Author Produced

Isolering og analyse af sammensætningen af ​​Plant neglebånd Lipid Polyester Monomerer

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jenkin, S., Molina, I. Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers. J. Vis. Exp. (105), e53386, doi:10.3791/53386 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Karplanter afhængige ekstracellulære lag, der fungerer som vandtætte barrierer mellem plantevæv og det eksterne miljø. Disse lipofile cellevæg-associerede strukturer begrænser patogen infektion og regulere passiv transport af gasser, vand og opløste stoffer ind og ud af plantevæv 1. Sådanne barrierer er planten neglebånd, en synapomorphic struktur enestående for planter 2, og forskellige suberin-holdige diffusionsbarrierer. Kutikula er et oleofilt lag syntetiseret af epidermale celler, og bundet til dem via en pectiniske lag på den ekstracellulære side af cellevæggen 3-5. Det omslutter de primære aerial organer fra højere planter, der fungerer som en vigtig grænseflade mellem plantevæv og miljøet.

Cutin, den strukturelle matrix af neglebånd, og suberin er to uopløselige glycerolipiddesaturase polyestere forbundet med opløsningsmiddel-ekstraherbare voks 2,4. Disse polymere lipids er sammensat af mættede og umættede fedtsyrederivater og er begge strukturelt og funktionelt tilsvarende. Men de kan skelnes ved karakteristiske forskelle i kemisk sammensætning og deposition sites.

Suberin er en alifatisk polyester placeret inde cellevæggene i visse eksterne og interne væv danner en sekundær væg. Korkagtige væv omfatter periderms af rødder, rodknolde og bark, rod endodermis, frøskal lag og helbredte sår 2. I modsætning til indkobling, indeholder suberin polyester typisk alkoholer, mættede og monoumættede dicarboxylsyrer og en stor andel af meget-langkædede monomerer (C≥20).

Cutin er den mest rigelige lipid polyester i karplanter 6, og er sammensat af glycerol og C16-C18-interesterificeret fedtsyrederivater, såsom hydroxy og hydroxy-epoxy substitueret fedtsyrer 4. Mens sammensætningen af ​​cutin polymerervarierer på tværs tracheophyte arter, de fremherskende primære monomerer er 10, 16-dihydroxy 16: 0, 18-hydroxy-9,10-epoxy 18: 0 og 9,10,18-trihydroxy 18: 0 fedtsyrer. Interessant, Arabidopsis blade og dæmme indkobling består hovedsagelig af 18: 2 dicarboxylsyre 7,8.

Plant neglebånd også præsentere en betydelig variation i tykkelse, der spænder fra nogle få nanometer til flere mikrometer 9. Da kutikula isolation er en besværlig og tidskrævende trin, navnlig for de meget tynde blade kutikula såsom dem i Arabidopsis thaliana 8, er der udviklet metoder, der omgår kutikula isolation og valideret 7,8. Her beskriver vi en detaljeret protokol til at undersøge monomersammensætning af indkobling i Arabidopsis thaliana blade af natriummethoxid (NaOMe) -catalyzed depolymerisering og efterfølgende gaschromatografi / massespektrometri (GC / MS) analyse. Denne protokol giver en robust metode til analyse af composition af vegetabilsk lipid polyestere i hele delipiderede væv, og er blevet tilpasset fra tidligere rapporterede protokoller 7,10,11. Hele vævsprøver er først homogeniseret og udtømmende delipideret, fjerne opløsningsmidler ekstraherbare lipider, herunder kutikulære og epicuticular voks, membran lipider, og triacylglyceroler. Cellevæg-beriget rester derefter depolymeriseret i deres konstituerende methyl ester monomerer af natriummethoxid-katalyseret methanolyse. Fedtsyremethylestere ekstraheres ved forsuring, og derivatiseret til opnåelse af deres tilsvarende trimethylsilyl eller acetylderivater. Derivatiserede rester er meget svingende og kan elueres fra en gas kromatografikolonne ved en rimelig temperatur uden at ændre deres strukturelle konformation under GC / MS-analyse.

Protocol

Bemærk: Denne protokol blev tilpasset fra Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Trin 1-5 er opsummeret i figur 1.

