون عائق على المسرح لبضع دقائق للسماح للمجاميع ليستقر داخل المتوسطة المتزايدة.

Representative Results

ظهور الخلايا مباشرة بعد الطلاء وبعد تجميع

مباشرة بعد الطلاء، يمكن للمرء أن يلاحظ وجود خلايا واحدة داخل كل بئر من لوحة 96-جيدا مع معيار مقلوب الأنسجة الثقافة المجهر (الشكل 1B). في غضون 8 ساعة من الطلاء، وبدأت هذه الخلايا أن ينزل إلى أسفل بسبب جيدا لخطورة وسيكون قد بدأت تتجمع في مجموعات منفصلة (الشكل 1C). بعد 24 ساعة، فإن الخلايا ائتلافه قد أكملت التجميع الرئيسي، وسوف يكون ضغط في واضحة المعالم، وحدات بعد خشنة حيث الخلايا الفردية هي غير واضحة عن بعضها البعض (الشكل 1D). وبحلول نهاية اليوم الثاني (48 ساعة)، ينبغي أن المجاميع تبدو "نظيفة"، بعد أن تناولها كل الخلايا داخل البئر (الشكل 1E)؛ أسفل البئر قد يكون لها بعض الخلايا التي تم تسليط من مجموع المباراتين في هذه المرحلة. توفيرأن المجاميع تم تجميعها في N2B27، في هذه نقطة في الوقت، ينبغي أن تكون كروية، ما يقرب من 150-200 ميكرون في القطر، وتتحرك بحرية داخل البئر (أي، لم تلتزم قاع الآبار). تجميع في وسائل الإعلام الأخرى (أي.، ESLIF أو N2B27 مع عوامل معينة) لديه القدرة على تغيير كل من التشكل الكلي الأولي والاستجابة للمؤثرات اللاحقة (تيرنر وآخرون، قيد الإعداد).

ممثل المورفولوجية التغييرات

إضافة نبض 24 ساعة من المتوسطة الثانوية التي تحتوي على شي ما بين 48 و 72 ساعة (الشكل 1A، 5A) يولد اضحة المعالم المجاميع ممدود التي تظهر التعبير الاستقطاب في علامات معينة من طبقات جرثومية 19،21. مباشرة بعد نبض تشي (72 ساعة)، وسوف تبدأ المجاميع لإلقاء الخلايا والبدء في إظهار استجابتها لهذه الإشارات في نهاية هذا اليوم (الشكل 3A). هذه الردودتتجلى من خلال التغيرات في التعبير الجيني والتشكل، وكلاهما يعتمد على العلاج الذي المجاميع قد تلقت بعد فترة التجميع 48 ساعة الأولي في N2B27 (الشكل 3B). إذا كنت بحاجة فقط إلى تحليل نقطة النهاية، الوقت الأمثل لصورة الركام هو في حوالي 96-120 ساعة. في هذه المرحلة سيكون قد وضعت المجاميع الأشكال التضاريسية واضحة وأنماط التعبير الجيني (الشكل 3A)، وحجمها والكتلة لا تزال منخفضة بما فيه الكفاية بحيث طرد المتوسطة من P200 ماصة كافية لطرد أي التي قد تعلق. والفشل في منع الحجز على مجموع المباراتين إلى البئر يؤثر سلبا على تشكيل الكلي (الشكل 5Biv). ويمكن تغيير نمط الأشكال التضاريسية والتعبير الجيني للمجاميع اعتمادا على العلاج. وتظهر نتائج تمثيلية للأنظمة مستدامة أو نابض مع أي علاج واحد أو مزيج من العوامل لBMP4، Dorsomorphin H1 (Bالنائب مستقبلات المانع)، ActivinA، SB43 (Activin / المانع العقدية)، bFGF أو PD03 (مجاهدي خلق المانع) (الشكل 3B).

