Generazione di aggregati di cellule staminali embrionali di topo che Mostra rottura di simmetria, Polarizzazione e Emergent Comportamento Collettivo
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
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Developmental Biology
 

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Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

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Abstract

Abbiamo sviluppato un protocollo di migliorare la cultura corrente embrionali Corpo (EB), che permette lo studio di auto-organizzazione, rottura della simmetria, l'allungamento assiale e determinazione del fato cellulare utilizzando aggregati di cellule staminali embrionali di topo (mESCs) in coltura in sospensione. Un piccolo numero di mESCs sono aggregate in terreno di base per 48 ore in piastre da 96 pozzetti non tessuto-cultura-trattati, U-fondo, dopo di che sono competenti per rispondere ai segnali sperimentali. Dopo il trattamento, questi aggregati iniziano a mostrare segni di espressione genica polarizzata e gradualmente modificare la loro morfologia da una massa sferica di cellule di una struttura allungata, ben organizzata in assenza di segnali esterni asimmetria. Queste strutture non sono solo in grado di visualizzare simboli dei tre strati germinali, ma attivamente mostrano movimenti gastrulazione simili, rappresentati da un dislodgement direzionale di singole celle di aggregato, che si verifica fondamentalmente in una regione della struttura allungata. Questo ProtoColo fornisce un metodo dettagliato per la formazione riproducibile di questi aggregati, la loro stimolazione con i segnali come l'attivazione Wnt / β-catenina e l'inibizione BMP e la loro analisi per singolo time-point o microscopia a fluorescenza time-lapse. Inoltre, descriviamo modifiche al tutto il montaggio del mouse attuali procedure embrione di colorazione per l'analisi immunocitochimica di marcatori specifici all'interno degli aggregati fissi. I cambiamenti nella morfologia, espressione genica e la lunghezza degli aggregati possono essere quantitativamente misurati, fornendo informazioni su come i segnali possono alterare sorti assiali. Si prevede che questo sistema può essere applicato sia allo studio degli eventi precoci di sviluppo come lo sviluppo assiale e di organizzazione, e più in generale, i processi di auto-organizzazione e cellulare decisionale. Essa può anche fornire una nicchia adatta per la generazione di tipi presenti nell'embrione che sono ottenibili da colture cellulari aderenti convenzionale come cavo e motore neuroni spinali.

Introduction

Lo studio e la comprensione delle decisioni cellula-destino ai primi di sviluppo dei mammiferi possono fare uso di colture di cellule embrionali staminali (CES), le popolazioni clonali derivate da blastocisti che hanno la capacità di auto rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi cellulari di un organismo ad esempio., sono 1,2 pluripotenti. Anche se queste culture sono stati e continuano a essere utili per la comprensione delle basi molecolari delle decisioni cellula-destino, non sono in grado di riprodurre alcune delle disposizioni spaziali e comportamenti globali generati negli embrioni durante gastrulazione. Nel embrione, il processo di gastrulazione trasforma un singolo strato epiteliale nei tre strati germinali distinti e dota l'embrione con un'organizzazione anteroposteriore palese 3-5. I tentativi di ricapitolare questi eventi ex vivo sono stati basati sulla generazione di aggregati tridimensionali di CES, cui corpi embrionali (EBS), e sottoponendo le to condizioni di differenziazione 6,7. Tali aggregati possono essere forzati a differenziarsi in molti tipi cellulari diversi, alcuni dei quali sono o non può essere ottenuto o indotto con bassa efficienza in coltura aderente o non possono essere prodotti affatto, ad es., Sangue 8 e 9 cellule germinali primordiali. Una limitazione nell'uso di EBs tuttavia, è che essi sono in grado di visualizzare il comportamento morfogenetico, distribuzione degli strati germinali o organizzazione assiale che sono caratteristiche principali del embrione di sviluppo, con conseguente disorganizzazione spaziale 6,10. In un rapporto, il trattamento di EB con Wnt porta ad una polarizzazione debole espressione genica in alcuni aggregati, ma non morfogenesi chiaro si osserva 7. Nei rapporti più recenti, EBS che sono state coltivate per lunghi periodi di tempo a sviluppare strutture anteriori, come retine, corteccia e cellule sensoriali dell'orecchio interno, che imitano le loro controparti embrionali, ma si sviluppano senza contesto di un organizat assialeion 11-13.