1. Tissue Delipidering

Bemærk: Skyl altid alle glasvarer og hætter med chloroform, lade tørre under emhætte, før du bruger.

ADVARSEL: Udfør væv homogenisering og alle trin opløsningsmidler transfer under stinkskabet; altid bære kittel, handsker og sikkerhedsbriller splash beskyttelsesbriller for at undgå direkte kontakt med kemikalier og for at beskytte prøver fra forurening.

  1. Forvarm vandbad og varmeblok til 85 ° C.
  2. Ca. 0,5 g hvert blad prøve med polytetrafluorethylen (PTFE) -faced skruelåg afvejes i forvejede 20 mm x 125 mm reagensglas. Medtag fire replikater pr prøve.
  3. Place 2-propanol i en Erlenmeyer-kolbe (ca. 125 ml; 25 ml pr g SAMPle). Tilføj 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (også kendt som butylhydroxytoluen, BHT) til en slutkoncentration på 0,01% (w / v).
    Bemærk: Tilføj BHT fra en 5% (vægt / volumen) stamopløsning i methanol (BHT hjælper med at minimere oxidation af umættede fedtsyrer).
  4. Forvarm 2-propanol-opløsning til 85 ° C i vandbad.
  5. Tilsæt 12 ml varmt 2-propanol opløsningsmiddel til hvert prøverør og varme i 15 minutter ved 85 ° C i varmeblok. Dette trin inaktiverer lipaser, der kan frigøres fra sprængte celler.
  6. Lad rør køle ned til stuetemperatur og male væv grundigt med homogenisator, indtil en homogen suspension er opnået.
  7. Placer prøverne i en orbitalryster og omrystes i 1-2 timer ved 100 rpm og stuetemperatur.
  8. Centrifugeres i 10 min ved 800 xg og kassér supernatanten.
  9. Tilføj et tilsvarende volumen af ​​2-propanol og omrystes i 12 timer ved stuetemperatur.
  10. Centrifugeres i 10 min ved 800 xg og kassér supernatanten.
  11. Tilføj 12 ml CHCl 3: CH3OH (2: 1, vol / vol) til rest (25 ml pr g prøve) og rystes natten over ved 100 omdrejninger i minuttet og stuetemperatur.
  12. Centrifugeres i 10 min ved 800 xg og kassér supernatanten.
  13. Tilsættes 12 ml CHCl3: CH3OH (1: 2, vol / vol) til rest og ryst natten over ved 100 omdrejninger i minuttet og stuetemperatur.
  14. Centrifuger i 10 minutter ved 800 xg og fjernelse af opløsningsmidlet.
  15. Lad prøver tørre under stinkskabet natten over ved stuetemperatur.
  16. Air-tørre resten og derefter placere i vakuum over vandfri CaCl2 eller CaSO 4, indtil konstant vægt er nået (3-5 dage).

2. Depolymerisering: Methanolyse med natriummethoxid (figur 2)

ADVARSEL: Udfør trin 2,3-2,4, 2,7-2,8, 2,10-2,11, 2,13-2,15 og 2,17-2,18 under emhætte; altid bære kittel, handsker og sikkerhedsbriller splash beskyttelsesbriller.

