Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
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Developmental Biology
 

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Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

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Abstract

Nós desenvolvemos um protocolo de corrente melhorando corpo embrióides (EB) a cultura que permite o estudo de auto-organização, a quebra de simetria, alongamento axial e especificação de destino celular utilizando agregados de células estaminais embrionárias de ratinho (mESCs) em cultura em suspensão. Um pequeno número de mESCs são agregados em meio basal durante 48 h em placas de 96 poços não-tecido tratadas com cultura, de fundo em U, após o que são competentes para responder aos sinais experimentais. Após o tratamento, esses agregados começam a mostrar sinais de expressão do gene polarizada e gradualmente alterar a sua morfologia de uma massa esférica de células de uma estrutura alongada, bem organizada, na ausência de sinais externos de assimetria. Estas estruturas não são apenas capazes de exibir marcadores das três camadas germinativas, mas activamente exibir movimentos-gastrulação, como evidenciado por um deslocamento direccional de células individuais do agregado, a qual ocorre fundamentalmente em uma região da estrutura alongada. Este PROTOCol fornece um método detalhado para a formação reprodutível desses agregados, sua estimulação com sinais como a ativação Wnt / β-catenina e inibição BMP e sua análise por ponto de tempo único ou microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, descrevemos modificações para todo-mount rato procedimentos de coloração embrião atuais para análise immunocytochemical de marcadores específicos dentro agregados fixos. As mudanças na morfologia, expressão gênica e comprimento dos agregados pode ser medido quantitativamente, fornecendo informações sobre como os sinais podem alterar destinos axiais. Prevê-se que este sistema pode ser aplicado tanto para o estudo dos acontecimentos iniciais de desenvolvimento, tais como o desenvolvimento axial e organização e, mais genericamente, os processos de auto-organização e processo de tomada de decisão celular. Também pode proporcionar um nicho adequado para a produção de tipos de células presentes no embrião que são não obtenível a partir de cultura aderente convencional, tal como motores na espinal medula e neurónios.

Introduction

O estudo ea compreensão do destino celular no desenvolvimento de mamíferos precoce pode fazer uso de culturas de células-tronco embrionárias (CES), populações clonais derivadas de blastocistos que têm a capacidade de auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células de um organismo ie., eles são 1,2 pluripotentes. Embora essas culturas têm sido e continuam a ser úteis para a compreensão da base molecular de o destino celular, eles são incapazes de reproduzir alguns dos arranjos espaciais e comportamentos globais que são gerados em embriões durante a gastrulação. No embrião, o processo de gastrulação transforma uma única camada epitelial para as três camadas germinais diferentes e dota o embrião com uma organização ântero-posterior aberta 3-5. Tentativas para recapitulam estas eventos ex vivo têm sido baseados na geração de agregados tridimensionais de CES, referidos como corpos embrióides (EBS), e submetendo-os to condições de diferenciação 6,7. Estes agregados podem ser induzidas a diferenciarem-se em muitos tipos de células diferentes, alguns dos quais são incapazes de ser obtido ou induzida com baixa eficiência em cultura aderente ou não podem ser produzidos de forma alguma; por exemplo, sangue. 8 e 9 as células germinativas primordiais. Uma limitação na utilização dos EBs no entanto, é que eles não são capazes de exibir o comportamento morfogenético, distribuição camada germinal ou organização axial, que são as principais características do embrião em desenvolvimento, resultando em desorganização espacial 6,10. Em um relatório, o tratamento da EBS com Wnt conduz a uma fraca polarização na expressão do gene em alguns agregados, mas não é claro morfogénese observado 7. Em relatórios mais recentes, EBs que foram cultivadas por períodos de tempo prolongados desenvolver estruturas anteriores, tais como as retinas, córtex e células sensoriais do ouvido interno, que imitam os seus homólogos embrionárias mas sem desenvolver no contexto de uma organizat axialião 11-13.