التصوير الكلي والكمي تحليل الصور

المجاميع قابلة للتصوير إما عن طريق الفحص المجهري widefield (بشكل أساسي عن الوقت الفاصل بين التصوير 19)، أو ثابتة وimmunostained للتصوير متحد البؤر 19،21 (الشكل 2). البروتوكول والتصوير الوصف الحالي فوق يسمح المعلومات الكمية التي يمكن جنيها من هذه المجاميع. ويمكن قياس؛ إثر متحد البؤر أو التقاط صورة واسعة المجال، وطول والتعبير الجيني المقابلة على طول القطر أو العمود الفقري من مجموع (الشكل 4A، B كروية أو مستطيلة على التوالي). هذه التحليلات هي أيضا قابلة للتطبيق مباشرة إلى صور مرور الزمن، حيث يمكن للمرء الحصول على معلومات من معدل النمو والحجم واستطالة من الركام في ظل ظروف مختلفة (الشكل 4

الشكل 1
الشكل 1. نموذجي وقتا بالطبع والأشكال التضاريسية في وقت مبكر. (A) وبالطبع الوقت النموذجي للتجارب التجميع. يتم تجميع الخلايا لمدة 48 ساعة في N2B27 تحتوي على تعليق الماوس خلايا ES (10 خلية / ميكرولتر) في لوحة 96-جيدا (P1، P2) (B) على الفور بعد الطلاء (ر = ~ 5min)، يمكن أن الخلايا الفردية تكون ينظر في التعليق وبدأت لتشكيل كتل من قبل 8H (C). (D) بعد 24 ساعة وقد شكلت الخلايا التجميعية واحد في كل جانب وهو ما يقرب من 100 ميكرون في القطر. (E) بعد 48 ساعة التجميع، ومجموع ويتراوح قطرها 150-200 ميكرون. في هذه المرحلة، والمتوسطة التجميع (N2B27) تتم إزالة ويتم إضافة المتوسطة الثانوي إما لبقية التجربة (P1 في جزء A) أو لمدة 24 ساعة قبل أن يتم تغييرها ب ACK إلى N2B27 (P2 في جزء A). يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تركيب المجاميع على الشرائح المجهر. وبمجرد إصلاح الركام، immunostained ووضعها في تصاعد المتوسطة، وpipetted كل مجموع المباراتين على شريحة المجهر بمثابة قطرة 17 ميكرولتر (A، B، B '). ترك مساحة كافية بين قطرات الإجمالية لمنع دمج الخاصة بهم. مصنوعة الفواصل مع الشريط مزدوجة من جانب وضعها في كل زاوية من شريحة المجهر (A، A، B). فمن على هذه أن يتم وضع ساترة الزجاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
الشكل 3. تأثير العلاجات المختلفة على مورفولوجيا الخلايا ES تجميعها. وبعد أيام 2 في N2B27، وقد شكلت خلايا ES الركام. بالإضافة إلى ذلك من العوامل المحددة إما نبض 1 يوم (A) أو باستمرار (B) يمكن تغيير النمط الظاهري من الركام فيما يتعلق قطبية التعبير الجيني، وإمكانات استطالة، أو شكلها العام. الأمثلة في هذا الشكل هي مجاميع تشكلت من إما البرازيلي :: GFP 30 (A) أو Sox1 :: GFP 27 (B) الماوس خلايا ES تصويرها بعد 120 ساعة، وتعامل كما هو مبين. تشي: CHIR 99021 31؛ SB43: SB 431542 32؛ DM: DorsomorphinH1 33،34. PD03: PD0325901 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. التحليل الكمي من الركام. A مجموع نموذجي تشكلت من البرازيلي :: mESCs GFP 25،30 التالية نبضه 24 ساعة من تشي وتصويرها في 120 ساعة. ويظهر صورة المدمجة للحقل مشرق وقناة GFP مع خط مجزأة بمناسبة "العمود الفقري" للمجموع من النقطة A إلى B (A)، جنبا إلى جنب التي مضان وطول مجموع المباراتين يمكن قياس (B). وترد طول (C) و "الاستدارة" (D) في الفترة من 24 المجاميع داخل نفس التجربة. واصفات شكل مثل استدارة (D)، دائرية، ومحيط منطقة يمكن قياسها باستخدام صورة تحليل كتاب الطبخ المساعد من تحليل صورة البرمجيات فيجي 35. يعني المشار إليها بواسطة خط أفقي في كل نقطة في الوقت.أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. شريط النطاق في (A) إلى 200 ميكرون. كما أن هناك اختلافات طفيفة بين خطوط الخلايا مراسل، ومن المتوقع أنه بعد نبضة من تشي، متوسط ​​الطول الأقصى ومتوسط ​​الحد الأدنى استدارة من المجاميع سوف تختلف. بين خطوط مختلفة من الخلايا، نجد أن متوسط ​​الحد الأقصى لطول يمكن أن يكون في نطاق 400-800 ميكرون ~ والحد الأدنى من متوسط ​​كروية بين 0.4 و 0.6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. أمثلة على الفشل في تشكيل الكلي، وتعتمد القدرة على توليد المجاميع استنساخه (A) على العوامل الحاسمة مثل (بي) المتوسطة الثانوية الطازجة وتمتزج جيدا، (BII، BIII) دقة في عد ن الأوليبني مصفر من الخلايا و(BIV) ضمان المجاميع لا تشكل مستعمرات ملتصقة أي.، 'حادث' إلى سطح البئر. وترد أمثلة نموذجية من الأخطاء في تشكيل الكلي لكل من الشروط المذكورة (B). النطاق شريط كما هو مبين. رؤية حل المشاكل الجدول للحصول على التفاصيل (الجدول 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
يتم إعطاء الجدول 1. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. الأخطاء النموذجية المترافقة مع بروتوكول تجميع مع المقترحات لحلها.