Un rapporto di Marikawa et al. 14, pur lavorando con aggregati di topo P19 Embryo Carcinoma (CE) celle formate con il metodo impiccagione-goccia, ha riferito l'emergere di strutture allungate di origine mesodermica ricorda i allungamenti che si osservano con exogastrulae in anfibio ed embrioni di riccio di mare e Keller espianti 15-18. Dato che questo non era stato osservato con il mouse cellule staminali embrionali (mESCs), abbiamo cercato di riprodurre il comportamento osservato con P19 cellule EC utilizzando aggregati di mESCs 19 e si riportano condizioni di coltura che portano alla loro rottura di simmetria e l'allungamento assiale. Una differenza importante dal lavoro con cellule P19 è che il protocollo aggregazione descritta viene eseguita in una piastra a 96 pozzetti, simile a quello descritto da Eiraku et al. 20, invece di appendere gocce. Questo cambiamento ha determinato una maggiore efficienza in termini di recupero aggregata e siariproducibilità intra e inter-sperimentale. È importante sottolineare che, mantenendo gli aggregati in singoli pozzetti assicura che la fusione tra gli aggregati (comune quando mettendo in comune gli aggregati dal appesi gocce) non si verifica. Inoltre, una caratteristica fondamentale del protocollo è di 24 ore esposizione al CHI99021 inibitore GSK3 (Chi), un potente attivatore di segnalazione Wnt / β-catenina, a seguito di aggregazione.

Il metodo qui descritto fornisce una base per la comprensione dei processi di auto-organizzazione, l'organizzazione e le specifiche assiale foglietto embrionale nella cultura, consentendo inferenze da effettuare per quanto riguarda lo sviluppo assiale in vivo 19,21. Per queste ragioni il metodo ha il potenziale per consentire dettagliata analisi meccanicistica dei processi che possono essere difficili da studiare in embrione. Inoltre, una potenziale applicazione è nella generazione di tessuti e organi che non sono facilmente ottenibili in coltura aderenti a causa della mancanza di una nicchia cellulare strutturato comemidollo spinale precursori 21 e del motore neuroni. Cultura aggregato tridimensionale offre una struttura fisica e ambiente segnalazione che potrebbe non essere ottenibile mediante mezzi convenzionali, portando ad un nuovo approccio per la derivazione di linee embrionali in modo spazialmente organizzata.

Protocol

1. Cultura Condizioni Prima di aggregazione

  1. Mantenere mESCs in ESLIF medio (vedi Tabella di specifici materiali e attrezzature per la formulazione) su 2 tessuto-cultura-trattati palloni gelatina rivestite 25 centimetri in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO Febbraio 21-25.
  2. Crescere le cellule per almeno due passaggi inviare scongelamento prima dell'uso in questo protocollo; cellule a passaggi più bassi sono generalmente più successo a generare caratteristiche riproducibili in tutta repliche sperimentali (es., non più di 15 passaggi in coltura), per quanto leggera variazione tra le diverse linee cellulari ES è prevedibile (vedi Tabella 2 per le linee cellulari testate ).
  3. Crescere le cellule a 40-60% di confluenza. Non utilizzare le cellule over-confluenti per l'aggregazione.

2. Generazione di Aggregati

  1. Preriscaldare PBS (+ Ca 2+, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27
  2. Aspirare il terreno di coltura dal pallone di coltura tissutale (punto 1.3). Lavare il pallone delicatamente con 5 ml di PBS, due volte. Aspirare il PBS e aggiungere 1 a 2 ml di pre-riscaldato tripsina-EDTA (0,25%) per dissociare le cellule.
    1. Porre il pallone in incubatrice per <5 minuti o fino a quando le cellule hanno completamente indipendente dalla superficie del pallone. Pipetta su e giù con una pipetta 1 ml per generare cella singola sospensione per conteggio preciso ed uniforme formazione granulometria.
  3. Neutralizzare tripsina con 5-10 ml ESLIF; lavare la superficie di crescita per massimizzare il recupero delle cellule e trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml. Rimuovere un'aliquota 1 ml dalla provetta e contare le cellule con un emocitometro.
  4. Determinare il volume di sospensione necessaria per ottenere 10 cellule / ml (un'intera piastra a 96 pozzetti richiede 5x10 4 cellule in una sospensione 5 ml). Contare le celle in modo accurato, come grande deviationi dal numero di cellulare indicato possono influenzare negativamente la risposta degli aggregati agli stimoli.
  5. Aggiungere 5x10 4 cellule per 5 ml preriscaldata PBS in un fresco 50 ml provetta da centrifuga e centrifugare a ~ 170 xg per 5 min.
  6. Aspirare accuratamente la PBS e aggiungere 5 ml di pre-riscaldato delicatamente PBS; non disturbare il pellet sul fondo della provetta. Centrifugare a ~ 170 xg per 5 minuti.
  7. Attenzione aspirare PBS per una seconda volta. Rimuovere il più PBS possibile senza disturbare il pellet come PBS riporto possono influenzare negativamente l'aggregazione. Risospendere il pellet in 1 ml lato caldo N2B27 con una pipetta P1000 per generare una sospensione cellulare omogenea, seguita da ulteriore aggiunta di N2B27 al volume desiderato (ad esempio, aggiungere 4 ml di 5x10 4 cellule / 5 ml di sospensione).
  8. Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e pipetta una goccia 40 microlitri sul fondo di ciascun pozzetto di un non-tessuto-coltura trattata, 'U'con fondo 96-wpiatto ell con una pipetta multicanale. Coprire la piastra a 96 pozzetti con il suo coperchio corrispondente e confermare la presenza di cellule con un microscopio invertito banco (Figura 1B).
    Nota: E 'essenziale che queste piastre sono utilizzati per limitare la possibilità di cellule aderenti. Non rivestire il fondo della piastra a 96 pozzetti con gelatina, fibronectina o qualsiasi altro rivestimento che promuove l'adesione cellulare.
  9. Incubare le cellule per 48 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO 2 per l'aggregazione.

3. L'applicazione di stimoli e modifica Media

  1. Dopo il periodo di incubazione 48 ore, osservare l'aspetto dei mESCs in ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti per confermare aggregazione successo (Figura 1E). Nota: Aggregati appariranno sferica in natura e di circa 150-200 micron di diametro. Fare riferimento alla sezione di risoluzione dei problemi in caso di problemi (Tabella 1).
  2. 0; Aggiungere 150 microlitri medio secondario fresche (3 micron Chi99021 (Chi), in N2B27 19; azione preparato al 10 mM in DMSO) in ogni pozzetto con una pipetta multicanale. Pipetta con forza sufficiente a rimuovere eventuali aggregati che possono aver iniziato a aderire al fondo dei pozzetti. Incubare aggregati in mezzo secondario per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO 2 (Figura 1A).
    Nota: riproducibili aggregati allungati e polarizzate sono generati utilizzando questo mezzo secondario. Altre composizioni medie secondario possono essere usati anche a seconda delle condizioni sperimentali necessarie e gli esempi sono mostrati nella Figura 3.
  3. Per le successive variazioni medie, utilizzare una pipetta multicanale tenuto ad un angolo (circa 30 °) per rimuovere delicatamente 150 ml del mezzo secondario dal lato di ciascun pozzetto. Poi, pipetta 150 ml fresche N2B27 in ogni pozzetto con forza sufficiente a rimuovere eventuali aggregati che possono avere inizioed di aderire al fondo dei pozzetti.
  4. Ripetere il punto 3. 3 ogni 24 ore fino a quando il tempo-corso è completo (la lunghezza tipica di un esperimento culturale complessivo è di 120 ore).
    Nota: Assicurarsi che gli aggregati si muovono liberamente a seguito delle modifiche di media per garantire la riproducibilità e la coerenza all'interno e tra ogni piastra da 96 pozzetti. Media deve essere cambiata ogni giorno dopo il periodo di aggregazione.