Um relatório Marikawa et al. 14, enquanto que trabalha com agregados de carcinomas de células do rato P19 de embriões (CE) formados pelo método de gota suspensa, relataram o aparecimento de estruturas alongadas de origem mesodérmica reminiscente dos alongamentos que são observados com exogastrulae em anfíbio e embriões de ouriço do mar e Keller explantes 15-18. Como isto não tinha sido observado com células-tronco embrionárias de rato (mESCs), buscou-se reproduzir o comportamento observado com células P19 CE utilizando agregados de mESCs 19 e nós relatamos condições de cultura que levam à sua quebra de simetria e alongamento axial. Uma diferença importante do trabalho com células P19 é que o protocolo de agregação descrita aqui é realizado numa placa de 96 poços, semelhante ao descrito por Eiraku et al. 20, em vez de ficar pendurado gotas. Esta alteração resultou em um aumento da eficiência em termos de recuperação total e em ambosreprodutibilidade intra e inter-experimental. É importante ressaltar que a manutenção de agregados em poços individuais garante que a fusão entre os agregados (comum quando o agrupamento de agregados pendurado gotas) não ocorre. Além disso, uma característica chave do protocolo é de 24 horas de exposição ao inibidor da GSK3 CHI99021 (Chi), um potente activador da sinalização de Wnt / β-catenina, após agregação.

O método descrito aqui fornece uma base para a compreensão dos processos de auto-organização, organização axial e especificação camada germinativa em cultura, permitindo inferências a serem feitas sobre o desenvolvimento axial in vivo 19,21. Por estas razões, o método possui o potencial para permitir a análise mecanicista detalhada de processos que podem ser difíceis de estudar no embrião. Além disso, uma aplicação potencial é na produção de tecidos e órgãos que não são facilmente obtidos em cultura aderente devido à falta de um nicho, tal como estruturada celularmedula espinhal precursores 21 e motor neurônios. Cultura agregado tridimensional oferece uma estrutura física e ambiente de sinalização que não pode ser alcançado através de meios convencionais, levando a uma nova abordagem para a derivação de linhagens embrionárias de um modo organizado espacialmente.

Protocol

1. Condições de Cultura Antes de Agregação

  1. Manter mESCs em forma ESLIF (ver Tabela de materiais específicos e materiais para formulação) em frascos de 2-tecido tratado de cultura revestidos com gelatina 25cm de num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2 21-25.
  2. Cultivar células por pelo menos duas passagens deixar descongelar antes de usar neste protocolo; células em passagens inferiores são geralmente mais bem sucedido na geração de características reprodutíveis ao longo repetições experimentais (isto é., há mais de 15 passagens em cultura), ainda que ligeira variação entre as diferentes linhas de células ES é para ser esperado (ver Tabela 2 para as linhas celulares testadas ).
  3. Crescer as células até 40-60% de confluência. Não utilize células over-confluentes para agregação.

2. Geração de Agregados

  1. PBS pré-quente (+ Ca2 +, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27
  2. Aspirar o meio de cultura a partir do balão de cultura de tecidos (passo 1.3). Lavar o balão suavemente com 5 ml de PBS, duas vezes. Aspirar o PBS e adicionar 1 a 2 ml da pré-aquecido tripsina-EDTA (0,25%) para dissociar as células.
    1. Colocar o balão na incubadora para <5 min ou até que as células já totalmente separada da superfície do frasco. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 1 ml para gerar suspensão de células individuais para a contagem exacta e a formação uniforme da dimensão do agregado.
  3. Neutralizar tripsina com 5-10 ml ESLIF; lavar a superfície de crescimento para maximizar a recuperação de células e transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml. Remove-se uma alíquota de 1 ml a partir do tubo de centrífuga e contar as células com um hemocitómetro.
  4. Determinar o volume de suspensão requerida para dar 10 células / ul (toda uma placa de 96 poços requer 4 5x10 células em 5 ml de uma suspensão). Contar as células de forma precisa, tão grande Deviatiões de o número de células indicado pode afectar a resposta dos agregados aos estímulos.
  5. Adicionar 5x10 4 células para 5 ml pré-aquecido PBS num tubo de 50 ml fresco centrífuga de rotação e a ~ 170 x g durante 5 min.
  6. Aspirar cuidadosamente o PBS e adicionar 5 ml de pré-aquecido PBS suavemente; não perturbar o sedimento no fundo do tubo. Centrifugar a 170 xg durante ~ 5 min.
  7. Aspirar cuidadosamente PBS durante um segundo tempo. Remover o máximo possível de PBS sem perturbar o sedimento como PBS transição pode afectar adversamente a agregação. Ressuspender o sedimento em primeiro lugar, em 1 ml de N2B27 quente com uma pipeta P1000 para gerar uma suspensão de células homogénea, seguido de outra adição de N2B27 para o volume requerido (por exemplo, adicionar 4 ml de 5x10 4 células / 5 ml de suspensão).
  8. Transferir a suspensão de células para um reservatório esterilizado e pipetar uma gota de 40 ul para o fundo de cada poço de um não-tecido-cultura tratada, 'u' de fundo 96-Well placa utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Cobrir a placa com 96 cavidades com a sua tampa correspondente e confirmar a presença de células com um microscópio invertido de bancada (Figura 1B).
    Nota: É essencial que estas placas são usados ​​para limitar a possibilidade de as células aderentes. Não revestir o fundo da placa de 96 poços com gelatina, fibronectina ou qualquer outro revestimento que promove a adesão celular.
  9. Incubam-se as células durante 48 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 para a agregação.