الجدول 2
2. الجدول من خطوط الخلايا اختبار الجدول لتشكيل AGGregates. وهناك عدد من خطوط الخلايا 19،22،27،30،36-40 اتسمت لتشكيل وحدات العمل و، على الرغم من الفروق الدقيقة بين خطوط الخلايا من المتوقع، وقد لوحظ، كل الأسطر أعلاه تظهر ديناميات مماثلة من حيث من استطالة والتشكل. من حيث التعبير الجيني، نمط التعبير تقتصر على التعبير عن الجينات، ولكن في كل خط الخلية، ونمط التعبير يتفق عموما على مدى عدد من الممرات. من أجل التناسق، ونحن توليد مجاميع من الخلايا التي لم تتجاوز 15 الممرات في الثقافة.

الجدول 3
جدول 3. قائمة أجسام تمثيلية المستخدمة في هذه الدراسات. مجموعة مختارة من الأجسام المضادة وعوامل التخفيف تستخدم لالمناعية الكلي.

Discussion

تقنية الموضحة في هذه المخطوطة بكفاءة وبتكاثر يولد مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) التي نظمت العرض التماثل كسر واستطالة 19، والجمع بين كل من ثقافة الإفلات شنقا صفها ماريكاوا وآخرون 14 و EB تشكيل. هذه المجاميع على المضي قدما لتطوير الاستطالة المحورية، واستكمال الطرق الحالية لتوليد أجهزة الأمامي من خلايا ES مثل أكواب البصرية (11) والقشرة المخية 13، وتحتوي على خلايا مع هويات الطبقات الثلاث الجرثومية التي عمليات مماثلة لتلك أثناء تكون المعيدة العرض مثل السريع 19،21 حركة الخلية.

ومن المثير للاهتمام للمضاربة على طبيعة الحدث التماثل كسر، لأنه يحدث في غياب الأنسجة الزخرفة الخارجية والتباين اقحي جديلة. 19. تشكيل عفوية من محور بدائية يمكن أن تنشأ من قبل القائمة heterogeneities في الثقافة بدءا من الخلايا، التي تشكل الأساس لتطوير التماثل. في الواقع، السكان من الخلايا المستزرعة في ظروف ESLIF عرض خليط من تجديد الذات والتفريق الخلايا، نسب والتي قد تختلف من تجميع واحد إلى آخر. وعلاوة على ذلك، والعمل الأولي في المختبر لدينا تشير إلى أن مجاميع من السكان المحفزة كليا من الخلايا تظهر التنمية والعيوب تأخر في الزخرفة، مما يشير إلى دور لعدم التجانس في تشكيل نمط المنظم (DA تيرنر & A. مارتينيز أرياس، قيد الإعداد). ومن الجدير بالنظر إلى أن آلية تفاعل نشرها قد تولد نمط، مع نشر المانع بعيدا عن سطح مجموع المباراتين. Warmflash وآخرون. 41 تشير إلى أن هذه الآلية يمكن أن تكون مسؤولة عن وضع التماثل الشعاعي في ثقافة ملتصقة، مما يجعله مرشحا محتملا للتنميط في ثلاثة أبعاد.

خلال initiaل 48 ساعة فترة التجميع، خلايا تصل إلى حالة مماثلة لتلك التي في الأديم الظاهر postimplantation، التي هي المختصة للرد على إشارات من المتوسط ​​الثانوي 19،21،24. عادة، وبروتوكول الموصوفة هنا يوفر الخلايا مع نبض المتوسطة الثانوية التي تحتوي على العوامل (مثل منبهات WNT / β-Catenin) التي توفر إشارات كافية لاستطالة. أساليب الثقافة السابقة التي وصفها لانكستر وآخرون. (باستخدام المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان 13) وEiraku وآخرون (مع mESCs 11) تستخدم فترة قصيرة من التجميع في البلدان المنخفضة التصاق الصفائح 96-جيدا قبل نقل الخلايا مجمعة لقطرات Matrigel لعلى- الذهاب الثقافة. على الرغم من أن الوقت بين تجميع وMatrigel الإدراج كان مختلفا بين الدراسات، في كلتا الحالتين، تم استخدام أعداد كبيرة من الخلايا لتشكيل الكلي (حوالي 3،000-4،500 الخلايا). على النقيض من ذلك، وصفت بروتوكول هنا 19 يستخدم عدد أقل بكثير من الخلايا (حوالي 400 الخلايافي مجموع المباراتين) التي تم تحديدها على أنها ضرورية للغاية لعملية استطالة، والتماثل كسر والاستقطاب الذي لوحظ 19. بالإضافة إلى ذلك، هذه الهياكل ممدود هي قادرة على أن ولدت في فترة زمنية أقصر بكثير دون التضمين في المصفوفات الاصطناعية: مقارنة جيل من مناطق الدماغ التي تحددها لانكستر وآخرون (> 20-30 يوما) 13 والبصرية أكواب من Eiraku. وآخرون. (~ 11 أيام) 11 مع 5 أيام المطلوبة لتوليد هياكل ممدود الاستقطاب.

واحدة من قيود مع أسلوب الثقافة الموصوفة هنا ومع ذلك، هو أنها لا يمكن إلا أن يكون مثقف ما يقرب من 5-6 أيام بعد انتهاء الطلاء حتى يجعل حجمها لهم مختصة بموجب خطورة لتنزل الى قاع الآبار وفرض التصاق حتى على غير المغلفة البلاستيكية وير. مزيد من التجارب باستخدام المصفوفات الاصطناعية مثل تلك المذكورة سابقا، قد تسمح لنا بزيادة فترةالملاحظة والتجريب، والعمل هو تحديد آثار تقييد الركام بطريقة مستمرة. وجود قيود مزيد من هذه التقنية هو أنه من أجل تغيير المتوسطة دون إزالة الركام، يجب أن تترك كمية صغيرة من المتوسط ​​في قاع البئر. النتائج المترتبة على نهج الوراثة الكيميائية هي الحاجة إلى النظر في هذا التخفيف وأي آثار متبقية من وسائل الاعلام السابق: في يوم 3 ميكرومتر تشي النبض، ويتم تسليم 2.37 ميكرومتر الحل في الواقع، والتغيرات المتوسطة اللاحقة يؤدي إلى ترحيل 0،499 ميكرومتر (72-96 ساعة) و0.105 ميكرومتر (96-120 ساعة) بين نقاط الوقت. لم تصحيح العمل الحالي لتخفيف ويفترض أن التغيرات المتوسطة اليومية وتقليل الآثار المتبقية.

هناك عدد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول لضمان إعادة الإنتاج على حد سواء داخل وبين التجريبية. أولا، ثقافة ابتداء من mESCs يجب صيانتها جيدا وليس على المشتركnfluent، والمتوسطة يجب أن تكون دائما جيدة أي جودة، الطازجة وتمتزج جيدا (الشكل 5A، B). شروط الثقافة الفقيرة يؤثر سلبا على التجميع (الشكل 5Bi). عد دقيقة من الخلايا للحصول على تعليق خلية ~ 400 خلية / 40 ميكرولتر أمر ضروري، كما فشلت المجاميع الكبيرة في تقرير المصير، تنظيم وهم أكثر عرضة لتشكيل المجاميع مزدوجة داخل كل بئر (الشكل 5Bii) في حين المجاميع الصغيرة غير قادرة على الوصول الصحيح الكثافة حيث أنها قادرة على الاستجابة لحافز (الشكل 5Biii). وكانت الخطوة الأمثل الرئيسية إدراج غسل PBS الثاني الذي يزيل المصل الملوثات من تعليق خلية (الخطوة 2.6)؛ هذا تحسن وتيرة التجميع وتسارع تطور المجاميع قبل ما يقرب من 24 ساعة. بعد ذلك، يتم تطبيق التغييرات ضمان المتوسطة مع قوة كافية لطرد أي المجاميع التي لديها القدرة على الانضمام إلى سطح البئر. الفشل في القيام بذلك دورة الفتشوبLTS في "تحطمها" المجاميع (الشكل 5Biv). وبالإضافة إلى ذلك، وكما ذكر سابقا (وأدناه)، فمن الضروري لضمان أن المجاميع يتم الاحتفاظ في الثقافة تعليق ومنعت من الانضمام إلى أي سطح. مرة واحدة انضمت المجاميع، تتعطل نمط التعبير الجيني وإمكانيات استطالة بهم.