4. Preparazione di Aggregati per Immunostaining e Analisi per Microscopia confocale

  1. Fissazione e Incubazione Anticorpo Primario:
    Nota: Il protocollo descritto da AK Hadjantonakis 28 è stato modificato per adattarsi immunocolorazione di MESC aggregati. Per gli anticorpi tipiche utilizzate nei nostri studi e le loro diluizioni, vedere pubblicata precedentemente lavoro 19,21,24,25,29 e tabella 3.
    1. Utilizzare una pipetta multicanale presso un angolo (circa 30 °) per rimuovere delicatamente 150 microlitri medio di lato of ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Lavare due volte pipettando 150 ml di soluzione in ogni pozzetto. Lascia un paio di minuti tra ogni lavaggio per consentire gli aggregati di stabilirsi.
    2. Impostare una pipetta P1000 per erogare 200 microlitri, fissare il corrispondente puntale e tagliare circa 3 mm dalla fine della punta con un paio di forbici sterili. Disegnare una porzione di PBS in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti per un breve tratto nella punta ed espellere ad agitare l'aggregato.
    3. Utilizzare la stessa punta a redigere l'intero volume nel pozzo tra cui l'aggregato e pipetta in una piccola (30 mm di diametro) vetro Drosophila dissezione bene. Trasferire tutti gli aggregati dalla piastra a 96 pozzetti che saranno sottoposti a regimi di immunoistochimica identici nella stessa dissezione vetro bene.
      Nota: utilizzare una nuova punta taglio pipetta durante il trasferimento aggregati da differenti condizioni sperimentali per impedire il passaggio di aggregati.
    4. Posizionare il pozzo di vetro che contiene il aggregates SU UN microscopio dissezione. Agitare bene il vetro di forzare gli aggregati per il centro e aspirare PBS da un lato del bene con un bicchiere pipetta Pasteur. Utilizzare il microscopio per garantire aggregati non vengono aspirati. Lasciare un piccolo volume di PBS all'interno del pozzo di vetro per coprire gli aggregati per evitare che si secchi.
    5. Aggiungere 1 ml di formaldeide preparata di fresco (4%) disciolti in PBS e incubare per 2 ore a 4 ° C in un agitatore orbitale per impostare una velocità bassa. Attenzione: Paraformaldeide è noto per essere allergenici, cancerogene e tossiche. Indossare una protezione adeguata durante la manipolazione.
    6. Dopo fissazione, aspirare la soluzione di formaldeide nello stesso modo come descritto nella sezione 4. 1. 4 e lavare gli aggregati con 1 ml di PBS per tre volte, per 10 min con ogni lavaggio, in un agitatore orbitale per impostare una velocità bassa.
    7. Aspirare il PBS come descritto nel capitolo 4. 1. 4 ed eseguire altri tre, 10 min lavaggi con PBS contenente il 10% di siero fetale bovino e dello 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Eseguire le 10 min lavaggi su un agitatore orbitale impostata una bassa velocità.
      Nota: Utilizzando fetale siero bovino (FBS) risultati in un tampone di lavaggio chiaro, riducendo il numero di aggregati che altrimenti andrebbero persi durante il protocollo se è stato utilizzato latte. È importante notare che dopo la fissazione, procedure immunoistochimiche possono essere eseguite in vari modi diversi da quelli indicati in appresso e devono essere determinati e ottimizzati dallo sperimentatore.
    8. Bloccare gli aggregati per 1 ora a 4 ° C in PBSFT su un bilanciere orbitale impostare una velocità bassa. Il protocollo può essere messo in pausa, a questo punto, e gli aggregati bloccato O / N, con costante agitazione su una sedia a dondolo rotatorio orizzontale a 4 ° C.
    9. Aspirare il PBSFT come precedentemente descritto (vedere la sezione 4. 1. 4) e incubare gli aggregati con 500 microlitri di anticorpo primario richiesto diluito in PBSFT O / N a 4 ° C in un agitatore orbitale impostato a bassa velocità. Coprire con pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione.
  2. Incubazione secondario
    1. Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare con 1 ml PBSFT (a 4 ° C) nel modo seguente: due volte per 5 min; tre volte per 15 min; e quattro a sette volte per 1 ora. Eseguire ogni fase di lavaggio a 4 ° C e su un bilanciere orbitale impostato a bassa velocità. Nota: Freddo lavare medio prima dell'uso. Non eseguire lavaggi su ghiaccio come questo può causare gli aggregati a frammentarsi.
    2. Aspirare il mezzo di lavaggio finale e incubare gli aggregati con l'anticorpo secondario richiesto in 500 microlitri PBSFT O / N a 4 ° C al buio su un attuatore rotante orizzontale. Aggiungere macchia nucleare come Hoechst, se necessario.
  3. Montaggio e imaging per confocale Microcopy
    1. Lavare gli aggregati come descritto nella Sezione 4. 1. 4 con 4 ° C PBSFT. Dopo l'ultimo lavaggio, risciacquo aggregati con 1 ml di PBS contenente 0,2% FBS e Triton X-100 (PBT) nel modo seguente: due volte per 5 min; tre volte per 15 min. Eseguire lavaggia temperatura ambiente su una sedia a dondolo orbitale al riparo dalla luce.
    2. Aspirare il mezzo come descritto in precedenza (sezione 4. 1. 4) e incubare per 30 minuti al buio con una soluzione 1: 1 di glicerolo: PBT (1 ml) seguita da una seconda incubazione 30 min con 7: 3 di soluzione glicerolo: PBT (1 ml).
      Nota: mescolare le soluzioni PBT e glicerolo a 4 ° C usando un rotatore.
    3. Aspirare il glicerolo finale: soluzione PBT e sostituirlo con 1 ml di mezzo 24 di montaggio. Il protocollo può essere messo in pausa in questo punto prima del montaggio (se in pausa, sigillare i pozzetti con la pellicola di paraffina e memorizzare i pozzi di colorazione a 4 ° C).
    4. Montare gli aggregati su vetrini da microscopio da loro pipettando in 17 gocce microlitri con una punta taglio P20 (Figura 2). Piegare nastro biadesivo su se stesso quattro volte per generare distanziatori e collegare a ciascuna estremità della slitta. Posizionare il coprioggetto superiore (22 mm x 60 mm) su questi distanziali (figura 2).
      Nota: è essenziale che una punta taglio èutilizzato in questa fase in modo da non danneggiare i campioni. I distanziatori impediscono il vetrino di frantumazione degli inerti.
    5. Una volta che gli aggregati sono montati, di immagini i campioni usando la microscopia confocale utilizzando protocolli precedentemente descritti 19,21,24,25. Una volta immessi sul microscopio, lasciare la diapositiva indisturbato sul palco per qualche minuto per consentire gli aggregati di stabilirsi all'interno del mezzo di montaggio.

