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MiRNA के मस्तिष्क विशिष्ट पछाड़ना के लिए stereotactic इंजेक्शन के लिए एक आसान विकल्प

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Neuroscience

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Suryawanshi, H., Sarangdhar, M. A., Vij, M., Roshan, R., Singh, V. P., Ganguli, M., Pillai, B. A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA. J. Vis. Exp. (106), e53307, doi:10.3791/53307 (2015).

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Abstract

Introduction

MicroRNAs कारण जीन अभिव्यक्ति और रोग में भागीदारी के लिए प्रत्यक्ष प्रमाण के नियमन में उनके सार्वभौमिक भूमिका के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा है। दवा 1,2 लक्ष्य के रूप में miRNAs सक्रिय रूप से अपनी क्षमता का पता लगाया जा रहा है। इसके अलावा, miRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन कई रोगों 3 और miRNA अभिव्यक्ति की कृत्रिम गड़बड़ी से इन परिवर्तनों के अनुकरण के साथ जुड़े रहे रोग अभिव्यक्ति में शामिल सेलुलर रास्ते अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। MiRNA को लक्षित दवाओं के ऊतक विशिष्ट वितरण वर्तमान में miRNA आधारित दवा के विकास के लिए एक बड़ी चुनौती है। Antagomirs और miRNA mimics miRNA के स्तर 4-6 perturbing के लिए होनहार एजेंट हैं। हालांकि, उनकी विशिष्टता और प्रभावकारिता को बढ़ाने कि विशेष सुविधाओं वे miRNA अभिव्यक्ति के vivo गड़बड़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से पहले antagomirs के डिजाइन में शामिल किया जाना है।

MicroRNAs विशेष रूप से प्रासंगिक हैं वर्तमान में लाइलाज neurodegenerative और न्यूरो विकासात्मक रोगों में लक्ष्य के रूप में। रक्त मस्तिष्क बाधा मस्तिष्क में antagomirs के वितरण के लिए एक प्रतिबंध बन गया है। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन व्यापक रूप से मस्तिष्क 7 में विशिष्ट स्थानों के लिए अणुओं देने के लिए कृंतक मॉडल में इस्तेमाल कर रहे हैं। यह कौशल, उपकरण और समय में व्यापक निवेश की आवश्यकता है। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन कम से कम मामूली चोट के कारण, सर्जरी शामिल है और स्थानीय वितरण के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, आक्रामक हैं। लक्षित कर न्यूरॉन्स के लिए एक प्राथमिकता के साथ सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स के उपयोग वे ट्रांस-संवहनी मार्ग के माध्यम से दिया जा सकता है के बाद से इन सीमाओं का मुकाबला लेकिन रक्त मस्तिष्क बाधा को पार कर सकते हैं। रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (RVG) से ली गई इस तरह की एक पेप्टाइड, पहले चूहों 8 में जापानी इन्सेफेलाइटिस वायरस के खिलाफ siRNA वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम antagomir प्रसव के लिए पेप्टाइड का उपयोग कर, miRNAs प्रभावी रूप से होना माउस मस्तिष्क 9 में नीचे गिरा कर सकते हैं पाया।

ontent "> miRNA की दूसरी बड़ी चुनौती तोड़े नीचे miRNAs की छोटे आकार और बारीकी से संबंधित अनुक्रम isoforms की उपस्थिति से उठता है। हम तीन निकट से संबंधित isoforms के होते हैं जो-मीर 29 MMU परिवार का उदाहरण लेते हैं, मीर 29A न्यूक्लिक एसिड (LNAs) वे भी थर्मल स्थिरता को बढ़ाने और कहा कि एक और लाभ की पेशकश बंद कर दिया, बी और सी। Antagomirs भी आम तौर पर उनके स्थिरता बढ़ाने के लिए और न्युक्लिअसिज़ द्वारा हमला करने के लिए उन्हें प्रतिरोधी प्रस्तुत करने के लिए रीढ़ की हड्डी के साथ संशोधित कर रहे हैं। और अधिक से परे गिरावट को लक्षित करने के लिए नेतृत्व steric बाधा 10। सभी रीढ़ की हड्डी के साथ संशोधनों का परिचय प्रभावी लेकिन महंगा हो सकता है। हम पहले एक इष्टतम संख्या से परे संशोधनों के आगे प्रभावकारिता में वृद्धि नहीं हो सकता है कि देखा है। antagomir के डिजाइन इसलिए antagomir का इष्टतम संशोधन शामिल है।

जटिल करने के लिए antagomir गैर covalently नोना-arginine विस्तार करने के लिए neurotropic पेप्टाइड, एक चार्ज hepta- के साथ प्रयोग किया जाता है। डी-Arginineवे प्रोटिएजों द्वारा दरार के लिए अतिसंवेदनशील नहीं कर रहे हैं के रूप में उच्च स्थिरता प्रदान के बाद अवशेषों किया जाता है। नोना-arginine हिस्सों को Hepta- वे सेल प्रकार विशिष्टता प्रदान नहीं करते हैं, हालांकि, के रूप में कुशल सेल मर्मज्ञ एजेंट काम करते हैं। Covalently नोना-arginine लिंकर, एक neurotropic, सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड उत्पन्न किया गया था करने के लिए RVG पेप्टाइड जोड़ने के द्वारा। पेप्टाइड की सकारात्मक आरोप लगाया अवशेषों परिसरों के लिए फार्म, नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लिक एसिड रीढ़ की हड्डी के साथ बातचीत। इन परिसरों को प्रभावी ढंग से संवर्धित कोशिकाओं में और ऊतकों में विवो में डीएनए या आरएनए transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: पशु विषयों सहित सभी प्रक्रिया संस्थागत पशु आचार जीनोमिक्स के संस्थान में समिति (IAEC) और एकीकृत जीवविज्ञान, नई दिल्ली द्वारा अनुमोदित किया गया है (IGIB / एईसी / 10/2013)। इस प्रोटोकॉल विशेष मीर 29 का मस्तिष्क और पछाड़ना में Antagomir-29 के लक्षित वितरण के लिए निकाला जाता है।

1. Antagomir डिजाइन की रणनीति

  1. MiRBase 11 से परिपक्व miRNA अनुक्रम निकालते हैं ( http://www.mirbase.org/ )।
  2. MiRBase रिकार्ड में "जीन परिवार" लिंक का उपयोग कर संबंधित miRNA परिवार के सदस्यों के दृश्यों को पुनः प्राप्त
    ( http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009 )।
  3. अनुक्रम पूरक रिवर्स: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण प्रदान करता हैपूरक दृश्यों रिवर्स।
  4. निम्नलिखित दिशानिर्देशों का उपयोग LNA के द्वारा संशोधित किया जा करने के लिए पदों को चिह्नित:
    1. LNA pyrimidines purines 12 से अधिक स्थिर नहीं हैं, LNA के संशोधन के लिए 3-4 अलग ठिकानों रखा थाइमिन अवशेषों को चुनें।
    2. पिछले चरण में कम से कम पाँच संशोधनों का उत्पादन करता है, तो 3-4 अवशेषों के द्वारा अलग साइटोसिन अवशेषों को चुनें।
    3. इस बीज अनुक्रम से बचा जाता है, के बाद से antagomir के 5 'अंत के लिए पांच संशोधनों को प्राथमिकता दें।

2. Antagomir-न्यूरोपेप्टाइड जटिल तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है और यह मानकीकरण की जरूरत है। किसी भी fluorescently लेबल oligonucleotide (FLO) antagomir 9 के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने के लिए। पेप्टाइड्स उच्च शुद्धता का होना चाहिए (एचपीएलसी ग्रेड, 98% शुद्धता) .Sequences और पेप्टाइड और antagomir के आरोप में 1 टेबल में दिए गए हैं।

  1. मो की संख्या तयantagomir की लेस माउस का antagomir, इसकी विषाक्तता और वजन पर दाढ़ आरोप के आधार पर इंजेक्ट किया। पेप्टाइड: पेप्टाइड की मोल्स की संख्या की गणना इंजेक्ट antagomir की दाढ़ प्रभारी अनुपात के आधार पर किया जाना है।
    नोट: माउस मस्तिष्क में विषाक्तता और प्रभावी वितरण के लिए पेप्टाइड: antagomir की दाढ़ प्रभारी अनुपात मानकीकरण। मानकीकरण के लिए पेप्टाइड: fluorescently लेबल oligonucleotide के विभिन्न दाढ़ प्रभारी अनुपात का प्रयोग करें। हम Antagomir-29 और नियंत्रण माउस का 4microgram / ग्राम शरीर के वजन में विषाक्त दोनों थे पाया। Antagomir-29 और नियंत्रण 2microgram / ग्राम शरीर के वजन में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इस प्रभावी एकाग्रता प्रत्येक microRNA के लिए अलग-अलग हो जाने की संभावना है।
  2. चरण 1 में गणना के रूप में वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ 10% डी ग्लूकोज के साथ शेयर समाधान से अलग microfuge ट्यूबों में पेप्टाइड और antagomir पतला।
  3. मध्यम vortexing गति से एक भंवर पर पेप्टाइड समाधान के साथ microfuge ट्यूब रखें।
  4. एक का 1/3 जोड़ेंयह एक भंवर मिक्सर पर अच्छी तरह से मिला है, जबकि पेप्टाइड समाधान ट्यूब को ntagomir समाधान है, धीरे-धीरे, बुद्धिमान ड्रॉप।
  5. अगले 1 मिनट के लिए भंवर पर समाधान के मिश्रण जारी रखें और फिर मिश्रण 1 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं।
  6. एक ही microfuge ट्यूब में पेप्टाइड समाधान के साथ शेष antagomir समाधान मिश्रण करने के लिए कदम 4 और 5 दो बार दोहराएँ। धीमी अलावा अभिकर्मक में प्रभावी रहे हैं कि मोनो फैलाने परिसरों के गठन के लिए महत्वपूर्ण है। रैपिड अलावा परिसरों और उनके वर्षा के एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
  7. Vortexing के बिना आरटी पर 30 मिनट के लिए जटिल सेते हैं। ऊष्मायन के इस समय के दौरान, इंजेक्शन प्रदर्शन किया जाएगा, जहां प्रयोगशाला में चूहों जलवायु के अनुकूल बनाना।

Antagomir-न्यूरोपेप्टाइड परिसर 3. पूंछ नस इंजेक्शन

  1. पशु को नियंत्रित करने के लिए, उचित आकार का एक restrainer या decapicone में माउस जगह है।
  2. कपास झाड़ू जनसंपर्क का उपयोग पूंछ की सतह को साफई-भिगो गर्म पानी (लगभग 40 डिग्री सेल्सियस) में। इस वाहिकाप्रसरण को बढ़ावा देने और नस की दृश्यता में वृद्धि होगी।
  3. एक 15-20 डिग्री कोण पर - (1.0 सीसी 0.5) इंसुलिन सिरिंज एक छोटी मात्रा के साथ पूंछ दृष्टिकोण। सिरिंज में किसी भी हवाई लागू करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। पूंछ के बाहर का भाग में शुरू करो। जटिल इंजेक्षन। सुई निकालें और किसी भी रक्तस्राव रोकने के लिए इंजेक्शन साइट (लगभग 5-10 सेकंड) के लिए सीधे एक एंटीसेप्टिक झाड़ू लागू होते हैं।
  4. संवर्धन के रूप में corncob और टिशू पेपर के साथ 3-5 के समूह में एक व्यक्तिगत हवादार पिंजरे में माउस बदलें। एक ही पिंजरे में uninjected और इंजेक्शन चूहों मत रखना।

4. व्यवहार Assays

नोट: इंजेक्शन के बाद वसूली की अनुमति के लिए इंजेक्शन और व्यवहार assays के बीच में 3-4 घंटे का समय अंतराल रखें। एक शांत कमरे के लिए माउस ले आओ। अभ्यस्त की इस अवधि के दौरान जानवरों को परेशान मत करो।

  1. करने के लिए माउस जलवायु के अनुकूल बनानानए कमरे 30 मिनट के लिए और फिर निम्न व्यवहार assays शुरू करते हैं। प्रत्येक व्यवहार परख के बीच में 10 मिनट के अंतराल रखें।
  2. Hindlimb clasping:
    नोट: इस परीक्षा में मोटर रोग और तंत्रिका संबंधी हानि इंगित करता है।
    1. स्पष्ट पृष्ठभूमि में पूंछ के पास आधार धारण करके धीरे माउस लिफ्ट।
    2. 10-15 सेकंड के लिए hindlimb स्थिति की जाँच करें। एक अनियमित माउस समय के 50% से अधिक 13 निलंबित पेट की दिशा में एक या दोनों hindlimbs वापस लेना करने के लिए जाता है, जबकि जंगली प्रकार माउस splays, पेट से दूर hindlimbs।
    3. पिंजरे के लिए माउस लौटें
  3. हाशिया परीक्षण:
    1. पूंछ पकड़ कर धीरे माउस लिफ्ट और एक पिंजरे के कगार पर रहते हैं।
    2. पिंजरे के कोने पर विशेष रूप से माउस का निरीक्षण करें। जंगली प्रकार माउस भय और संतुलन खोने के बिना आसानी से कोनों पारित कर सकते हैं। पिंजरे कगार साथ और कोनों पर चलते समय गतिविभ्रमी माउस अपनी बैलेंस, फ्रीज खो देते हैं या हिलाता है।
  4. नोट: इस परख के लिए एक संकीर्ण रनवे के फर्श पर, तैयार शोषक चादर रख (~ 70 सेमी लंबे, ~ 5 सेमी चौड़ा ~ 5 सेमी-ऊंची दीवारों के साथ।)
    1. एक हाथ से धीरे माउस पकड़ और एक ब्रश से हिंद अंग पर स्याही लागू होते हैं।
    2. एक संकीर्ण रनवे के फर्श पर शोषक शीट रखें।
    3. माउस चलना या अन्य को एक छोर से एक रनवे में एक सीधी रेखा में एक शोषक चादर पर चलाने की अनुमति दें।
    4. ताजा शोषक शीट का उपयोग कर प्रत्येक माउस के साथ इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएँ।
    5. आगे आंदोलन में लगातार दो कदम के बीच की दूरी को मापने। जानवर सिर्फ क्रमश: शुरू करने तथा अपनी दौड़ खत्म कर रहा है, जहां पहले और पिछले कुछ पैरों के निशान शामिल न करें।

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया का उपयोग करना, 50microgram fluorescently लेबल oligonucleotide (FLO) और ~ 01:15 दाढ़ प्रभारी अनुपात की 850microgram RVG पेप्टाइड के परिसरों (FLO: पेप्टाइड) तैयार किया है और पूंछ नस के माध्यम से केवल एक बार इंजेक्शन थे। गैर neurotropic रेबीज वायरस मैट्रिक्स (RVM) पेप्टाइड और FLO के परिसर में एक वितरण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। अगले दिन, चूहों के मस्तिष्क और जिगर अलग थे और एकल कक्ष निलंबन तैयार थे। प्रकोष्ठों हरी प्रतिदीप्ति के लिए माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया। FLO-RVG जटिल सफलतापूर्वक लेकिन नहीं RVM पेप्टाइड जिगर के लिए नहीं बल्कि मस्तिष्क की कोशिकाओं में FLO को जन्म दिया है, जबकि जिगर (चित्रा 2 बी, 2 डी) (मस्तिष्क कोशिकाओं में एक हरे रंग की प्रतिदीप्ति के रूप में एक दिन का एक कम से कम समय के साथ दिया और पाया गया था चित्रा 2A, -2)।

मीर 29 पांच LNA के संशोधनों के साथ डिजाइन किए गए थे के खिलाफ माउस मस्तिष्क antagomir में मीर 29 पछाड़ना। एक Antagomir-चोर के रूप में इस्तेमाल तले, गैर miRNA को निशाना अनुक्रमtrol। 50microgram Antagomir-नियंत्रण या Antagomir -29 अधिकतम पछाड़ना प्रभाव को प्राप्त करने के लिए आदेश में यह आंकड़ा 1 में दिखाया गया ~ 850microgram RVG पेप्टाइड दैनिक व्यवहार assays के द्वारा पीछा किया, तैयार है और एक दिन में 3 समय के पाठ्यक्रम पर पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था, के साथ परिसरों थे के परिसर 3 सतत दिनों के लिए प्रति दिन एक बार इंजेक्शन। चौथे दिन पर व्यवहार assays के इंजेक्शन के बिना प्रदर्शन किया गया। माउस पदचिह्न विश्लेषण चूहों (चित्रा 3 ए -3 बी) इंजेक्शन Antagomir-29 RVG के कदम लंबाई में काफी कमी देखी गई। Antagomir-29 RVG की परख clasping hindlimb स्पष्ट रूप से चूहों इंजेक्शन के पेट की दिशा में एक या दोनों hindlimbs वापस लेना करने की प्रवृत्ति के साथ अनियमित व्यवहार दिखाया। कगार परीक्षण में Antagomir-29 RVG चूहों इंजेक्ट ठंड या पिंजरे के कोने पर संतुलन की हानि के साथ व्यवहार मिलाते हुए दिखाया। चूहे xylazine हाइड्रोक्लोराइड (16milligram / किग्रा) और चौथे दिन thiopentone सोडियम (80milligram / किग्रा) (परिसर के अंतिम इंजेक्शन के बाद 24 घंटे) का इंजेक्शन द्वारा euthanized थे।मस्तिष्क के नमूने आणविक और सेलुलर विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कॉर्टेक्स, सेरिबैलम और हिप्पोकैम्पस से एकत्र कुल शाही सेना। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर परख Antagomir-29 RVG चूहों के मस्तिष्क भागों इंजेक्ट में, की अभिव्यक्ति दोनों स्तरों मीर 29, मीर 29 ए (चित्रा 4 ए) और मीर-29B (चित्रा 4 बी) के isoforms में स्पष्ट कमी देखी गई।

आकृति 1
माउस पूंछ नस में इंजेक्शन और व्यवहार के लिए चित्रा 1. स्कीमा।
मस्तिष्क में मीर 29 को लक्षित करने के लिए, RVG पेप्टाइड के साथ Antagomir-नियंत्रण या Antagomir-29 पूंछ नस के माध्यम से लगातार 3 दिनों के लिए एक दिन में एक बार इंजेक्ट किया गया था। व्यवहार assays माउस इंजेक्शन से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए, एक 3 घंटा अवधि के बाद, दैनिक प्रदर्शन किया गया। चौथे दिन ही व्यवहार assays प्रदर्शन किया गया और चूहों euthanized थे और मस्तिष्क के ऊतकों वास्तविक समय पीसीआर और सेलुलर गधे के लिए एकत्र किया गया थाays। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. RVG पेप्टाइड fluorescently माउस मस्तिष्क के लिए विशेष रूप से oligonucleotide लेबल बचाता है।
इस आलेख में वर्णित विधि का प्रयोग, परिसर के fluorescently लेबल oligonucleotides (FLO) और पेप्टाइड RVG / RVM तैयार किया है और पूंछ नस के माध्यम से केवल एक बार इंजेक्शन थे। FLO-RVG जटिल नहीं बल्कि जिगर (बी, डी) में मस्तिष्क की कोशिकाओं में एक हरे रंग प्रतिदीप्ति के रूप में पहचान की गई थी RVM पेप्टाइड जिगर नहीं बल्कि मस्तिष्क (ए, सी) 9। लिए FLO को जन्म दिया है, जबकि एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण।


चित्रा 3. मीर 29 अनियमित व्यवहार की ओर जाता नीचे दस्तक।
चौथे दिन पर माउस पदचिह्न assays के (ए) Antagomir-29 (बी) के साथ इलाज के लिए माउस के लिए लगातार दो कदम के बीच की दूरी में स्पष्ट कमी (**) पी -value <0,001 से पता चला है; एन = 3 (9 से संशोधित चित्रा।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Antagomir-29 और RVG जटिल माउस मस्तिष्क में मीर-29 नीचे-नियंत्रित करता है।
कुल शाही सेना तीन मस्तिष्क के कुछ हिस्सों से एकत्र की। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर परख मीर 29, मीर 29 ए (ए) और मीर 29B के isoforms दोनों की अभिव्यक्ति के स्तर (बी) के अनुमान लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया था (9 से संशोधित चित्रा।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम अनुक्रम चार्ज लंबाई
RVG पेप्टाइड YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK
RASN-gggg-RRRRRRRRR *
11 + 41
RVM पेप्टाइड MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA
PLD-gggg-RRRRRRRRR *
11 + 40
Antagomir नियंत्रण (तले हुए) 5 'ए सी सीएए टी CGAC सी एए सी 3' 14 - 14
Antagomir-29 5 'सी एसी टी जीए टी एएए टी जी जी 3 टीटी सी' 16 - 16
* ArginineRVG और RVM पेप्टाइड्स के सी टर्मिनल अंत में अवशेषों डी-फार्म में हैं।
Antagomir दृश्यों में LNA संशोधित ठिकानों रेखांकित कर रहे हैं।

पेप्टाइड और Antagomirs की तालिका 1. दृश्यों

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vortex
Restrainer or Decapicone
Narrow runway ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls.
Reagents
Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) GE Healthcare Dharmacon INC D0016300120
10% sterile D-glucose
Antagomir-29 Exiqon custom synthesis
Antagomir-control Exiqon custom synthesis
Neuropeptide RVG G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Neuropeptide RVM G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Other
Cotton
Warm water
Insulin syringes
Absorbent sheets
Ink
Brush
Antiseptic

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References

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