3. Aplicando Estímulos e Alterando Médio

  1. Após o período de incubação de 48 horas, observar o aparecimento dos mESCs dentro de cada poço da placa de 96 poços para confirmar a agregação de sucesso (Figura 1E). Nota: Os agregados aparece na natureza esférica e cerca de 150-200 um de diâmetro. Consulte a seção de solução de problemas se surgirem problemas (Tabela 1).
  2. 0; Adicionar 150 ul de meio secundário fresco (3 uM Chi99021 (CHI) em N2B27 19; estoque preparadas a 10 mM em DMSO) a cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Pipeta com força suficiente para desalojar quaisquer agregados que podem ter começado a aderir ao fundo dos poços. Incubar agregados em meio secundário durante 24 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 1A).
    Nota: agregados alongados e polarizadas reproduzíveis são gerados usando esse meio secundário. Outras composições de meio secundário também pode ser utilizado, dependendo das condições experimentais necessários e exemplos são mostrados na Figura 3.
  3. Para subsequentes mudanças de meio, utilizar uma pipeta de multicanal a um ângulo (aproximadamente 30 °) para remover suavemente a 150 ul do meio secundário a partir do lado de cada poço. Em seguida, pipeta 150 uL N2B27 frescos em cada poço com uma força suficiente para desalojar quaisquer agregados que possam ter inícioEd a aderir ao fundo dos poços.
  4. Repita o ponto 3. 3 a cada 24 horas até que o curso de tempo está completo (o comprimento típico de um experimento cultura agregado é de 120 h).
    Nota: Certifique agregados estão se movendo livremente na sequência de alterações médias a garantir a reprodutibilidade e consistência dentro e entre cada placa de 96 poços. Médio deve ser trocada diariamente após o período de agregação.

4. Preparação de Unidades de imunocoloração e análise por microscopia confocal

  1. Fixação e Primary Antibody Incubação
    Nota: O protocolo descrito por AK Hadjantonakis 28 foi modificado para se adequar a imunocoloração de MESC agregados. Para os anticorpos típicos usados ​​nos nossos estudos e as suas diluições, referem-se ao trabalho publicado anteriormente 19,21,24,25,29 e Tabela 3.
    1. Use uma pipeta multicanal realizada em um ângulo (aproximadamente 30 °) para remover suavemente 150 � de meio do o ladof cada poço da placa de 96 poços. Lavar duas vezes por pipetagem de 150 ul de PBS em cada poço. Deixe um par de minutos entre cada lavagem para permitir que os agregados para resolver.
    2. Definir uma pipeta P1000 para dispensar 200 ul, fixe a ponta da pipeta e correspondente cortada a cerca de 3 mm da extremidade da ponta, com um par de tesouras estéreis. Desenhar uma porção de PBS em cada poço da placa de 96 poços de um modo curto na ponta e expeli-lo para agitar o agregado.
    3. Utilizar o mesmo ponta para elaborar o volume inteiro dentro do poço, incluindo o agregado e pipeta em uma pequena (30 mm de diâmetro) de vidro de Drosophila bem dissecção. Transferir todos os agregados a partir da placa de 96 poços que serão submetidos a regimes de imunocoloração idênticos na mesma dissecção vidro bem.
      Nota: Utilize uma nova ponta de pipeta corte na transferência de agregados de diferentes condições experimentais para evitar a passagem de agregados.
    4. Coloque o poço de vidro que contém o aggregates em um microscópio de dissecção. Agitar o vidro bem para forçar os agregados para o centro e aspirado PBS de um lado do poço com uma pipeta de Pasteur de vidro. Utilizar o microscópio para garantir que os agregados não são aspirados. Deixar um pequeno volume de PBS para dentro do poço de vidro para cobrir os agregados para impedir que sequem.
    5. Adicionar 1 ml de formaldeído preparado de fresco (4%) dissolvidos em PBS e incubar durante 2 horas a 4 ° C num agitador orbital, ajustado para uma velocidade baixa. Atenção: O paraformaldeído é conhecido por ser alergênico, cancerígeno e tóxico. Use proteção adequada durante a manipulação.
    6. Após a fixação, aspirar a solução de formaldeído no mesmo modo que o descrito no ponto 4. 1. 4 e lava-se os agregados com 1 ml de PBS três vezes, 10 minutos para cada lavagem com, num agitador orbital, ajustado para uma velocidade baixa.
    7. Aspirar o PBS como descrito no ponto 4. 1. 4 e executar mais três lavagens de 10 min, com PBS contendo 10% de soro fetal bovino e 0,2% de triton X-100 (PBSFT). Execute as lavagens de 10 min em um agitador orbital ajustado para uma velocidade baixa.
      Nota: O uso de soro fetal bovino (FBS) resulta em um tampão de lavagem clara, reduzindo o número de agregados que de outro modo seriam perdidos durante o protocolo de se foi utilizado leite. É importante notar que, após a fixação, os procedimentos de imuno-histoquímica pode ser realizada em vários outros que os descritos abaixo modos e deve ser determinada e optimizada pelo investigador.
    8. Bloquear os agregados durante 1 hora a 4 ° C em PBSFT em um balancim orbital ajustado para uma velocidade baixa. O protocolo pode ser pausada, neste ponto, e agregados bloqueado O / N, com agitação constante em uma cadeira de balanço giratório horizontal, a 4 ° C.
    9. Aspirar o PBSFT como descrito anteriormente (ver Secção 4. 1. 4) e incuba-se os agregados com 500 ul do anticorpo primário necessário diluído em PBSFT O / N a 4 ° C num agitador orbital ajustado a baixa velocidade. Cubra com filme de parafina para evitar a evaporação.
  2. Incubação do anticorpo secundário
    1. Aspirar a solução de anticorpo primário e lava-se com 1 ml PBSFT (a 4 ° C) do seguinte modo: duas vezes durante 5 min; três vezes durante 15 min; e de quatro a sete vezes durante 1 h. Executar cada etapa de lavagem a 4 ° C e em um balancim orbital ajustado a baixa velocidade. Nota: Frio meio de lavagem antes da utilização. Não realizar as lavagens em gelo como este pode fazer com que os agregados de fragmento.
    2. Aspirar o meio de lavagem final e incubar os agregados com o anticorpo secundário necessário em 500 ul PBSFT O / N a 4 ° C no escuro num giratório oscilante horizontal. Adicionar corante nuclear tal como Hoechst, se necessário.
  3. Montagem e imagem por confocal microfilme
    1. Lave os agregados, tal como descrito no ponto 4. 1. 4 com 4 ° C PBSFT. Após a lavagem final, lavar os agregados com 1 ml de PBS contendo 0,2% de FBS e Triton X-100 (PBT) do seguinte modo: duas vezes durante 5 min; três vezes durante 15 min. Realizar lavagensà TA em um balancim orbital ao abrigo da luz.
    2. Aspirar o meio tal como anteriormente descrito (secção 4. 1. 4) e incubar durante 30 min no escuro com uma solução 1: 1 de glicerol: PBT (1 ml) seguido de uma segunda incubação de 30 min com uma mistura 7: 3 de solução de glicerol: PBT (1 mL).
      Nota: Misturar o glicerol e soluções de PBT a 4 ° C utilizando um rotor.
    3. Aspirar o glicerol final: solução PBT e substituir com 1 ml de meio de montagem 24. O protocolo pode ser pausado a este ponto antes da montagem (se estiver em pausa, selar os poços com a película de parafina e armazenar os poços de coloração a 4 ° C).
    4. Monte os agregados sobre lâminas de microscópio pipetando-los em 17 gotas ul com uma ponta de corte P20 (Figura 2). Dobre fita dupla face volta sobre si mesmo quatro vezes para gerar espaçadores e anexar a cada extremidade do slide. Coloque a parte superior lamela (22 mm x 60 mm) sobre estes espaçadores (Figura 2).
      Nota: é essencial que uma ponta de corte éutilizado nesta fase, de modo a não danificar as amostras. Os espaçadores evitar o esmagamento dos agregados lamela.
    5. Uma vez que os agregados são montados, imagem as amostras usando microscopia confocal utilizando protocolos previamente descritos 19,21,24,25. Uma vez colocado no microscópio, deixar a lâmina em repouso sobre o palco por alguns minutos para permitir que os agregados se estabelecer dentro do meio de montagem.

Representative Results

Aparecimento de células imediatamente após o plaqueamento e após a totalização

Imediatamente após o plaqueamento, pode-se observar a presença de células individuais dentro de cada poço da placa de 96 poços com um padrão invertido microscópio de cultura de tecidos (Figura 1B). Dentro de 8 horas de cultivo, estas células vão ter começado a descer para o fundo do poço devida à gravidade e começaram a fundir-se em aglomerados discretos (Figura 1C). Após 24 h, as células de coalescência terá completado a agregação primária, e vai ter compactado em bem definidas, ainda agregados irregulares onde as células individuais são indistintos uma da outra (Figura 1D). Até ao final do segundo dia (48 horas), os agregados devem olhar 'clean', depois de ter tomado todas as células dentro do poço (Figura 1E); o fundo da cavidade pode ter algumas células que foram expelidas do agregado neste estágio. Fornecimentoque os agregados foram agregadas em N2B27, neste ponto em tempo, eles devem ser de forma esférica, cerca de 150-200 um de diâmetro e movendo-se livremente no interior da cavidade (isto é., não aderiram ao fundo dos poços). Agregação em outros meios (ou seja., ESLIF N2B27 ou com factores específicos) tem o potencial de alterar tanto a morfologia dos agregados inicial e a resposta a estímulos subsequentes (Turner et ai., Em preparação).

Representante Alterações Morfológicas

A adição de um pulso de 24 horas de forma secundária Chi contendo entre 48 e 72 horas (Figura 1A, 5A) gera bem definido agregados alongados polarizado que mostram a expressão dos marcadores específicos das camadas germinativas 19,21. Imediatamente após o pulso de Chi (72 h), os agregados começam a verter e as células começam a mostrar a sua resposta a estes sinais para o fim deste dia (Figura 3A). Estas respostasmanifestam-se por alterações na expressão génica e na morfologia, ambos os quais são dependentes do tratamento que os agregados têm recebido após o período inicial de 48 horas na agregação N2B27 (Figura 3B). Se é necessário apenas uma análise de ponto de extremidade, o momento ideal para a imagem dos agregados é de cerca de 96-120 horas. Neste ponto, os agregados terão desenvolvido morfologias cristalinas e padrões de expressão de gene (Figura 3A), e o seu tamanho e massa são ainda suficientemente baixo de modo que a expulsão de forma de P200 pipeta é suficiente para desalojar quaisquer que possam estar conectados. A falta de impedir a fixação do agregado para o poço vai afectar adversamente a formação de agregados (Figura 5Biv). O padrão dos agregados morfologias e expressão de genes pode ser alterada dependendo do tratamento. Os resultados representativos para regimes sustentados ou pulsados ​​com qualquer tratamento único ou combinações de fatores são mostrados para BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP inibidor do receptor), ActivinA, SB43 (Activina / inibidor nodal), bFGF ou PD03 (inibidor MEK) (Figura 3B).

Imagem agregado e Análise de Imagem Quantitative

Agregados são passíveis de imagiologia por qualquer microscopia widefield (principalmente para time-lapse imaging 19), ou fixo e histoquímica para imagem confocal 19,21 (Figura 2). O actual protocolo e imagem descrição acima permite que a informação quantitativa a ser adquirida a partir destes agregados. Seguindo confocal ou de campo amplo de captura de imagem, o comprimento e a expressão do gene correspondente ao longo do diâmetro ou da coluna vertebral do agregado (esférica ou alongada, respectivamente; A Figura 4A, B) pode ser medido. Estas análises também são directamente aplicáveis ​​a imagens de lapso de tempo, onde se pode obter informação da taxa de crescimento, o tamanho eo alongamento dos agregados sob diferentes condições (Figura 4

figura 1
Figura 1.-curso de tempo típica e início morfologias. (A) O curso de tempo típico para experimentos de agregação. As células são agregadas durante 48 horas em N2B27 contendo uma suspensão de células de rato ES (10 células / mL) em uma placa de 96 poços (P1, P2). (B) Imediatamente após o plaqueamento (t = ~ 5 minutos), as células individuais podem ser visto na suspensão e começaram a formar aglomerados por 8h (C) (D). Depois de 24 horas as células formaram um agregado único em cada cavidade, que é de aproximadamente 100 um de diâmetro. (E) Depois de agregação de 48 h, o agregado diâmetro varia de 150-200 uM. Neste ponto, o meio de agregação (N2B27) é removida e um meio secundário é adicionado, quer durante o resto da experiência (P1 na parte A) ou durante 24 horas antes de ser mudado bACK para N2B27 (p2 em parte A). A barra de escala representa 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. agregados montagem sobre lâminas de microscópio. Uma vez que os agregados foram corrigidos, imunocoradas e colocadas em meio de montagem, cada agregado é pipetada sobre uma lâmina de microscópio, como uma gota de 17 ul (A, B, B '). Bastante espaço é deixado entre as gotículas de agregação para evitar a sua fusão. Os espaçadores são feitos com uma fita de dupla face e colocado em cada canto da lâmina de microscópio (A, A ', B). É sobre estes que uma lamela de vidro é colocado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3. O efeito de diferentes tratamentos sobre a morfologia de células ES agregados. Após 2 dias de N2B27, células ES formaram agregados. A adição de factores específicos, quer como um pulso de 1 dia (A) ou continuamente (B) pode alterar o fenótipo dos agregados com respeito à polaridade da expressão do gene, o potencial de alongamento, ou a sua forma geral. Os exemplos nesta figura são agregados formados a partir de qualquer Bra :: GFP 30 (A) ou Sox1 :: GFP células ES 27 (B) de ratinho fotografadas após 120 h e tratados como indicado. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

Figura 4
Figura 4. A análise quantitativa de Agregados. Um agregado típico formado a partir de Bra :: mESCs GFP 25,30 após um pulso de 24 horas de Chi e fotografada a 120 horas. Incorporada da imagem de campo brilhante e canal de GFP é mostrado com a marcação "coluna vertebral" do agregado do ponto A para B (A) A linha segmentada, ao longo do qual a fluorescência e comprimento do agregado pode ser medida (B). O comprimento (C) e «circularidade» (D) a partir de 24 agregados na mesma experiência são mostrados. Descritores de forma, como o arredondamento (D), circularidade, o perímetro ea área pode ser medida usando a Análise de Imagem Cookbook plug-in do software de análise de imagem FIJI 35. A média indicada pela linha horizontal em cada ponto de tempo;barras de erro indicam o desvio padrão; barra de escala em (A) indica 200 um. Como existem diferenças subtis entre linhas de células repórter, espera-se que, após um pulso de Chi, o comprimento máximo e médio arredondamento mínima média dos agregados pode variar. Entre diferentes linhagens celulares, descobrimos que o comprimento máximo médio pode estar dentro da faixa de ~ 400-800 mm e a redondez mínima média entre 0,4 e 0,6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Exemplos de falhas na formação de agregados. A capacidade de gerar agregados reprodutíveis (A) depende de factores críticos, tais como (Bi) meio secundário fresco e bem misturados, (Bii, BIII) a precisão na contagem do n inicialúmero de células e (Biv), assegurando os agregados não se formam colónias aderentes ie., "acidente" para dentro da superfície do poço. Exemplos típicos dos erros na formação de agregados para cada uma das condições mencionadas (B) são mostrados. Scale-bar, como indicado; veja a tabela de resolução de problemas para obter detalhes (Tabela 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1. Guia para solução de problemas. Erros típicos associados com o protocolo de agregação são dadas com sugestões para a sua resolução.

Tabela 2
Tabela 2. Tabela de linhas celulares testadas para a formação dos aggRegates. Uma série de linhas celulares foram caracterizadas 19,22,27,30,36-40 para a formação de agregados e, embora sejam esperadas diferenças subtis entre linhas de células e foram observados, todas as linhas acima mostram dinâmica semelhantes em termos de alongamento e morfologia. Em termos de expressão do gene, o padrão de expressão é específica para o gene expresso, mas dentro de cada linha celular, o padrão de expressão é geralmente consistente ao longo de um número de passagens. Para consistência, geramos agregados de células que não tenham ultrapassado 15 passagens em cultura.

Tabela 3
Tabela 3. Lista de anticorpos representativos utilizados nestes estudos. A selecção dos anticorpos e os factores de diluição utilizados para imunocoloração agregado.

Discussion

A técnica descrita neste manuscrito de forma eficiente e reprodutível gera agregados de células-tronco embrionárias (mESCs) que a exibição organizada quebra de simetria e alongamento 19, combinando a cultura gota em suspensão descrita por Marikawa et al. 14 e EB formação. Estes agregados em ir para desenvolver alongamentos axiais, complementando os métodos existentes para a geração de órgãos anteriores de células-tronco embrionárias, como copos óptica 11 e do córtex cerebral 13, e contêm células com identidades das camadas que processos semelhantes àqueles durante a gastrulação visor de três germinativas tais como 19,21 movimento celular rápida.

É interessante especular sobre a natureza do evento de quebra de simetria, uma vez que ocorre na ausência de tecidos de padrões externos e assimetria zigótica cues 19. A formação espontânea de um eixo rudimentar pode surgir a partir de pré-existente heterogeneities na cultura inicial de células, que formam a base para o desenvolvimento de assimetria. Com efeito, as populações de células cultivadas em condições ESLIF exibir uma mistura de auto-renovação e diferenciação das células, as proporções relativas que podem variar de um para o outro agregado. Além disso, trabalhos preliminares no nosso laboratório sugerem que os agregados a partir de uma população total de células pluripotentes mostram desenvolvimento retardado e defeitos no padrão, o que sugere um papel para a heterogeneidade na formação de padrões organizada (DA Turner & A. Martinez Arias, em preparação). Também vale a pena considerar que um mecanismo de reacção em difusão podem gerar o padrão, com a difusão de um inibidor da distância a partir da superfície do agregado. Warmflash et al. 41 sugerem que tal mecanismo poderia ser responsável pelo desenvolvimento de assimetria radial na cultura aderente, tornando-se um possível candidato para a modelação em três dimensões.

Durante o INITIAl agregação período de 48 horas, as células atingem um estado semelhante ao que dentro do epiblast pós-implantação, em que são competentes para responder a sinais a partir do meio secundário 19,21,24. Tipicamente, o protocolo descrito aqui fornece as células com um pulso de meio secundário que contém factores (tais como agonistas de Wnt / β-catenina) que fornecem os sinais suficientes para alongamento. Os métodos de cultura anteriores descritos por Lancaster et al. (CES humanos usando 13) e Eiraku et al. (Com mESCs 11) usado um curto período de agregação em baixa aderência placas de 96 poços antes de células agregadas foram transferidas para gotas de Matrigel para on- indo cultura. Embora o tempo entre a inserção e a agregação de Matrigel foi diferente entre os estudos, em ambos os casos, foram utilizados grandes números de células por formação de agregados (cerca de 3,000-4,500 células). Por outro lado, o protocolo descrito aqui 19 usa muito menos células (aproximadamente 400 célulaspor agregado) que foi determinado ser absolutamente essencial para o processo de alongamento, quebra de simetria e a polarização que é observada 19. Além disso, estas estruturas alongadas são capazes de ser gerado num tempo muito mais curto período sem incorporar em matrizes artificiais: Comparar a geração de regiões cerebrais definidos por Lancaster et al (> 20-30 dias) 13 e a óptica de copos Eiraku. et al. (~ 11 dias) 11 com os 5 dias requeridos para a geração de estruturas alongadas polarizadas.

Uma das limitações com o método de cultura descrito aqui no entanto, é que eles só podem ser cultivados durante cerca de 5-6 dias após o plaqueamento, até o seu tamanho torna-os competente sob acção da gravidade a afundar-se para o fundo dos poços e forçar uma aderência ainda não sobre -Revestido-ware plástico. Outros experimentos que utilizam matrizes artificiais, como os mencionados anteriormente, pode permitir-nos aumentar o período deda observação e experimentação, e trabalho está em curso para determinar os efeitos de restringir os agregados de tal maneira. Uma outra limitação desta técnica é que, a fim de alterar a forma sem remover os agregados, um pequeno volume do meio deve ser deixada no fundo do poço. As consequências para as abordagens de genética químicos são a necessidade de considerar esta diluição e quaisquer efeitos residuais de mídia anterior: no dia do 3? M Chi pulso, 2,37 mM solução é efectivamente entregue, e as mudanças médias posteriores resultar em um carry-over de 0.499 ? M (72-96 horas) e 0,105? M (96-120 horas) entre os pontos temporais. Trabalho em curso não tenha corrigido para diluição e presume-se que as mudanças médias diárias irá minimizar os efeitos residuais.

Há uma série de etapas críticas do protocolo para garantir a reprodutibilidade intra e inter-experimental. Em primeiro lugar, a cultura a partir de mESCs deve ser bem conservado e não sobre confluent e meio deve ser sempre de boa qualidade ie., frescos e bem misto (Figura 5A, B). Condições de cultura pobres afectar adversamente a agregação (Figura 5Bi). Contagem precisa das células para se obter uma suspensão de células ~ 400 células / 40 ul é essencial, como agregados maiores não se auto-organizam e são mais propensos a formar agregados duplos dentro de cada poço (Figura 5Bii) enquanto que os agregados mais pequenos são incapazes de alcançar a correcta densidade, onde eles são capazes de responder ao estímulo (Figura 5Biii). Um passo chave optimização era a inserção de uma segunda lavagem com PBS que remove contaminantes de soro a partir da suspensão de células (passo 2.6); este melhorou a frequência agregação e acelerou o desenvolvimento de agregados por aproximadamente 24 horas. Em seguida, assegurando alterações médias são aplicados com uma força suficiente para desalojar quaisquer agregados que têm o potencial para aderir à superfície do poço; não fazê-lo results em 'crashing' os agregados (Figura 5Biv). Além disso, e tal como mencionado anteriormente (e abaixo), que é essencial para assegurar que os agregados são mantidas em cultura em suspensão e são impedidas de aderir a qualquer superfície. Uma vez que os agregados ter aderido, o padrão de expressão do gene e o seu potencial de alongamento sejam perturbadas.

Como esta técnica é relativamente simples, e bem no âmbito das competências dos indivíduos com boas técnicas de cultura de tecidos, a maioria dos problemas associados com agregação pode ser resolvido de forma relativamente rápida se essas etapas críticas são seguidas; uma mesa cheia de resolução de problemas está disponível (Tabela 1). Uma vez dominado, esta técnica pode ser utilizada para estudar o desenvolvimento axial, a quebra de simetria e célula-decisão eventos. Mais especificamente, estes agregados possuem o potencial para gerar bancos de células que até agora têm sido disponível na cultura, tais como a medula espinal e do motoneurônios r.

Nota ética: Deve-se observar com a devida cautela que a tradução deste protocolo para ES humanos ou cultura de células iPS poderia trazer o experimentador perto da base jurídica de o limite de 14 dias sobre a investigação em embriões humanos, ou seja, a geração de uma linha primitiva, conforme detalhado na Fertilização Humana e Embriologia Act 2008 (Reino Unido) 42. Uma vez que a Lei abrange todos os embriões humanos vivos, independentemente da sua forma de criação, a cultura de gastruloids humanos além da primitiva-raia como etapa seria para além do âmbito da investigação licenciável.

Acknowledgements

Este trabalho é financiado por um Investigator Award ERC Avançado para AMA (DAT, TB), com uma contribuição de um Grant Projeto do Wellcome Trust para AMA, uma bolsa de estudo para EPSRC PB-J e Erasmus, Stichting dr. De Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds e Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage para SCvdB. Queremos agradecer a J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, e T. Rodriguez, para discussões e críticas construtivas, Joaquin de Navascués para o protocolo de meio de montagem e ambos AK Hadjantonakis e C. Budjan para a partilha de protocolos do seu laboratório relativas à coloração de embriões inteiros de montagem. Uma versão anterior deste artigo foi previamente disponibilizado no bioRxiv Preprint Servidor 29.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

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