Representative Results

Aspetto di cellule immediatamente dopo la placcatura e dopo Aggregazione

Subito dopo la placcatura, si può osservare la presenza di cellule singole all'interno di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con standard invertita coltura tissulare microscopio (Figura 1B). Entro 8 ore di placcatura, queste cellule hanno iniziato a scendere verso il fondo della causa ben gravità e si hanno iniziato a fondersi in cluster discreti (Figura 1C). Dopo 24 ore, le cellule coalescenza avranno completato l'aggregazione primaria, e saranno compattati in ben definite, aggregati ancora laceri cui le singole cellule sono indistinte tra loro (Figura 1D). Entro la fine del secondo giorno (48 ore), gli aggregati devono cercare 'pulito', dopo aver preso tutte le cellule all'interno del pozzo (Figura 1E); il fondo del pozzo può avere alcune cellule che sono state versate l'aggregato in questa fase. Forniturache gli aggregati sono stati aggregati in N2B27, in questo momento-punto, dovrebbero essere sferica, di circa 150-200 micron di diametro e muoversi liberamente all'interno del pozzo (cioè., non aderito al fondo dei pozzetti). Aggregazione in altri mezzi (es., ESLIF o N2B27 con fattori specifici) ha il potenziale per alterare sia la morfologia aggregata iniziale e la risposta a stimoli successivi (Turner et al., In preparazione).

Rappresentante morfologica Modifiche

L'aggiunta di un impulso 24 ore di media secondaria contenente Chi tra i 48 e 72 ore (Figura 1A, 5A) genera ben definito aggregati allungati che mostrano l'espressione polarizzata in marker specifici degli strati germinali 19,21. Subito dopo l'impulso Chi (72 hr), gli aggregati inizieranno a gettare cellule e iniziare a mostrare la loro risposta a questi segnali verso la fine di questo giorno (Figura 3A). Queste rispostesi manifestano da cambiamenti nell'espressione genica e la morfologia, entrambi i quali sono dipendenti dal trattamento che gli aggregati hanno ricevuto dopo il 48 hr periodo di aggregazione iniziale N2B27 (Figura 3B). Se è richiesta solo una analisi finale, il tempo ottimale di immagine aggregati è approssimativamente 96-120 ore. A questo punto gli aggregati avranno sviluppato morfologie cristalline e modelli di espressione genica (Figura 3A), e le loro dimensioni e massa sono ancora abbastanza basso in modo che l'espulsione del mezzo di P200 pipetta è sufficiente a rimuovere eventuali che possono avere attaccato. La mancata prevenire la fissazione del totale per il bene avrà effetti negativi sulla formazione di aggregati (Figura 5Biv). Il pattern di espressione genica e morfologie degli aggregati può essere modificata a seconda del trattamento. Risultati rappresentativi per i regimi sostenuti o impulsi sia con singolo trattamento o combinazioni di fattori sono indicati per BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP inibitore del recettore), ActivinA, SB43 (Activin / inibitore nodale), bFGF o PD03 (inibitore MEK) (Figura 3B).