لأن هذا الأسلوب هو بسيطة نسبيا، وكذلك ضمن اختصاص الأفراد مع تقنيات زراعة الأنسجة جيدة، معظم المشاكل المرتبطة التجميع يمكن حلها بسرعة نسبيا إذا ما اتبعت هذه الخطوات الحاسمة. الجدول الكامل من المتاعب اطلاق النار يتوفر (الجدول 1). مرة واحدة يتقن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة تطوير المحورية، والتماثل كسر وخلية القرار الأحداث. وبشكل أكثر تحديدا، هذه المجاميع لديها القدرة على توليد برك من الخلايا التي كانت حتى الآن غير متوفرة في الثقافة، مثل النخاع الشوكي والدراجات الناريةالخلايا العصبية ص.

الأخلاقية ملاحظة: تجدر الإشارة مع الحذر الواجب أن ترجمة هذا البروتوكول لES الإنسان أو زراعة الخلايا المحفزة يمكن أن تجلب المجرب على مقربة من الأساس القانوني للحدود أربعة عشر يوما على أبحاث الأجنة البشرية، وهي الجيل من خط بدائي، كما هو مفصل في قانون الإنسان التخصيب وعلم الأجنة 2008 (UK) 42. منذ صدور قانون يغطي جميع الأجنة البشرية الحية بغض النظر عن طريقتها في الخلق، من شأنه أن ثقافة gastruloids الإنسان ما وراء خط-بدائية مثل المرحلة سيكون خارج نطاق الأبحاث للترخيص.

Acknowledgements

ويتم تمويل هذا العمل من قبل جائزة الباحث ERC المتقدم لAMA (DAT، TB) مع مساهمة من منحة المشروع من ويلكوم ترست لAMA، وهو studentship EPSRC لPB-J وإيراسموس، مؤسسة Stichting د. هندريك مولر Vaderlandsch فون وFundatie فان دي Vrijvrouwe فان Renswoude الشركة المصرية للاتصالات 'S-GRAVENHAGE إلى SCvdB. نريد ان نشكر J. بريسكو، S. مونيوز Descalzo، C. شروتر، وT. رودريجيز، لإجراء مناقشات وانتقادات بناءة، خواكين دي Navascués لبروتوكول المتوسط ​​تصاعد وكلا AK Hadjantonakis وC. Budjan لتبادل البروتوكولات المخبرية الخاصة بهم المتعلقة تلطيخ الأجنة كلها جبل. إصدار سابق من هذه المادة وقدم متاحة في السابق على bioRxiv ورقة خادم 29.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, (5819), 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146, (3), 488-488.e2 (2011).
  4. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
  5. Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).
  6. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371, (2), 170-179 (2012).
  7. ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3, (5), 508-518 (2008).
  8. Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2, (1), 60-71 (2008).
  9. Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
  10. Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284, (1), 67-81 (1999).
  11. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, (7341), 51-56 (2011).
  12. Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9, (6), 1229-1244 (2014).
  13. Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, (7467), 373-379 (2013).
  14. Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47, (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).
  15. Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103, (1), 193-209 (1988).
  16. Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220, (2), 227-233 (1982).
  17. Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14, (2), 132-179 (1939).
  18. Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129, (4), 669-793 (1933).
  19. van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141, (22), (2014).
  20. Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, (5), 519-532 (2008).
  21. Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141, (22), (2014).
  22. Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140, (6), 1171-1183 (2013).
  23. Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7, (7), e1000149 (2009).
  24. Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3, (7), 614-626 (2014).
  25. Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12, (1), 63 (2014).
  26. Ying, Q. -L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  27. Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21, (2), 183-186 (2003).
  28. Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. Molecular Embryology of the Mouse. CSHL. 1-90 (2011).
  29. Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. (2014).
  30. Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130, (17), 4217-4227 (2003).
  31. Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52, (3), 588-595 (2003).
  32. Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62, (1), 65-74 (2002).
  33. Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3, (8), e2904 (2008).
  34. Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3, (6), 482-491 (2012).
  35. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  36. Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24, (3), 312-326 (2010).
  37. Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, (7173), 1230-1234 (2007).
  38. Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44, (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).
  39. Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5, (6), 956-966 (2012).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326, (6110), 292-295 (1987).
  41. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11, (8), 847-854 (2014).
  42. Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. The Stationery Office. (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats