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Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

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Neuroscience

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Suryawanshi, H., Sarangdhar, M. A., Vij, M., Roshan, R., Singh, V. P., Ganguli, M., Pillai, B. A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA. J. Vis. Exp. (106), e53307, doi:10.3791/53307 (2015).

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Abstract

Introduction

I microRNA sono emersi come nuovi bersagli terapeutici per il loro ruolo universale nella regolazione dell'espressione genica e prova diretta per il coinvolgimento nella malattia. MiRNA sono allo studio attivamente per il loro potenziale come bersagli farmacologici 1,2. Inoltre, alterazioni nell'espressione di miRNA sono associati a diverse malattie 3 e simulazione di questi cambiamenti perturbazione artificiale dell'espressione dei miRNA possono essere utilizzati per studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella manifestazione della malattia. Tessuto specifico di consegna di farmaci destinati miRNA è attualmente una delle principali sfide per lo sviluppo di farmaci a base di miRNA. Antagomirs e imita miRNA sono agenti promettenti per perturbare i livelli di miRNA 4-6. Tuttavia, funzioni speciali che migliorano la loro specificità ed efficacia devono essere incorporato nel design di antagomirs prima di poter essere utilizzati in vivo perturbazione dell'espressione dei miRNA.

I microRNA sono particolarmente rilevanti come bersagli in neurodegenerativa attualmente incurabile e malattie neuro-sviluppo. La barriera emato-encefalica pone una limitazione alla consegna antagomirs nel cervello. Iniezioni stereotassica sono ampiamente utilizzati in modelli di roditori per consegnare molecole in posizioni specifiche nel cervello 7. Richiede abilità, ingenti investimenti in strumentazione e tempo. Iniezioni stereotassica sono invasivi, comporta un intervento chirurgico, causare almeno lievi lesioni e sono limitate alla consegna locale. L'uso di cellule penetrante peptidi con una preferenza per i neuroni di targeting può contrastare queste limitazioni dal momento che possono essere forniti per via trans-vascolare ma violare la barriera emato-encefalica. Tale peptide derivato dal virus della rabbia glicoproteina (RVG), è stato precedentemente usati per fornire siRNA contro l'encefalite giapponese di virus nei topi 8. Abbiamo trovato che l'uso del peptide per antagomir consegna, miRNA può essere efficacemente abbattuto nel cervello di topo 9.

ONTENUTO "> La seconda grande sfida di miRNA knock-down nasce dalla piccola dimensione del miRNA e la presenza di isoforme sequenza strettamente correlati. Prendiamo l'esempio di MMU-miR 29-famiglia che si compone di tre isoforme strettamente correlati, miR-29a , b e c. antagomirs sono generalmente modificati lungo la catena per aumentare la loro stabilità e renderli resistenti agli attacchi di nucleasi. Locked Nucleic Acids (LNA) offre un ulteriore vantaggio di migliorare la stabilità termica e anche portare a bersaglio degrado di là sterico 10. Introdurre modifiche tutte lungo la catena può essere efficace ma costoso. Abbiamo visto in precedenza che modifiche oltre un numero ottimale non può migliorare ulteriormente l'efficacia. Il design del antagomir comporta quindi la modifica ottimale del antagomir.

Per il complesso antagomir non covalente con il peptide neurotropica, una carica epta all'estensione nona-arginina è usato. D-Argininaresidui sono utilizzati poiché conferiscono maggiore stabilità in quanto non sono suscettibili di clivaggio da proteasi. Epta a tratti nona-arginina agire agenti cellulari penetrante come efficienti, anche se non conferiscono tipo di cellula specificità. Con covalentemente collegando il peptide RVG al linker nona-arginina, un neurotropica, cellule penetrante peptide è stato generato. I residui carichi positivamente del peptide interagiscono con scheletro dell'acido nucleico carica negativa, per formare complessi. Questi complessi possono essere utilizzati per trasfettare efficacemente DNA o RNA in cellule in coltura e in vivo nei tessuti.

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Protocol

Nota: Tutti i procedimenti tra cui soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Etico Istituzionale Animali (AICE) presso l'Istituto di Genomica e Biologia Integrativa, Nuova Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Questo protocollo è specificamente adattato per somministrazione mirata di antagomir-29 nel cervello e atterramento di miR-29.

1. antagomir Design Strategy

  1. Recuperare il maturo sequenza di miRNA da miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Recuperare le sequenze di relativi familiari miRNA utilizzando il link "Gene Famiglia" nel record miRBase
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Reverse completare la sequenza: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html fornisce un comodo strumento perinvertire sequenze complemento.
  4. Segnare le posizioni da modificate da LNA utilizzando le seguenti linee guida:
    1. Scegliere residui timina immessi 3-4 basi a parte per la modifica LNA, poiché pirimidine LNA sono più stabili di purine 12.
    2. Scegli residui di citosina separati da 3-4 residui se passo precedente produce meno di cinque modifiche.
    3. Priorità cinque modifiche all'estremità 5 'del antagomir, poiché questo evita la sequenza seme.

2. antagomir-neuropeptide Preparazione Complex

Nota: Questa è la fase più critica nel protocollo e ha bisogno di standardizzazione. Per standardizzare il protocollo qualsiasi oligonucleotide fluorescente (FLO) può essere utilizzato al posto del antagomir 9. I peptidi devono essere di purezza elevata (grado HPLC, 98% di purezza) .Sequences e carica di peptide e antagomir sono riportati nella tabella 1.

  1. Decidere il numero di moles di antagomir da iniettare in base alla carica molare antagomir, la sua tossicità e peso del mouse. Calcolare il numero di moli di peptide da iniettare riferiscono al rapporto molare di carica antagomir: peptide.
    NOTA: Standardizzare rapporto molare responsabile antagomir: peptide per la tossicità e la consegna effettiva nel cervello di topo. Usare differenti rapporti di carica molare di oligonucleotide fluorescente: peptide per la standardizzazione. Abbiamo scoperto che antagomir-29 e di controllo erano entrambi tossici 4microgram / grammo di peso corporeo di mouse. Antagomir-29 e di controllo sono stati utilizzati a 2microgram / grammo di peso corporeo, ma questa concentrazione efficace può variare per ogni microRNA.
  2. Diluire il peptide e antagomir in tubi microcentrifuga separati da soluzioni madri con sterile 10% D-glucosio alla concentrazione finale desiderata come calcolato al punto 1.
  3. Mantenere la provetta per microcentrifuga con la soluzione peptide in un vortice a velocità moderata vortex.
  4. Aggiungere 1/3 di unsoluzione ntagomir al tubo soluzione peptide, lentamente, goccia a goccia, mentre si miscela accuratamente su un vortex.
  5. Continuare a mescolare di soluzioni sul vortice per il prossimo 1 minuto e poi lasciare che la miscela di riposare per 1 minuto.
  6. Ripetere il passaggio 4 e 5 altre due volte per mescolare il restante antagomir soluzione con la soluzione del peptide nella stessa provetta per microcentrifuga. La lenta aggiunta è critica per la formazione di complessi mono-dispersa che sono efficaci nel trasfezione. Rapid aggiunta può provocare l'aggregazione dei complessi e la loro precipitazione.
  7. Incubare il complesso per 30 minuti a temperatura ambiente, senza vortex. Durante questo periodo di incubazione, acclimatize i topi al laboratorio dove verranno eseguite le iniezioni.

3. Coda Vena Iniezione di Complex antagomir-neuropeptide

  1. Per trattenere l'animale, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione o decapicone di dimensioni adeguate.
  2. Pulire la superficie della coda utilizzando tampone di cotone pre-imbevuto in acqua calda (circa 40 ° C). Questo promuoverà vasodilatazione e aumentare la visibilità della vena.
  3. Approccio la coda con un piccolo volume (0,5 - 1.0 cc) siringa da insulina ad un angolo di 15-20 °. Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa. Iniziare la porzione distale della coda. Iniettare il complesso. Rimuovere l'ago ed applicare un tampone antisettico direttamente al sito di iniezione (circa 5-10 sec) per fermare le emorragie.
  4. Sostituire il mouse in una gabbia ventilato singolarmente nel gruppo di 3-5, con la pannocchia e carta velina come arricchimento. Non tenere i topi uninjected e iniettati in stessa gabbia.

4. comportamentali Assays

Nota: Mantenere l'intervallo di tempo di 3-4 ore tra test di iniezione e comportamentali per permettere il recupero dopo l'iniezione. Portare il mouse in una stanza tranquilla. Non disturbare gli animali durante questo periodo di acclimatazione.

  1. Acclimatarsi il mouse per ilnuova stanza per 30 minuti e poi avviare i seguenti test comportamentali. Mantenere uno spazio di 10 minuti tra ogni test comportamentale.
  2. Clasping arti posteriori:
    NOTA: Questo test indica disfunzione motoria e danni neurologici.
    1. Sollevare delicatamente il mouse tenendo vicino alla base della coda sullo sfondo chiaro.
    2. Controllare la posizione degli arti posteriori per 10-15 secondi. Tipo selvatico sguanci topo arti posteriori distanti addome, mentre un mouse atassica tende a ritirare una o entrambe le zampe posteriori verso l'addome più del 50% del tempo sospeso 13.
    3. Ritorna il mouse per la gabbia
  3. Test Ledge:
    1. Sollevare il mouse delicatamente tenendo la coda e tenerlo sul davanzale di una gabbia.
    2. Osservare il mouse in particolare in un angolo della gabbia. Topo selvatico tipo può passare agli angoli facilmente senza paura e perdere l'equilibrio. Topo Atassica perdere il suo equilibrio, congelare o scuote mentre si cammina lungo la sporgenza gabbia e agli angoli.
  4. NOTA: per questo test a mantenere il foglio assorbente pronto, sul pavimento di una pista stretta (~ 70 cm di lunghezza, ~ 5 cm di larghezza con ~ 5 cm di alte mura.)
    1. Tenere il mouse delicatamente con una mano e applicare l'inchiostro sugli arti posteriori da una spazzola.
    2. Posizionare il foglio assorbente sul pavimento di una pista stretta.
    3. Lasciare mouse per camminare o correre su un foglio assorbente in linea retta in una pista da un'estremità all'altra.
    4. Ripetere il processo per altre due volte con ogni mouse utilizzando foglio assorbente fresco.
    5. Misurare la distanza tra due passi consecutivi nel movimento in avanti. Non includere prima e l'ultima pochi orme in cui l'animale è solo iniziando e finendo la sua corsa, rispettivamente.

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Representative Results

Utilizzando la procedura qui presentata, complessi di oligonucleotide 50microgram fluorescente (FLO) e ~ 850microgram RVG peptide di 01:15 rapporto molare di carica (FLO: peptide) sono stati preparati e iniettato una sola volta attraverso vena della coda. Complesso di non neurotropi rabbia Virus Matrix (RVM) e peptide FLO è stato utilizzato come controllo di consegna. Il giorno dopo, i topi cervello e il fegato sono stati isolati e sospensioni singola cella sono stati preparati. Le cellule sono state osservate al microscopio per fluorescenza verde. Complesso FLO-RVG stato consegnato con successo con un breve tempo di un giorno e rilevato come una fluorescenza verde nelle cellule cerebrali, ma non nel fegato (Figura 2B, 2D) mentre RVM peptide consegnato FLO al fegato, ma non nelle cellule cerebrali ( Figura 2A, 2C).

Per atterramento miR-29 in antagomir cervello di topo contro miR-29 sono stati progettati con cinque modifiche LNA. Il strapazzate, non miRNA sequenza di targeting utilizzato come antagomir-concontrollo. Complesso di 50microgram antagomir controllo o antagomir-29 con ~ 850microgram RVG peptide è stato preparato e iniettato attraverso vena della coda su un percorso tempo 3 giorno, seguito da saggi comportamento quotidiano come mostrato nella figura 1. Al fine di ottenere il massimo effetto knockdown, complessi erano iniettato una volta al giorno per 3 giorni consecutivi. Sul quarto giorno test comportamentali sono stati eseguiti senza iniezione. Analisi footprint topo ha mostrato una significativa riduzione della lunghezza del passo di antagomir-29 RVG iniettato topi (Figura 3A-3B). Arti posteriori stringendo test di antagomir-29 RVG iniettato topi ha mostrato chiaramente il comportamento atassica con tendenza a ritrarre una o entrambe le zampe posteriori verso l'addome. Nel test sporgenza antagomir-29 RVG iniettato topi hanno mostrato il congelamento o agitazione comportamento con perdita di equilibrio in un angolo della gabbia. I topi sono stati sacrificati mediante iniezione di xilazina cloridrato (16milligram / kg) e tiopentone sodico (80milligram / kg) al quarto giorno (24 ore dopo l'ultima iniezione del complesso).Campioni di cervello sono stati usati per eseguire analisi molecolare e cellulare. RNA totale raccolto dalla corteccia, cervelletto e ippocampo. Quantitativa real time PCR ha mostrato chiara riduzione dei livelli di espressione di entrambe le isoforme di miR-29, miR-29a (figura 4A) e miR-29b (figura 4B), nella antagomir-29 RVG iniettato topi parti del cervello.

Figura 1
Figura 1. Schema per l'iniezione vena della coda del mouse e il comportamento.
Al fine di indirizzare miR-29 nel cervello, antagomir-controllo o antagomir-29 con RVG peptide è stato iniettato una volta al giorno per 3 giorni consecutivi attraverso vena della coda. Saggi comportamentali sono stati eseguiti quotidianamente, dopo un periodo di 3 ore, per permettere il mouse per recuperare da iniezione. Sul quarto giorno solo test comportamentali sono stati effettuati e topi sono stati sacrificati e tessuto cerebrale sono stati raccolti per real time PCR e culo cellulareays. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. RVG peptide trasporta fluorescente oligonucleotide in particolare al cervello di topo.
Utilizzando il metodo descritto in questo articolo, complesso di oligonucleotidi fluorescente (FLO) e peptide RVG / RVM sono stati preparati e iniettato una sola volta attraverso vena della coda. Complesso FLO-RVG è stato rilevato come una fluorescenza verde nelle cellule cerebrali, ma non nel fegato (B, D), mentre RVM peptide consegnato FLO al fegato, ma non il cervello (A, C) 9. Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.


Figura 3. miR-29 abbattere conduce al comportamento atassica.
Saggi impronta del mouse (A) su quarto giorno hanno mostrato un'evidente riduzione della distanza tra due punti consecutivi per il topo trattato con antagomir-29 (B) (**) p -value <0.001; n = 3 (Figura modificato da 9). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. antagomir-29 e RVG complesso down-regola miR-29 in cervello di topo.
RNA totale raccolto da tre parti del cervello. Quantitativa real time PCR è stata effettuata per valutare i livelli di espressione di entrambe le isoforme di miR-29, miR-29a (A) e miR-29b (B) 9). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Nome Sequenza Caricare Lunghezza
RVG-peptide YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK
RASN-GGGG-RRRRRRRRR *
11 + 41
RVM-peptide MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA
PLD-GGGG-RRRRRRRRR *
11 + 40
Antagomir-control (strapazzate) 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3' 14 - 14
Antagomir-29 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' 16 - 16
* Argininaresidui a fine C-terminale di RVG e RVM peptidi sono in D-modulo.
LNA basi modificate nelle sequenze antagomir sono sottolineate.

Tabella 1. Sequenze di peptidi e antagomirs

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vortex
Restrainer or Decapicone
Narrow runway ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls.
Reagents
Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) GE Healthcare Dharmacon INC D0016300120
10% sterile D-glucose
Antagomir-29 Exiqon custom synthesis
Antagomir-control Exiqon custom synthesis
Neuropeptide RVG G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Neuropeptide RVM G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Other
Cotton
Warm water
Insulin syringes
Absorbent sheets
Ink
Brush
Antiseptic

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References

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