Imaging Aggregate e quantitativa Image Analysis

Aggregati sono suscettibili di imaging o microscopia widefield (principalmente per time-lapse imaging 19), o fissa e immunostained per l'imaging confocale 19,21 (Figura 2). L'attuale protocollo e di imaging descrizione di cui sopra permette informazioni quantitative che si possono ottenere da questi aggregati. Dopo confocale o largo campo di cattura dell'immagine, la lunghezza e l'espressione genica corrispondente lungo il diametro o spine dell'aggregato (sferica o allungata rispettivamente 4A, B) possono essere misurati. Queste analisi sono direttamente applicabili alle immagini time-lapse, dove si possono ottenere informazioni del tasso di crescita, le dimensioni e l'allungamento degli aggregati in condizioni diverse (Figura 4 anche

Figura 1
Figura 1. tipico tempo-corso e all'inizio morfologie. (A) Il tipico tempo-corso per gli esperimenti di aggregazione. Le cellule sono aggregati per 48 ore in N2B27 contenente una sospensione di cellule ES di topo (10 cellule / ml) in una piastra da 96 pozzetti (P1, P2). (B) Subito dopo la placcatura (t = ~ 5min), le singole celle possono essere visto in sospensione e hanno iniziato a formare grumi di 8h (C). (D) Dopo 24 ore le cellule hanno formato un unico aggregato in ciascun pozzetto che è circa 100 micron di diametro. (E) Dopo aggregazione 48 ore, l'aggregato diametro varia 150-200 micron. A questo punto, il mezzo di aggregazione (N2B27) viene rimosso e un mezzo secondario viene aggiunto sia per il resto dell'esperimento (p1 nella parte A) o per 24 ore prima di essere cambiato bACK N2B27 (p2 nella parte A). Barra della scala rappresenta il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. aggregati montaggio su vetrini da microscopio. Una volta fissati gli aggregati, immunoistochimica e collocato in mezzo di montaggio, ciascun aggregato è pipettato su un vetrino da microscopio come una gocciolina 17 microlitri (A, B, B '). Abbastanza spazio è lasciato tra le goccioline aggregati per impedire la loro fusione. Distanziali sono realizzati con nastro biadesivo e poste ad ogni angolo del vetrino da microscopio (A, A ', B). E 'su questi che un vetrino di vetro è collocato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 3. L'effetto dei diversi trattamenti sulla morfologia delle cellule ES aggregati. Dopo 2 giorni a N2B27, cellule ES sono formati aggregati. L'aggiunta di fattori specifici sia come impulso 1 giorno (A) o in continuo (B) può alterare il fenotipo degli aggregati rispetto alla polarità di espressione genica, potenziale di allungamento, o la loro forma complessiva. Gli esempi in questa cifra sono aggregati formati da entrambi Bra :: GFP 30 (A) o Sox1 :: GFP 27 (B) di topo cellule ES imaged dopo 120 ore e trattate come indicato. Chi: CHIR 99.021 31; SB43: SB 431.542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 Cliccate qui per vedere una versione più grande di thè figura.

Figura 4
Figura 4. Analisi quantitativa degli aggregati. Un tipico aggregato formato da Bra :: mESCs GFP 25,30 a seguito di un impulso 24 ore di Chi e ripreso a 120 ore. Immagine fusa del campo chiaro e il canale GFP è indicata con il marchio 'spine' dell'aggregato dal punto A al B (A) linea segmentata, lungo la quale la fluorescenza e la lunghezza del totale può essere misurata (B). Vengono visualizzati la lunghezza (C) e 'rotondità' (D) da 24 aggregati all'interno dello stesso esperimento. Descrittori di forma, come la rotondità (D), circolarità, perimetro e l'area può essere misurata utilizzando l'immagine di analisi Cookbook plugin dal software di analisi delle immagini FIJI 35. Medio indicato dalla linea orizzontale in ogni time-point;barre di errore indicano la deviazione standard; barra della scala in (A) indica 200 micron. Poiché vi sono differenze sottili tra linee cellulari giornalista, si prevede che dopo un impulso di Chi, la lunghezza massima media e rotondità minima media degli aggregati varieranno. Tra le linee di cellule diverse, troviamo che la lunghezza massima media può essere nel range di 400-800 micron ~ e la rotondità minima media tra 0,4 e 0,6. Prego clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Esempi di fallimenti in formazione di aggregati. La capacità di generare aggregati riproducibili (A) dipende da fattori critici, come (Bi) di media secondaria fresco e ben miscelati, (Bii, BIII) la precisione nel conteggio iniziale numero di cellule e (BIV) garantendo aggregati non formano colonie aderenti cioè., 'incidente' nella superficie del pozzo. Sono mostrati esempi tipici di errori di formazione di aggregati per ciascuna delle condizioni menzionate (B). Scale-bar come indicato; vedi tabella ricerca guasti per i dettagli (Tabella 1). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1. Guida per la risoluzione dei problemi. Gli errori tipici associati al protocollo di aggregazione sono state fornite con suggerimenti sulla loro risoluzione.