  1. Forvarm varmeblok til 60 ° C.
  2. Reagensglas indeholdende den tørre remanens (vigtigt for yderligere beregninger) afvejes.
  3. Føj interne standarder til hvert rør: 25 ωL methyl heptadecanoat (1 mg / ml lager) og 25 pi ω-pentadecalactone (1 mg / ml lager).
  4. Tilføj 0,9 ml methylacetat, 1,5 ml natriummethoxid, og 3,6 ml methanol til hvert rør og hætten dem. Alternativt fremstilles en reaktionsblanding med disse tre reagenser og yderligere 6 ml portioner til hver prøve.
  5. Heat prøver til 2 timer ved 60 ° C og vortex regelmæssigt i 15 minutters intervaller.
  6. Lad prøver køle ned til stuetemperatur.
  7. Der tilsættes 10 ml methylendichlorid (CH2C 2) og 1,5 ml iseddike at udtrække fedtsyremethylesterne.
  8. Tilføj saltopløsning (0,5 M NaCl) for at udfylde hvert rør og hætte.
  9. Vortex prøver til 1 min og centrifugeres i 10 minutter ved 800 x g.
  10. Den organiske fase Transfer (lavere) til at rense mellemstore rør størrelse (16 x 125 mm reagensglas med polytetrafluorethylen (PTFE) -faced skruelåg).
  11. Tilføj saltopløsning (0,5 M NaCl) for at udfylde hvert rør og hætte.
  12. Vortex prøver til 1 min og centrifugeres i 10 minutter ved 800 x g.
  13. Fjern vandig (øvre) fase og gentage trin 2,11-2,12.
  14. Fjern alle vandige (øvre) fase.
  15. Der tilsættes vandfrit natriumsulfat (Na 2 SO 4) til opløsningsmidlet, cap rørene, og vortex i 1 min; prøver kan nu efterlades indtil den følgende dag. Hos kan efterlades dette punkt prøver natten over under stinkskabet.
  16. Centrifuger i 2 minutter ved 800 xg for at komprimere Na 2 SO 4 salt i bunden.
  17. Den organiske fase Overførsel til et lille glas engangs rør (13 x 100 mm reagensglas med polytetrafluorethylen (PTFE) -faced skruelåg).
  18. Opløsningsmidlet afdampes til tørhed under nitrogen og fortsæt til derivatisering trin. Hvis det ikke behandles med det samme, butik fordampet prøver ved -20 ° C (prøver kan være enLSO opbevaret inden fordampning trin).

3. Udarbejdelse af derivater til gaskromatografi

ADVARSEL: Udfør trin 3.1.2 og 3.1.5 - 3.1.8 under en emhætte; altid bære kittel, handsker og sikkerhedsbriller splash beskyttelsesbriller.

  1. Trimethylsilylderivater
    1. Forvarm varmeblok til 100 ° C.
    2. Tilsæt 100 pi pyridin og 100 pi BSTFA (N, O-Bis trimethylsilyl-trifluoracetamid) til hvert rør og hætten dem.
    3. Heat prøver ved 100 ° C i 10 minutter.
    4. Lad prøver køle ned til stuetemperatur.
    5. Inddampes prøver under nitrogen ved stuetemperatur. Undgå at anvende varme til prøver, monomerer er meget volatile i denne fase.
    6. Der tilsættes 500 pi af 1: 1 (v / v) heptan: toluen.
    7. Vortex prøver til 1 min og centrifugeres i 2 minutter ved 800 x g.
    8. Tilføj prøver til GC hætteglas og fortsæt til GC / MS-analyse.
  2. Acetylderivater
    Bemærk: acetylering, ændre trin 3.1.1-3.1.3 ovenfor således (ikke vist i video); trin 3.1.4-3.1.8 er de samme:
    1. Forvarm varmeblok til 60 ° C.
    2. Tilsæt 100 pi pyridin og 100 pi eddikesyreanhydrid (Ac2O) til rørene.
    3. Heat prøver 1 time ved 60 ° C.

4. GC / MS-analyse

  1. Brug en HP-5 kapillarsøjle (30 mx 0,25 mm x 0,25 um filmtykkelse) eller tilsvarende (dvs.., 5% diphenyl, 95% dimethylpolysiloxan). Program GC med helium bæregasstrøm sættes til 1,5 ml / min og ovntemperaturen programmeret fra 150 til 300 ° C ved 3 ° C / min.
  2. Brug split injektion (split 1:10) og indstille massespektrometer til at scanne tilstand i løbet af 40-600 amu (elektron indvirkning ionisering).
  3. Opret en sekvens tabel herunder opløsningsmiddel (tom), WT og mutant gentagelser, hver ved hjælp af den angivne indkobling analysemetode.
  4. Load opløsningsmiddelog prøvehætteglas på karrusellen, tilsættes hexan til sprøjte-skylning hætteglas i autosampler om nødvendigt, og starte sekvensen. Efter sekvensen er afsluttet, er tilgængelige for alle prøver alt ionkromatogram spor.

5. Data Analysis

  1. Identificer lipid polyester monomerer ved at sammenligne hver top masse spektrum offentliggøres massespektre eller ved at søge en kommerciel bibliotek hvis tilgængelig.
  2. For hver identificeret top i den samlede ionstrøm kromatogram, bruger deres respektive retentionstider for at finde de områder på integration resultater tabel fra GC / MS-software (Supplemental Figur 1).
  3. For hver monomer (kolonne AB), tilsæt området værdier fundet i integrationen tabellen (Supplemental Figur 1, kolonne D) til den tilsvarende kolonne for hver replikere prøve i Excel-tabellen af monomerer (Supplemental File 2, søjler CF), som er et regneark til at kvantificere Arabidopsisindkobling TMSI derivater. Brug Supplerende Fil 3, hvis acetylerede derivater er forberedt i stedet.
  4. Tilføj områderne de interne standarder (IS) til IS kolonner (HK). For de monomerer, der ikke er derivatiserede, nemlig fedtsyremethylestere (fames) og dicarboxylsyrer syre dimethylestere (DCA DMEs), skal du bruge 17: 0 FAME (IS1) som IS til kvantificering (lilla-skraverede celler i monomeren bordet; Supplerende Filer 2/3). For hydroxylerede monomerer, herunder primære alkoholer, ferulasyre og ω-hydroxy syrer, bruger 15: 0 15-hydroxy FAME (IS2) som IS valg for sammensatte kvantificering (grøn-shadded celler i monomeren bordet; Supplerende filer 2/3) .
  5. Tilføj tørre blade vægt for hver replikere til kolonner AX-BA (Supplemental File 2) eller AQ-AT (Supplemental File 3); Alternativt, scan blade til at beregne overfladearealer og tilføj arealværdier til monomeropløsningen tabellen at udtrykke monomere belastninger proverfladeareal.

Representative Results

Beskrevet i dette manuskript protokollen er sat op til at bestemme lipid polyester monomerer, minimere bidrag fra ikke-indkobling lipider 10 Figur 1 giver et overblik over analysen, der tilsammen tager mellem 8 (dvs. indkobling eller suberin.) -. 10 dage (fra indledende vævshøst at opnå GC data), afhængigt af hvor længe prøver lov til at tørre.

Den valgte basekatalyserede methanolyse (Figur 2) metode til at depolymerisere polyestere tidligere valideret for Arabidopsis frø, som indeholder både ind- og suberin. Væv først homogeniseret og udtømmende delipiderede til fjernelse af opløsningsmiddel-ekstraherbare lipider. Udbyttet rest efter ekstraktion, som procent af oprindelige friske vægt, er normalt 6% for A. thaliana Col-0 blade. Cellevæg beriget rester tørres i vakuum og derefter depolymeriseres i deres konstituerende methyl ester monomerer afbasekatalyserede transmethylation. To-timers inkubation blev valgt som den kritiske tid, der kræves for korrekt depolymerisering og genvinding af lipid polyester komponenter. Længere inkubationstider resulterede i forøgelse af 2-hydroxysyrer; disse potentielt stammer fra membran sphingolipider 10.

En typisk kromatogram, hvis Arabidopsis vildtype blad indkobling er vist i figur 3, for O -TMSi etherderivater (figur 3A) og O-acetyl-derivater (figur 3B). Hver top blev identificeret ved sammenligning med massespektre fra litteraturen 7,8 og en offentlig database 12 .Vores videoprotokollatet viser hvordan man forbereder TMSI derivater, men prøver kan alternativt acetyleres til at derivatisere hydroxylgrupper. Silylerede derivater er gode med henblik på identifikation, fordi de giver diagnostisk massespektre. Men acetylerede derivater er mere stabile og et godt alternativ til silyleringgang monomerer er blevet identificeret 10. For at hjælpe med at gennemføre denne protokol i laboratorier, som kun har GC koblet til flamme (FID), GC / FID er spor svarende til acetylerede derivater af WT blad cutin monomerer og til en homolog serie af fedtsyremethylestere standarder er også vist (Supplerende figur 4).

Denne metode er kvalitativ og registrerer kvantitative forskelle mellem prøver, dermed sin værdi for mutant analyse. Mængderne af de enkelte monomerer bestemmes ved hjælp af den interne standard metode til kvantificering, så sammenligninger af monomer overflod mellem prøver. Det bør præciseres imidlertid, at den maksimale størrelse (total ion tællinger) ikke kan afspejle de molære forhold af monomererne i polyesteren. Vi herunder redigerbare tabeller af monomerer til beregning af monomere beløb i Arabidopsis blad indkobling som fedtsyremethylestere og TMSI derivater (Supplerende fil 1) eller es Tyl derivater (Supplerende File 2) af alkoholer. Skal muligvis tilpasses, hvis prøverne er udvundet af forskellige organer eller plantearter disse tabeller.

Som et eksempel, har vi analyseret Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) vildtype blade og to tidligere karakteriserede null-mutant alleler af CYP86A2 / ATT1 gen, att1-1 (m-1) og att1-2 (m-2 ) 13,14. Cytokrom P450 monooxygenaser af CYP86A subfamilien kode formodede w-oxydases og deltage i suberin og indkobling monomer biosyntese. Vores resultater (figur 4) viser en betydelig reduktion i de belastninger af tre store lipid monomerer i de mutante blade sammenlignet med WT blade. I overensstemmelse med enzymets forudsagte funktion, 16: 0, 18: 2 og 18: 1 dicarboxylater blev specifikt berørt i ATT1 mutanter.

"Src =" / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg "/>
Figur 1. Oversigt over lipid polyester analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Mekanisme af NaOMe-katalyseret reaktion transmethyleringsaktivitet. Den nukleofile methoxide anioner angribe cabonyl carbon af lipid polyestere til dannelse af et ustabilt tetraedrisk mellemprodukt (A), som let dissocierer til fedtsyremethylestere og alkoxid anioner (B). Disse alkoxider er konjugatbaser og reagerer med methanol, regenererende de katalytisk aktive methoxid anioner, for dermed at fastholde yderligere depolymeriseringsprodukter reaktioner (C). Hvis vandet er til stede isystem, vil det reagere med natriummethoxid til dannelse af natriumhydroxid, en stærk base, der irreversibelt hydrolyserer estere til at producere uønskede frie fedtsyrer. Methylacetat tilsættes som en co-solvent 15 for at fjerne små mængder af natriumhydroxid i systemet (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Repræsentant total ion kromatogram af vildtype-Arabidopsis thaliana blad indkobling monomerer. (A) O-trimethylsilyl (TMSI) ether og (B) acetat hydroxyl derivater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Cutin monomersammensætning af Arabidopsis thaliana WT og to null mutant alleler af CYP86A2 genet. (Mutant-1 = att1-1 mutant-2 = att1-2) Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (n = 4) . Tilpasset fra 13, med tilladelse fra © Blackwell Publishing (2007). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1
Supplerende Figur 1. Peak integration resultater tabel fra GC / MS-software. Peaks svarende til identificerede monomerer og interne standarder er identificeret ved deres retenti til tiden (kolonne C), og der er værdier er tabuleret i kolonne D. Klik her for at downloade denne fil.

Figur 2
Supplerende fil 2. Tabel over Arabidopsis indkobling monomerer (trimethylsilylether derivater af hydroxy fedtsyremethylestere). Klik her for at downloade denne fil.

Figur 3
Supplerende File 3. Tabel over Arabidopsis Cutin monomerer (O-acetyl derivater af hydroxy- fedtsyremethylestere).dk / filer / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne fil.

Figur 4
Supplerende Figur 4. GC / FID spor af (AB) fedtsyremethylestere (FAME) fastholdelse indeks standarder (toppe er mærket med hver mættet FAME kædelængde); og (C) acetyleret A. thaliana WT blad cutin monomerer. Numre på top svarer til: 16: 0 FAME (1), ferulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarboxylsyredimethylester; FAME: fedtsyremethylestere; IS1: intern standard 1, 17: 0 FAME; IS2: intern stAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I modsætning til andre biopolymerer såsom DNA og proteiner, er anlægget lipid polyestere ikke lavet af en skabelon. I stedet deres kompositioner afhænger af specificiteten af ​​de enzymer, der er til stede i væv, der gør disse ekstracellulære polymerer. Som sådan, kemiske analyser af bestanddelen komponenter er vigtigt at forstå lipid polyester sammensætning.

Kemiske metoder til at spalte esterbindinger omfatter forsæbning, hydrogenolyse, syrekatalyseret transmethylering og basekatalyseret transmethylering 2. Hver af dem har fordele og ulemper. Forsæbning producerer frie fede syrer, hydroxy kan undergå sekundære reaktioner. Hydrogenolyse med lithiumaluminiumhydrid (LiAlH4) 16 er blevet anvendt til indkobling analyse 7. Hydrogenolyse reducerer funktionaliserede kul til alkoholer og de ​​oprindelige strukturer skal udledes af deuteriolysis med lithiumaluminiumdeuterid (LiAlD 4). DeUlempen ved denne fremgangsmåde er kravet om høj opløsning GC / MS for at sammenligne graden af ​​deuteriation af fede polyoler opnået at gøre tildelinger af deres strukturer. Syrekatalyseret transesterifikation med methanolisk bortrifluorid (BF3) er blevet hyppigt anvendt i ind- og suberin depolymerizations 8,17,18, men reagenset har en begrænset holdbarhed og kan indføre artefakter på grund af sidereaktioner 15. Methanolisk svovlsyre giver også methylestere af monomererne, men med større andele af 2-hydroxy-fedtsyrer, som formentlig ikke er sande lipid polyester komponenter sammenlignet med andre metoder 10.

Den NaOMe-katalyseret omestring beskrevet i denne protokol fremgangsmåde frembringer fedtsyremethylestere, der derivatiseres ved silylering af hydroxylgrupper, som giver karakteristiske massespektre til identifikation eller ved acetylering for at tilvejebringe mere stabile derivater af hydroxylgrupper foR kvantificering. En ulempe ved denne teknik er, at hydrolyse konkurrerer med transesterificering, når vand er til stede i reaktionen. Vand reagerer med NaOMe (katalysatoren) og producerer NaOH, hvilket igen hydrolyserer fedtsyremethylestere til opnåelse frie syrer (Figur 2D). Dette er en uønsket sidereaktion, fordi to toppe vil være til stede for hver fedtsyre: en methylester og en TMSI esterderivat, hvilket komplicerer analysen. Anvendelse af vandfrit reagenser og tilføje methylacetat som et co-opløsningsmiddel til at konkurrere med forsæbning er således afgørende skridt til at forhindre hydrolyse (figur 2D).

Ind- og suberin indeholde mellem 1 og 26% glycerol 4. Dette vil dog monomer ikke opdaget af de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet i denne protokol. Glycerol er stærkt hydrofil og i modsætning til fedtsyremethylester monomerer, vil blive elimineret under det vandige opløsningsmiddel-vasketrin. Denne begrænsning også enpplies til andre indkobling depolymeriseringsprodukter metoder, men glycerol kan bestemmes i det vandige lag opnået efter transesterificering under anvendelse af en enzymatisk metode. Alternativt kan det kvantificeres ved hjælp af mildere betingelser (f.eks., 0,05 M NaOMe) uden yderligere vand ekstraktion at finde alle monomerer, herunder glycerol 19,20 .Selv anvendelige til formålet med glycerol kvantificering, milde betingelser normalt giver ufuldstændige depolymerisering af ind- og suberin.

Hvis en GC koblet til en flamme (FID) er tilgængelig, kan alle replikater analyseres i dette instrument til kvantitative formål, efter toppe af en repræsentativ prøve er blevet identificeret ved GC / MS. Alternativt kan monomerer i GC / FID spor identificeres, hvis er kendt deres fastholdelse indekser. Den flammeioniseringsdetektor har særlig høj følsomhed og en bred vifte af proportionalitetsprincippet, som er afgørende for kvantificering af større og mindre prøvekomponenteri enkelte kørsler. Desuden er det er robust og let at vedligeholde og drive 15.

