Intensification des Perles dans le développement d'embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l'expression des gènes

1Division of Animal Sciences, School of Biosciences, University of Nottingham
Published 1/17/2016
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Developmental Biology

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Mohammed, R. H., Sweetman, D. Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression. J. Vis. Exp. (107), e53342, doi:10.3791/53342 (2016).

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Abstract

Utilisation des embryons de poulet, il est possible de tester directement les effets soit de facteurs de croissance ou des inhibiteurs spécifiques de voies sur l'expression des gènes et l'activation des voies de transduction de signaux de signalisation. Cette technique permet la livraison de molécules à des stades de développement définis avec précision pour des moments précis de signalisation. Après cela, les embryons peuvent être récoltées et l'expression des gènes examinés, par exemple par hybridation in situ, ou l'activation des voies de transduction de signaux observées par immunocoloration.

Dans cette vidéo, perles d'héparine trempés dans FGF18 ou AG perles 1-X2 trempés dans U0126, un inhibiteur de MEK, sont greffés dans le bourgeon de membre in ovo. Cela montre que FGF18 induit l'expression de MyoD et la phosphorylation de ERK et d'expression à la fois endogène et FGF18 induite MyoD est inhibée par U0126. Perles trempés dans un antagoniste de l'acide rétinoïque peuvent potentialiser prématurée MyoD induction par le FGF18.

Cette approche peut être noused avec un large éventail de facteurs différents et les inhibiteurs de croissance et est facilement adaptée à d'autres tissus de l'embryon en développement.

Introduction

Embryons aviaires ont fourni un outil puissant pour l'étude du développement depuis de nombreuses années 1. Un de leurs caractéristiques les plus utiles est qu'ils sont relativement faciles à manipuler. Développement externe permet d'ouvrir l'œuf pour accéder à l'embryon et effectuer diverses micromanipulations y compris des exemples tels que le système de chimère caille-poulet classique pour étudier le destin des cellules 2,3, l'injection de rétrovirus pour surexpression dans des tissus spécifiques au cours du développement 4,5 et explant pour identifier les sources de signalisation de développement 6. Plus récemment chimères généré entre les hôtes non étiquetés avec greffes provenant d'une lignée de poulet transgénique exprimant la GFP a montré que la combinaison de greffage classique et modification génétique peut fournir des informations importantes sur le développement 7,8.

La facilité avec laquelle l'embryon aviaire peut être manipulé en a fait un excellent modèle pour l'étude de branche9 développement. Application des facteurs de croissance spécifiques aux membres en développement in vivo a joué un rôle dans l'identification des facteurs qui modifient branche structuration 10,11 et continue de fournir des indications sur ce processus 12. Cette approche a également été utilisée pour étudier les facteurs qui régulent le développement musculaire et a découvert de nombreux rôles pour les signaux tels que Wnts 13, HGF PGB 14 et 15.

Récemment, cette technique a été utilisée pour étudier les signaux contrôlant l'expression du gène myogénique dans le bourgeon de membre et a montré que les interactions entre FGF18 et l'acide rétinoïque peuvent contrôler le moment de l'expression de MyoD 16. En utilisant une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules qui peuvent être chargés sur des billes puis greffées directement dans les tissus spécifiques à des stades de développement définis donne la possibilité d'intervenir à presque tout moment et la région au cours du développement. Cela a été utilisé pour investigate de nombreux processus, y compris la structuration 17,18 somites, la spécification de neurones 19, la migration de la crête neurale 20 et l'extension de l'axe 21.

Nous décrivons ici un procédé de greffage des perles trempées dans soit des facteurs de croissance ou des inhibiteurs dans le développement des membres de poulet. Cela a été utilisé pour déterminer les effets de ces signaux sur la myogenèse par l'analyse de l'expression génique spécifique du muscle avec une hybridation in situ. Nous décrivons des greffons en utilisant soit des perles trempées héparine, qui sont utilisés pour des facteurs de croissance, ou des perles AG 1-X2 pour les petites molécules hydrophobes tels que l'acide rétinoïque ou de petites molécules inhibitrices de voies de signalisation spécifiques. Cependant, d'autres perles sont également disponibles qui ont été utilisées pour fournir à la fois FGF 22 et 23 Shh.

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Protocol

Déclaration éthique: Toutes ces expériences suivent le soin des animaux et les directives éthiques de l'Université de Nottingham.

1. Préparation des billes d'héparine pour le greffage

  1. Lavez perles d'héparine soigneusement dans du PBS avant de l'utiliser. Remarque: Les billes peuvent être conservées à 4 ° C sous forme de suspension dans du PBS.
    1. Choisir des perles pour le greffage en les retirant du stock avec une pipette de 20 pi en une baisse de 1 ml de PBS. Ensuite, utilisez une micropipette réglé à 2 pi de transférer des perles dans une goutte de 20 pi de PBS dans une boîte de Pétri de 3 cm. Choisissez perles basées sur la taille et, en utilisant une chaîne stéréo microscope de dissection, transférer perles sélectionnées avec une pointe de pipette P2; ceux autour de 100 um de diamètre sont idéales.
  2. Retirez le PBS à partir des perles. Retirer la plupart du liquide avec une pipette de 20 et le liquide résiduel par capillarité avec des horlogers pince fine. Remarque: Il est important d'éliminer autant que possible de sorte que la croissance factoR ne soit pas dilué quand il est ajouté aux billes.
  3. Pipeter le facteur de croissance directement sur les billes. Pour FGF18 ajouter 0,5 ul de FGF18 recombinant reconstitué à 0,5 mg / ml dans 0,1% de BSA dans du PBS. Placez plusieurs gouttes d'eau sur les bords de la cuvette pour empêcher le liquide de l'évaporation.
  4. Incuber les perles pendant 1 heure à température ambiante. Retirez les gouttes d'eau dans le plat avec une pipette Pasteur et le placer sur la glace prête pour la greffe.
  5. Si nécessaire (pour perles transparentes) transfert 4-5 perles à 2% de phénol rouge avant la greffe pour aider les visualiser. Rincer dans du PBS avant de les transférer à l'embryon.

2. Préparation de Perles AG 1-X2 pour le greffage

  1. Avant d'utiliser dériver perles avec 0,2 N de l'acide formique.
    1. Pour ce faire, utilisez une spatule pour transférer des perles à un tube de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d'acide formique 0,2 N et lavis sur une plate-forme agitation pendant 1 h.
    2. Ensuite, retirez le acide formique avec une pipette P1000 et le remplacer par 1ml d'eau. Laver pendant 1 heure et répéter six fois pour évacuer le reste de l'acide formique.
    3. Retirer le liquide restant avec une pipette P1000 et stocker les perles à 4 ° C. Remarque: Il est pas nécessaire de retirer toute l'eau résiduelle à ce stade.
  2. Retirer une petite pastille de perles d'environ 5-10 volume ul du stock à l'aide d'une petite spatule dans une boîte de Pétri de 3 cm et ajouter 1 ml de DMSO (ou tout autre solvant, le médicament est dissous dans). Note: Ceci doit fournir plusieurs centaines de perles partir de laquelle sélectionner ceux de la bonne taille.
  3. Ensuite, utilisez une pipette de P2 réglé à 2 pi de transférer perles d'environ 100 um de diamètre à une baisse de 20 pi de solvant dans une autre boîte de Pétri de 3 cm.
  4. Retirer le solvant avec une pipette 20 ul et tout solvant résiduel avec une pipette de 2 ul. Remplacer avec 20 ul de médicament à appliquer.
    Remarque: Pour la cohérence dissoudre le médicament à une concentration de 100 uM dans du DMSO (ou qui jamais solvant est utilisé),aliquote dans 20 pi et conserver à -80 ° C que certains inhibiteurs de petites molécules sont instables et il est préférable d'éviter de répéter congélation-décongélation. Si nécessaire puis diluer le médicament à la concentration souhaitée avant trempage des billes. Peuvent avoir besoin d'être déterminée empiriquement pour chaque médicament concentrations efficaces.
  5. Incuber pendant 1 heure. Protéger de la lumière le plus grand nombre de ces molécules sont sensibles à la lumière.
  6. Avant transfert greffage 4-5 perles avec une pipette de p2 fixé à 2 ul dans 20 ul de 2% de rouge de phénol dissous dans l'eau. Effectuez cette étape en utilisant un microscope à dissection stéréo pour visualiser les perles. Retirer une seule bille avec des horlogers pince fine ou une boucle de fil et rincer dans du PBS avant de les transférer à l'embryon. Ne laissez pas des perles dans 2% de phénol rouge pour plus de 15 minutes avant de l'utiliser, car cela peut entraîner une perte d'activité.

3. Préparer tungstène Aiguilles

  1. Couper le fil de tungstène fine dans 3-4 cm de longueur. Insérer une pièce de fil dans l'extrémité deune pipette Pasteur en verre et faire fondre dans un brûleur Bunsen pour fixer en position. Préparer jusqu'à 10 aiguilles pour assurer qu'il ya des pièces de rechange si elles sont endommagées lors de l'utilisation.
  2. Placez l'extrémité du fil dans une flamme chalumeau et l'y maintenir jusqu'à ce que le tungstène est blanc et la pointe est forte (environ 2-3 min). Remarque: Lors de l'utilisation de l'aiguille peut être nettoyé et ré-aiguisé dans le chalumeau au besoin.
    NOTE: Ces aiguilles peuvent également être utilisés pour faire des boucles pour le transfert de perles. Toucher doucement l'aiguille sur le banc et il se plie pour former une boucle.

4. Préparer les embryons perles greffes

  1. Incuber les oeufs avec l'extrémité émoussée jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré (3-5 jours pour la plupart des manipulations branche bourgeon). En utilisant une pince émoussée tap sur l'extrémité émoussée à casser la coquille, puis utiliser les forceps pour retirer la coque et d'exposer l'embryon. Assurer la membrane coquille est également supprimé.
    REMARQUE: 1-2 ml de PBS peut être ajouté avec une pipette Pasteur pour aider àsi cette colle à la membrane du jaune. Pipette doucement le PBS sur la surface du jaune, saisir la membrane avec la pince, en prenant soin de ne pas endommager le jaune, et tirez délicatement de l'œuf.
  2. Retirer jusqu'à 5 ml d'albumine de l'œuf avec une seringue de 10 ml et d'une aiguille G 19. Prenez seulement autant que nécessaire pour assurer l'embryon ne fait pas de contact avec la bande utilisée pour sceller l'œuf que la suppression de volumes plus importants peuvent réduire les taux de survie des embryons.
  3. Pour visualiser l'embryon ajoutez 5-6 gouttes d'artistes encre de chine à 15 ml de PBS contenant 100 U de pénicilline et de la streptomycine 0,1 mg / ml. Injecter 0,5 à 1 ml, directement sous l'embryon avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25 G.
  4. Ajouter 2-3 ml de PBS avec 1% de sérum de veau foetal et 100 UI de pénicilline et de streptomycine 0,1 mg / ml dans l'œuf afin d'assurer l'embryon ne pas se déshydrater. Utilisation aiguisés horlogers pince retirer la membrane vitelline et ouvrez l'amnios sur les bourgeons de membres en développement. Assurez l'embryon ne se dessèche pas et, Si nécessaire, ajouter plus de PBS / FCS.
    REMARQUE: Les bourgeons des membres peuvent être clairement considérés comme des excroissances appariés sur le flanc de l'embryon. À ces stades de l'embryon se révélera comme le côté droit est normalement supérieure. En conséquence, il est normalement plus facile de greffer des perles dans les membres droits et d'utiliser ceux de gauche que les contrôles controlatéral.
  5. Utilisez un fil de tungstène aiguisé de faire une incision dans le bourgeon de membre où le cordon sera implanté. Évitez de couper tout le chemin à travers le bourgeon de membre, si possible, bien qu'à jeunes stades, cela est difficile.
    NOTE: Dans les embryons âgés (stade HH 22 et ci-dessus), il est possible de sélectionner des régions spécifiques du bourgeon de membre pour le greffage mais jeunes stades cela est plus difficile que le bourgeon de membre lui-même est petite. Il est également important de se rappeler que le bourgeon de membre va croître delà du cordon greffé sorte, surtout au jeunes stades, la perle restera dans la branche proximale.
  6. Procurez-vous un cordon soit du facteur de croissance ou de la drogue en utilisant soit wa extra-finetchmakers forceps ou une boucle faite à partir d'une aiguille de tungstène. Si le cordon a été trempé dans du DMSO soit ou rouge de phénol, rincer dans du PBS avant de l'appliquer à l'embryon. Transférer le bourrelet à l'embryon à la pince / boucle de fil. Ensuite, utilisez le fil de tungstène affûtée pour insérer le cordon dans l'incision.
  7. Ajouter 1-2 ml de PBS / FCS à l'œuf veiller à ce que l'embryon est maintenu hydraté, mais éviter d'appliquer directement sur l'embryon lui-même car cela peut endommager les embryons et provoquer le bourrelet à être délogé. Sceller l'œuf avec du ruban adhésif et revenir à l'incubateur.

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Representative Results

A l'étape 21 HH MyoD est pas exprimée dans le développement des membres myoblastes bien que la coloration peut être vu dans le myotome des somites en développement (Figure 1A). La figure 1B montre l'hybridation in situ pour MyoD six heures suivant une greffe de talon FGF18. MyoD est induite dans les myoblastes à proximité de la bille tandis que il n'y a aucune expression dans le membre contralateral. Co-greffage d'un bourrelet trempé dans U0126, un inhibiteur spécifique de la MEK, les blocs de MyoD FGF18 induction (figure 1C). Greffage même un cordon de U0126 au stade HH 21 et à la recherche de l'expression de MyoD après 24 h réduit l'expression endogène de MyoD par rapport au membre controlatéral non traitées (figure 1D, E).

Dans les bourgeons de membres à HH étape 19 FGF18 ne pas induire MyoD (figure 1F). Cependant co-greffage de billes trempée dans FGF18 et l'antagoniste de l'acide rétinoïque peut surmonter cette BMS493 et MyoD ectopique est détectée (Figure 1G)

Pour confirmer que FGF18 est agissant par l'intermédiaire embryons MEK ont été récoltés 1 h après la greffe de perles et immunocolorée pour ERK phosphorylée, la cible de MEK. Figure 1H montre une image en fond clair d'un FGF18 bourrelet 1 h après la greffe, tandis que la figure 1I montre que FGF18 induit la phosphorylation rapide de ERK autour de la perle greffé. La figure 1J montre une superposition de ces images. Perles de commande trempées dans 0,1% de BSA ne pas provoquer la phosphorylation de ERK (figure 1K, L, M)

Figure 1
Figure 1. expression de MyoD dans les membres est régie par FGF18 et l'acide rétinoïque travers la phosphorylation de ERK. Membres de contrôle non manipulées au stade HH 21 ne pas exprimer MyoD (A) mais l'expression prématurée est détecté 6 heures après la greffe, un bourrelet de FGF18 (B). FGF18 et U0126 perles blocs de Co-greffage cette induction (C). Expression de MyoD endogène est perçue au stade HH 21 (D), mais cela est bloqué par greffage perles trempées dans U0126 (E). Dans précédentes bourgeons de membres expression de MyoD prématuré n'a pas été induite par FGF18 (F) mais est induit par des billes co-greffage d'trempés dans FGF18 et l'antagoniste de l'acide rétinoïque BMS493 (G). Perles de FGF18 greffées dans des membres HH21 induisent la phosphorylation de ERK après 1 h: fond clair (H), lampe fluorescente (I) et fusionnées (J) des images d'un membre de HH21 immunocolorées anti-phosphoERK. Perles de commande trempés dans du BSA ne induisent la phosphorylation de ERK: (K), fluorescent (L) et (M) fusionné images d'un membre de HH21 immunocolorées pour l'anti-phosphoERK. Ce chiffre a été modifié depuis Mok et al, 2014 16. Astérisques noirs: perles héparine; aste blancrisques: AG perles 1-X2; flèches montrent l'expression de MyoD ectopique dans les bourgeons de membres. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'utilisation de greffons de perles appliquées directement au développement des tissus in ovo est un outil puissant pour disséquer le rôle de la signalisation du facteur de croissance au cours du développement donnant un contrôle inégalé sur le stade de développement à laquelle ils sont appliqués et la durée d'exposition.

Le choix du bourrelet pour chaque type de molécule est importante. Les petites molécules hydrophobes, tels que les inhibiteurs décrits ici et l'acide rétinoïque, se lient habituellement bien aux perles AG dérivé 1-X2 bien qu'il est nécessaire de tester l'efficacité de chaque inhibiteur sur ces perles empiriquement. De même, pour des facteurs de croissance, il peut être nécessaire de tester différents types de billes. Quelques perles sont transparentes et ne peut donc être difficile de visualiser pendant les manipulations, mais un court traitement avec du phénol rouge suivi d'un rinçage dans du PBS seront les étiqueter pour assez longtemps pour effectuer la greffe.

Lors de la préparation des perles, en particulier ceux qui ont été trempé avec inhibiteurs, il est important de les protéger de la lumière dans la mesure du possible. Au cours de leur traitement initial et lors de la manipulation, ils devraient être couverts et ne supprimés lorsque perles sont transférés. Il est préférable d'utiliser des aliquotes fraîchement décongelés que certains de ces réactifs sont instables et peuvent donner des résultats négatifs erronés si pas stockés correctement. Il est également important de ne pas les laisser tremper dans du rouge de phénol pendant trop longtemps avant greffage, car cela peut réduire l'efficacité du bourrelet.

Les concentrations utilisées pour ces greffes de perles, des deux facteurs de croissance et les médicaments, sont souvent très élevés; Perles de FGF18 sont trempées dans une concentration de 0,5 mg / ml et de perles inhibiteurs à petites molécules sont souvent trempé à une concentration de 100 uM. Bien que ce soit beaucoup plus élevé que les concentrations habituellement utilisées pour traiter des cellules en solution cela est nécessaire que les quantités de facteurs de croissance et les médicaments absorbés par billes, puis libérés sont difficiles à mesurer directement, mais vraisemblablement genreste des niveaux inférieurs à ce in vivo. Il en résulte une plage de concentrations doit être testé pour chaque molécule utilisée pour déterminer une dose efficace.

Cette technique est également applicable à une large gamme d'autres tissus, tels que les somites 24, au cours du développement et peut être utilisé sur des embryons in ovo ou dans des cultures, telles que la culture 25 CE. Il est également possible de cultiver des cellules en culture qui sécrètent des facteurs de croissance spécifiques que des pastilles qui peuvent ensuite être greffées dans des embryons en développement de la même manière 26.

La combinaison de l'accessibilité, la facilité de manipulation et de faible coût rend poulet embryons un excellent modèle de développement. Comme les technologies transgéniques sont de plus en plus appliquées pour les espèces aviaires et les lignes génétiquement modifiés des deux poules et les cailles 7 27 seront disponibles la combinaison de l'embryon classique techniques de greffage avec ces oiseaux modifiés est déjà fournir de nouveaux aperçus sur dedéveloppement 8,28.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin acrylic beads Sigma H5263 The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads Bio-Rad 140-1231
Affi Gel blue beads Bio-Rad 153-7301; 153-7302 These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18 Peprotech 100-28 Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126 Cell Signalling 9903 Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493 Tocris Biosciences 3509 Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink Windsor and Newton 5012572003384 (30 ml) While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% Alfa Aesar 10404
Penicillin / streptomycin Sigma P0781 Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS

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