Tabella 2
Tabella 2. Tabella delle linee cellulari testate per la formazione di aggregates. Un certo numero di linee cellulari 19,22,27,30,36-40 sono stati caratterizzati per la formazione di aggregati e, anche se sono previsti sottili differenze tra linee cellulari e sono stati osservati, tutte le righe precedenti mostrano dinamiche simili in termini di allungamento e morfologia. In termini di espressione genica, il pattern di espressione è specifico per il gene espresso, ma all'interno di ciascuna linea cellulare, il pattern di espressione è generalmente costante in un certo numero di passaggi. Per coerenza, generiamo aggregati di cellule che non hanno superato 15 passaggi in coltura.

Tabella 3
Tabella 3. Elenco degli anticorpi rappresentativi utilizzati in questi studi. Una selezione degli anticorpi e dei fattori di diluizione utilizzate per immunostaining aggregato.

Discussion

La tecnica descritta in questo manoscritto in modo efficace e riproducibile genera aggregati di cellule staminali embrionali di topo (mESCs) che mostra organizzata simmetria rottura e l'allungamento 19, che combina la cultura goccia pendente descritto da Marikawa et al. 14 e EB formazione. Questi aggregati vanno a sviluppare allungamenti assiali, integrare i metodi esistenti per la generazione di organi anteriori da cellule ES come tazze ottiche 11 e la corteccia cerebrale 13, e contengono cellule con identità degli strati che processi simili a quelli durante gastrulation display a tre germinali come ad esempio un rapido movimento delle cellule 19,21.

È interessante speculare sulla natura dell'evento simmetria rottura, in quanto si verifica in assenza di tessuti patterning esterni e asimmetria zigotica Stecche 19. La formazione spontanea di un asse rudimentale potrebbe derivare da preesistente heterogeneities nella coltura iniziale di cellule, che formano la base per lo sviluppo di asimmetria. Infatti, le popolazioni di cellule coltivate in condizioni ESLIF mostrano una miscela di auto-rinnovano e differenziazione delle cellule, le proporzioni relative dei quali possono variare da un aggregato all'altro. Inoltre, i lavori preliminari nel nostro laboratorio suggeriscono che gli aggregati da una popolazione di cellule pluripotenti tutto mostrano lo sviluppo ritardato e difetti di patterning, suggerendo un ruolo per l'eterogeneità nella formazione di pattern organizzata (DA Turner & A. Martinez Arias, in preparazione). Vale anche la pena considerare che un meccanismo di reazione-diffusione può generare il modello, con la diffusione di un inibitore di distanza dalla superficie dell'aggregato. Warmflash et al. 41 suggeriscono che tale meccanismo potrebbe essere responsabile dello sviluppo di asimmetria radiale nella cultura aderente, che lo rende un possibile candidato per patterning in tre dimensioni.

Durante la initial 48 hr periodo di aggregazione, cellule raggiungere uno stato simile a quello nel epiblast dopo l'impianto, in cui sono competenti per rispondere ai segnali dal mezzo secondario 19,21,24. Tipicamente, il protocollo qui descritto fornisce cellule con un impulso di supporto secondario contenente fattori (come agonisti Wnt / β-catenina) che forniscono i segnali sufficienti per l'allungamento. Metodi di coltura precedenti descritti da Lancaster et al. (Utilizzando CES umani 13) e Eiraku et al. (Con mESCs 11) sfrutta un periodo di aggregazione a bassa aderenza piastre a 96 pozzetti prima cellule aggregati sono stati trasferiti a goccioline Matrigel per on- andare cultura. Anche se il tempo tra aggregazione e inserimento Matrigel era differente fra gli studi, in entrambi i casi, un gran numero di cellule sono stati utilizzati per la formazione di aggregati (circa 3,000-4,500 cellule). Per contro, il protocollo qui descritto 19 utilizza molte meno cellule (circa 400 celluleper aggregato) che è stato determinato per essere assolutamente essenziale per il processo di allungamento, simmetria rottura e la polarizzazione che si osserva 19. Inoltre, queste strutture allungate possono essere generati in un tempo molto più breve periodo senza incasso, matrici artificiali: confronta la generazione di regioni cerebrali definite da Lancaster et al (> 20-30 giorni) 13 e l'ottica tazze da Eiraku. et al. (~ 11 giorni) 11 con i 5 giorni necessari per la generazione di strutture allungate polarizzate.

Uno dei limiti con il metodo descritto qui coltura tuttavia, è che possono essere coltivate solo per circa 5-6 giorni dopo placcatura fino alla loro dimensione li rende competente per gravità a depositarsi sul fondo dei pozzetti e forzare un adesione anche su non Rivestiti di plastica-ware. Ulteriori esperimenti che utilizzano matrici artificiali come quelli menzionati in precedenza, possono permettere di aumentare il periodo diosservazione e la sperimentazione, e il lavoro è in corso per determinare gli effetti di vincolare aggregati in modo. Un ulteriore limite di questa tecnica è che, al fine di cambiare il mezzo senza rimuovere gli aggregati, un piccolo volume di fluido deve essere lasciato nel fondo del pozzo. Le conseguenze per gli approcci di genetica chimiche sono la necessità di considerare questa diluizione e qualsiasi effetto residue multimediale precedente: nel giorno del 3 micron Chi impulso, 2.37 mM soluzione è effettivamente consegnato, e successive modifiche medie risultato un riporto di 0,499 micron (72-96 ore) e 0.105 micron (96-120 hr) tra i punti temporali. Il lavoro attuale non è corretto per la diluizione e si presume che tutti i giorni i cambiamenti medi minimizzeranno effetti residui.

Ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo per garantire la riproducibilità sia intra e inter-sperimentale. In primo luogo, la cultura di partenza di mESCs deve essere ben mantenuto e non nel corso di confluent e medie dovrebbero sempre essere buona qualità ie., fresco e ben miscelati (Figura 5A, B). Condizioni di coltura Poveri influenzare negativamente l'aggregazione (Figura 5BI). Conteggio preciso delle cellule per ottenere una sospensione di cellule ~ 400 cellule / 40 microlitri è essenziale, come aggregati più grandi non riescono ad auto-organizzarsi e sono più propensi a formare doppi aggregati all'interno di ogni bene (Figura 5Bii) mentre gli aggregati più piccoli non sono in grado di raggiungere il corretto densità dove sono in grado di rispondere allo stimolo (Figura 5Biii). Una fase di ottimizzazione chiave era l'inclusione di un secondo lavaggio PBS che rimuove siero contaminante dalla sospensione cellulare (punto 2.6); questo migliora la frequenza aggregazione e accelerato lo sviluppo degli aggregati di circa 24 ore. Successivamente, garantendo medie modifiche vengono applicate con forza sufficiente per rimuovere eventuali aggregati che hanno il potenziale per aderire alla superficie del pozzo; in caso contrario si result in 'crash' gli aggregati (Figura 5Biv). Inoltre, come menzionato in precedenza (e sotto), è essenziale garantire che gli aggregati sono mantenute in coltura in sospensione e viene impedito di aderire a qualsiasi superficie. Una volta che gli aggregati hanno aderito, il pattern di espressione genica e il loro potenziale di allungamento sono interrotti.

Poiché questa tecnica è relativamente semplice, e ben di competenza degli individui con buone tecniche di tessuto-cultura, la maggior parte dei problemi associati con l'aggregazione può essere risolto in modo relativamente rapido se si seguono questi passaggi critici; un tavolo pieno di trouble-shooting è disponibile (Tabella 1). Una volta masterizzato, questa tecnica può essere utilizzata per studiare lo sviluppo assiale, simmetria e rottura delle cellule decisionali eventi. Più specificamente, tali aggregati hanno il potenziale per generare pool di cellule che sono stati finora disponibile in coltura, come il midollo spinale e motoneuroni r.

Ethical Nota: Si precisa con le dovute cautele che la traduzione di questo protocollo di ES umane o colture cellulari iPS potrebbe portare lo sperimentatore in prossimità della base giuridica del limite quattordici giorni sulla ricerca sugli embrioni umani, vale a dire la generazione di una linea primitiva, come dettagliato nella fertilizzazione e l'embriologia umana Act 2008 (UK) 42. Poiché la legge copre tutti gli embrioni umani vivi indipendentemente dal loro modo di creazione, cultura gastruloids umani al di là del primitivo-striscia come tappa sarà al di là della portata della ricerca licenziabile.

Acknowledgements

Questo lavoro è finanziato da un Investigator Award ERC Advanced di AMA (DAT, TB) con un contributo di un progetto di Grant del Wellcome Trust di AMA, una borsa di studio EPSRC di PB-J e Erasmus, Stichting dr. Di Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds e Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage a SCvdB. Vogliamo ringraziare J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, e T. Rodriguez, per le discussioni e le critiche costruttive, Joaquin de Navascués per il protocollo mezzo di montaggio ed entrambi AK Hadjantonakis e C. Budjan per condividere protocolli del loro laboratorio relativa alla colorazione di embrioni tutto il montaggio. Una precedente versione di questo articolo è stato precedentemente messo a disposizione sul bioRxiv Preprint Server 29.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

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