Den beskrevne protokol giver mulighed for pålidelig og reproducerbar isolation, identifikation og kvantificering af planter lipid polyester monomerer, således at kemisk karakterisering af mutanter, der afviger i sammensætning af et eller flere lipid polyester monomerer. Proceduren er skalerbar, kan det let tilpasses til at behandle både små og bulk mængder af forskellige plantematerialer, herunder rødder, frø, blade, stængler og blomster. Massespektraldata data for lipid polyester monomerer fra mange arter er blevet offentliggjort, f.eks., 21-26 og udgør værdifulde ressourcer til at identificere ukendte monomerer når at tilpasse denne protokol til andre væv og / eller arter. Denne metode kan anvendes til undersøgelser af biosyntesen, regulering og distribution af lipid polyestere i højere planter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2-propanol Fisher Scientific BPA451-4 Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate Fisher Scientific S421500
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102 Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) Sigma-Aldrich 15222 Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT) Sigma-Aldrich 101162 Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous Fisher Scientific C614-3 Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) Acros Organics 219090020 Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane) Fisher Scientific C6074 Organic solvent
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401212 Acidification agent
Helium carrier gas, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1046 Carrier gas, GC/MS
Heptane Fisher Scientific H3501 Organic solvent
Hexanes Fisher Scientific H3024 Organic solvent
Methanol Fisher Scientific A4124 Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate Sigma-Aldrich 296996 Organic solvent
Methyl heptadecanoate Sigma-Aldrich H4515 Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane) Fisher Scientific D374 Organic solvent
Nitrogen, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1044 Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone Fluka 76530 Internal standard (1 mg/ml stock)
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 Co-solvent for derivatization
Sodium chloride Fisher Scientific BP358212 Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%) Sigma-Aldrich 156256 Nucleophile
Toluene FIsher Scientific T2904 Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX Premier Tech Horticulture Ltd Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Purdue Methods for Arabidopsis Growth. 
PermaNest Humidity Dome  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-20125
GC vial caps National Scientific C400051A
GC vial microinserts National Scientific C4011631
GC vials National Scientific C40001
Disposable pasteur pipets Fisher Scientific 1367820B
Flasks Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge Beckman Coulter
Analytic balance Fisher Scientific
Belly dancer A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column J&W Scientific, CA, USA;  30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer Thermo Scientific
Heat block Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph Thermo Scientific
Two-stage regulator Air Liquide Q1-318B-580
Vacuum desiccator Fisher Scientific
Vortex mixer Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolattukudy, P. Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science. 208, (4447), 990-1000 (1980).
  2. Kolattukudy, P. E. Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).
  3. Yeats, T. H., Rose, J. K. C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol. 163, (1), 5-20 (2013).
  4. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends Plant Sci. 13, (5), 236-246 (2008).
  5. Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 15, (3), 329-337 (2012).
  6. Heredia, A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. Biophys. Acta. 1620, (1-3), 1-7 (2003).
  7. Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component. Plant J. 40, (6), 920-930 (2004).
  8. Franke, R., et al. Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin. Phytochemistry. 66, (22), 2643-2658 (2005).
  9. Vogg, G., et al. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55, (401), 1401-1410 (2004).
  10. Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds. Phytochemistry. 67, (23), 2597-2610 (2006).
  11. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
  12. Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. LipidHome. Available from: http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html (2015).
  13. Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant J. 53, (3), 437-449 (2008).
  14. Xiao, F., et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23, (14), 2903-2913 (2004).
  15. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446 (2010).
  16. Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry. Biochemistry. 11, (10), 1885-1896 (1972).
  17. Matzke, K., Riederer, M. A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L. Planta. 185, (2), 233-245 (1991).
  18. Riederer, M., Schönherr, J. Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin. J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).
  19. Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis. Plant Physiol. 119, (3), 1137-1146 (1999).
  20. Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry. 61, (2), 205-215 (2002).
  21. Eglinton, G., Hunneman, D. H. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle. Phytochemistry. 7, (2), 313-322 (1968).
  22. Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. 9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin. Chem. Phys. Lipids. 32, (1), 13-26 (1983).
  23. Holloway, P. J. Intracuticular lipids of spinach leaves. Phytochemistry. 13, (10), 2201-2207 (1974).
  24. Holloway, P. J., Deas, A. H. B. Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins. Phytochemistry. 12, (7), 1721-1735 (1973).
  25. Holloway, P. J. The chemical constitution of plant cutins. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. Academic Press. London. 45-85 (1982).
  26. Croteau, R., Fagerson, I. S. The constituent cutin acids of cranberry cuticle. Phytochemistry. 11, (1), 353-363 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics