Axonal अध: पतन और सफेद पदार्थ तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक subcortical की बहुमुखी murine मॉडल सफेद पदार्थ स्ट्रोक

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Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

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Abstract

स्ट्रोक नैदानिक ​​स्ट्रोक प्रस्तुतियों के ऊपर से 25% के लिए सफेद पदार्थ खातों को प्रभावित करने, दरों कि 5-10 गुना अधिक हो सकता है पर चुपचाप होता है, और संवहनी मनोभ्रंश के विकास में महत्वपूर्ण योगदान देता है। फोकल सफेद पदार्थ स्ट्रोक के कुछ मॉडल मौजूद हैं और उपयुक्त मॉडल की इस कमी neurobiologic स्ट्रोक के इस प्रकार के बाद चोट प्रतिक्रिया और मरम्मत में शामिल तंत्र की समझ बाधा उत्पन्न की है। अन्य subcortical स्ट्रोक मॉडल की मुख्य सीमा है कि वे focally सफेद बात करने के लिए रोधगलितांश सीमित नहीं है या मुख्य रूप से गैर murine प्रजातियों में मान्य किया गया है। यह सफेद पदार्थ स्ट्रोक के तंत्रिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के murine अनुसंधान उपकरण की व्यापक विविधता लागू करने की क्षमता को सीमित करता है। यहाँ हम एक अपरिवर्तनीय एनोस अवरोध की एक स्थानीय इंजेक्शन का उपयोग murine सफेद पदार्थ में एक केन्द्र स्ट्रोक के विश्वसनीय उत्पादन के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं। हम भी दो अद्वितीय स्टीरियोटैक्टिक सहित सामान्य प्रोटोकॉल पर कई रूपों पेशविविधताओं, प्रतिगामी न्यूरोनल ट्रेसिंग, साथ ही ताजा ऊतक लेबलिंग और विच्छेदन है कि बहुत से इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों का विस्तार। इन बदलावों एकाधिक दृष्टिकोण स्ट्रोक के इस आम और understudied फार्म की neurobiologic प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देते हैं।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में जानवरों के इस्तेमाल कैलिफोर्निया लॉस एंजिल्स पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया है।

नोट: लक्ष्य murine आबादी की पहचान के द्वारा शुरू करो। पूर्व के अध्ययन में, केवल पुरुष जंगली प्रकार C57 / BL6 चूहों का इस्तेमाल किया गया है, हालांकि विभिन्न ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। ध्यान दें कि स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक C57 / BL6 शरीर रचना विज्ञान पर आधारित हैं। यह सिफारिश की है कि प्रत्येक उपयोगकर्ता के शुरू में सफेद पदार्थ को स्ट्रोक का स्थानीयकरण की पुष्टि करें।

1. सफेद पदार्थ स्ट्रोक प्रेरण - औसत दर्जे Angled दृष्टिकोण

  1. 0.5 मिमी केशिका ट्यूब ऐसी है कि बाहर का व्यास के बीच 15-25 माइक्रोन 11 का उपयोग कर एक खींच लिया गिलास पिपेट तैयारी द्वारा शुरू करो।
  2. 27.4 मिलीग्राम / बाँझ 0.9% सामान्य खारा में मिलीलीटर (130 माइक्रोन) के कम से - एल एनआईओ की एक बाँझ 10 μl विभाज्य ((1) -iminoethyl एल ओर्निथिन एचसीएल एन (5)) तैयार करें।
  3. खींच लिया गिलास पिपेट पहले से भरनाकांच पिपेट affixing द्वारा एल एनआईओ (2-5 μl) की एक छोटी मात्रा के साथ एक निर्वात लाइन से जुड़ा टयूबिंग के लिए। बेंच शीर्ष पर पिपेट फ्लैट करना और एल एनआईओ समाधान में खींच लिया अंत डालें।
    1. वैक्यूम लागू जब तक पिपेट का 0.5 मिमी भाग के कम से कम 2 मिमी भर जाता है। वैक्यूम बंद करें और पिपेट वापस ले लें। यह एक तरफ कदम 1.12 तक रखें।
  4. एक प्रेरण कक्ष में माउस रखें और माउस मानक 32% isoflurane का उपयोग करने का संज्ञाहरण प्रेरित एक vaporizer के माध्यम से प्रवाहित होती है 1 मिनट के लिए या गहरा anesthesized तक (5 एल / मिनट 5 एल / मिनट ऑक्सीजन और 0.5 एल / मिनट के साथ 2 एन साँस)। एक स्टीरियोटैक्टिक एक स्टीरियोटैक्टिक माइक्रोस्कोप से लैस तंत्र के लिए माउस स्थानांतरण। एक vaporizer के माध्यम से प्रवाहित होती रखरखाव संज्ञाहरण 32% isoflurane का उपयोग प्रदान करने और एक नाक शंकु (2 एल / मिनट 5 एल / मिनट ऑक्सीजन और 0.5 एल / मिनट एन 2 के साथ साँस)। एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें।
  5. 36 डिग्री के लिए इंजेक्शन हाथ समायोजित करें।
  6. AffiXa एक कम मात्रा दबाव इंजेक्शन प्रणाली के बाहर का अंत करने के लिए गिलास पिपेट धारक खींच लिया और स्टीरियोटैक्टिक सेटअप के इंजेक्शन हाथ को देते हैं।
  7. कोट पेट्रोलियम जेली और दोनों आंखों पर जगह कृत्रिम आंसू मरहम के साथ anesthetized जानवर की मूंछ। सिर पर एक 5-10 सेमी खोलने के साथ पशु के सिर पर एक बाँझ कपड़ा रखकर एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें। फर खोपड़ी overlying शेविंग द्वारा एक aspetic शल्य सतह तैयार करें। बारी betadine और 70% शराब swabs के साथ खोपड़ी को साफ करें।
  8. खोपड़ी की सतह को बेनकाब करने के लिए बाँझ ठीक कैंची के साथ एक 1.5 सेमी midline खोपड़ी चीरा। एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी सूखी और 1-3X बढ़ाई पर एक स्टीरियोटैक्टिक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, एक बाँझ सूक्ष्म बिंदु उपकरण का उपयोग कर किसी भी overlying periosteal ऊतक को हटा दें।
  9. शीर्षस्थान ठीक एक बिंदु मार्कर का उपयोग कर एक संदर्भ बिंदु के रूप में चिह्नित।
  10. एक 2 मिमी ellipitical craniotomy ड्रिल एक बाँझ ठीक stip शल्य ड्रिल बिट का उपयोग0; शीर्षस्थान पर पीछे शुरुआत और पूर्व से सिर्फ midline की बाईं विस्तार। हड्डी के टुकड़े निकालें और कोमल ऊतकों overlying इतना है कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स देखे जा सकते हैं।
  11. रुक-रुक कर बाँझ खारा की बूंदों को लागू करने से शल्य चिकित्सा क्षेत्र और cortical सतह नम रखें।
  12. स्टीरियोटैक्टिक तंत्र के इंजेक्टर हाथ करने के लिए एक खींच लिया गिलास पिपेट प्रत्यय। शीर्षस्थान साथ पिपेट के बाहर का अंत संरेखित करें और शून्य स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक।
  13. पहले पूर्वकाल / पीछे (ए / पी) के लिए पिपेट अग्रिम और पार्श्व (एम / एल) तालिका 1 में प्रदान निर्देशांक औसत दर्जे /।
  14. cortical सतह के लिए पिपेट अग्रिम और शून्य पृष्ठीय / उदर (डी / वी) माप।
  15. धीरे-धीरे पहले डी / वी तालिका 1 में समन्वय स्थापित तक पहुँचने तक मस्तिष्क में पिपेट गुजरती हैं।
  16. एक कम मात्रा दबाव इंजेक्शन प्रणाली 20 मिसे दालों के लिए 20 साई में सेट का उपयोग कर, मस्तिष्क में एल एनआईओ के 100 nl इंजेक्षन और भाटा को रोकने के लिए 5 मिनट इंतजारपिपेट ट्रैक।
    1. स्टीरियोटैक्टिक माइक्रोस्कोप के आईपीस और 3X के एक बढ़ाई में एक calibrated लजीला व्यक्ति का प्रयोग करें।
    2. तदनुसार, (एक 0.5 मिमी व्यास पिपेट में 0.5 मिमी लंबाई, 100 nl के लिए इसी) 0.100 मिमी 3 की कुल विस्थापित निर्देशांक के प्रत्येक सेट के लिए खींच लिया गिलास पिपेट से। एक reticule का उपयोग करके, उपाय और प्रमाण के बाद से प्रत्येक सेट अप बढ़ाई और तराजू इस्तेमाल पर निर्भर करता है।
    3. प्रत्येक इंजेक्शन के दौरान सटीक मात्रा माप के लिए, की ओर से माइक्रोस्कोप के साथ कोणीय पिपेट दृष्टिकोण ताकि हवा-द्रव meniscus एक बाण दृश्य है। meniscus पिपेट के दोनों आंतरिक और बाहरी दीवार का एक ही फोकल हवाई जहाज़ में दिखाई देनी चाहिए।
  17. धीरे धीरे पिपेट वापस लेने और चरणों को दोहराएँ 1.13-1.16.3 तालिका 1 में प्रदान निर्देशांक के दूसरे और तीसरे सेट में।
  18. अंतिम इंजेक्शन के बाद, पिपेट को दूर करने और पर्याप्त हड्डी मोम जगह craniotomy साइट को भरने के लिए। एखोपड़ी घाव के किनारों pproximate और चमड़े का चिपकने के साथ बाँध।
  19. एक बाँझ 30 जी सुई का उपयोग खोपड़ी चीरा के साथ जुड़े स्थानीय दर्द को रोकने के लिए रोकने के लिए घाव मार्जिन में 0.5% की Marcaine 0.1 मिलीलीटर इंजेक्षन।
  20. 5 दिनों के लिए पीने के पानी में आवास और आपूर्ति के पोस्ट ऑपरेटिव एंटीबायोटिक दवाओं के लिए पशु (0.48 मिलीग्राम / एमएल trimethoprim-sulfamethoxazole, या 0.5 मिलीग्राम / एमएल लिवोफ़्लॉक्सासिन) लौटें।

2. सफेद पदार्थ स्ट्रोक प्रेरण - पोस्टीरियर Angled दृष्टिकोण

  1. औसत दर्जे का कोणीय दृष्टिकोण प्रोटोकॉल में कदम के रूप में 1.1-1.12 प्रदर्शन करना है, सिवाय इसके 45 डिग्री पीछे करने के लिए उन्मुख पूर्वकाल के लिए स्टीरियोटैक्टिक सेटअप के इंजेक्शन हाथ समायोजित करें।
  2. पहले ए / पी करने के लिए पिपेट अग्रिम और एम / एल तालिका 2 में प्रदान की समन्वय करता है।
  3. पूरा बचे हुए चरणों 1.14-1.20 पार्श्व कोणीय दृष्टिकोण प्रोटोकॉल के रूप में।

3. प्रतिगामी neuronal लेबलिंग

  1. एक बाँझ 10 तैयार0.9% सामान्य नमक में 54.8 मिलीग्राम / एमएल एल एनआईओ के μl विभाज्य।
  2. 0.9% सामान्य खारा में 20% Fluororuby (या 20% biotinylated dextran अमाइन या 2% Fluorogold) के एक बाँझ विभाज्य तैयार करें।
  3. एक साथ पतला 1: 1 27.4 मिलीग्राम / एमएल एल एनआईओ और 10% Fluororuby के अंतिम सांद्रता के लिए।
  4. कदम 1.3-1.23 में ऊपर के रूप में स्ट्रोक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना।
  5. छिड़काव निर्धारण, cryosectioning और माइक्रोस्कोपी द्वारा ऊतक अनुभाग में natively फ्लोरोसेंट ट्रेसर कल्पना के रूप में पहले 8 का वर्णन किया।

4. immunofluorescence के लिए ऊतक प्रसंस्करण

  1. एक उपयुक्त पद स्ट्रोक 3 घंटा से 14 दिनों के झटके के बाद से लेकर अंतराल पर, euthanize isoflurane अधिक मात्रा या स्थानीय IACUC के माध्यम से चूहों प्रक्रिया को मंजूरी दी।
  2. कोणीय कैंची का उपयोग वक्ष गुहा खोलें और बाएं वेंट्रिकल में एक 23 जी तितली सुई डालें।
  3. सही आलिंद ठीक कैंची का उपयोग छिड़काव तरल पदार्थ के लिए एक बहिर्वाह ट्रैक अनुमति देने के लिए एक छोटे से कट रखें।
  4. Transcardially आरटी पर 10 मिलीग्राम / मिनट की दर से ठंड फॉस्फेट बफर खारा ठंड 4% paraformaldehyde के 30-40 मिलीलीटर के द्वारा पीछा के 30-40 मिलीलीटर के साथ छिड़कना।
  5. माउस सिर काटना और पीछे खोपड़ी को खोलने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग मस्तिष्क को हटा दें और फिर धीरे overlying खोपड़ी एक रंग के साथ, ठंड 4% पीएफए ​​में 24 घंटे के लिए हटाने जगह मस्तिष्क, और फिर 48 घंटे के लिए पीबीएस में 30% sucrose के लिए स्थानांतरण ।
  6. चालीस माइक्रोन चल एक cryostat का उपयोग कर वर्गों को तैयार है और जैसा कि पहले 6-8 वर्णित एंटीबॉडी प्रसंस्करण प्रदर्शन करते हैं। इस अध्ययन में, निम्न एंटीबॉडी का उपयोग करें: खरगोश विरोधी neurofilament 200 (1: 500 कमजोर पड़ने); खरगोश विरोधी vimentin (1: 500); बकरी विरोधी GFAP (1: 500); खरगोश विरोधी मोबाइल -1 (1: 1000)।

5. प्रोटीन या शाही सेना के विश्लेषण के लिए ऊतक प्रसंस्करण

  1. एक उपयुक्त पद स्ट्रोक 3 घंटा से 14 दिनों के झटके के बाद से लेकर अंतराल पर, isoflurane अधिक मात्रा के माध्यम से euthanize या स्थानीय IACUC प्रक्रिया को मंजूरी दी।
  2. सिर काटनामाउस और पीछे खोपड़ी को खोलने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग मस्तिष्क को हटा दें और फिर धीरे से एक रंग के साथ overlying खोपड़ी को हटा दें।
  3. घ्राण बल्ब और ऑप्टिक नसों तोड़ मस्तिष्क के मोर्चे पर एक बाँझ 4 मिमी रंग डालें। धीरे calvarium से बाहर मस्तिष्क उठा और ठंडा विच्छेदन बफर (1x हांक बैलेंस्ड नमक समाधान, 25 मिमी HEPES-कोह, पीएच 7.4, 35 मिमी ग्लूकोज, 4 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट, और 0.01 मिलीग्राम / एमएल cyclohexamide) में जगह है।
  4. एक मस्तिष्क ब्लॉक और बाँझ नई रेज़र ब्लेड का प्रयोग, 2-3 मिमी स्ट्रोक और ठंड विच्छेदन बफर में जगह युक्त स्लैब तैयार करते हैं।
  5. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, इंजेक्शन गोलार्द्ध में सफेद बात अंतर्निहित मोटर प्रांतस्था की पहचान। लंबे समय तक पद स्ट्रोक अंतराल पर, क्षेत्र नेत्रहीन फोकल गल जाना और माइलिन पीलापन से पहचाना जा सकता है।
    नोट: पहले पोस्ट स्ट्रोक अंतराल, एल एनआईओ के इंजेक्शन 10% की 1 μl के साथ मिश्रित पर फास्ट ग्रीन स्ट्रोक के दृश्य पहचान की अनुमति सकता है (
  6. एक विदारक माइक्रोस्कोप के मार्गदर्शन और एक ताजा छुरी का उपयोग कर के तहत, ध्यान से स्ट्रोक, या तो फास्ट ग्रीन लेबलिंग या ऊतकों को नुकसान द्वारा की पहचान युक्त सफेद पदार्थ के क्षेत्र काटना। overlying कोर्टेक्स और अंतर्निहित स्ट्रिएटम हटाये रूप में वांछित।

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Representative Results

प्रस्तुत मॉडल का उपयोग करना, सफेद बात अंतर्निहित forelimb ज्ञानेन्द्रिय कोर्टेक्स मज़बूती से निशाना बनाया जा सकता है। के रूप में आम तौर पर मानव lacunar दौरे में देखा जाता है यह रासायनिक प्रेरित स्ट्रोक मॉडल, फोकल axonal और माइलिन हानि, astrocytosis, और microgliosis (चित्रा 1) पैदा करता है। तीन इंजेक्शन का उपयोग करके, एक चिकित्सकीय उपयोगी मॉडल forelimb मोटर कार्यों 7 पर जल्दी हानि और मस्तिष्क के ऊतकों के अनुभवों की एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण भाग के साथ स्थापित किया गया है ischemia कि प्रतिरक्षाऊतकरसायन, immunofluorescent, और जैव रासायनिक तकनीक संभव है और मात्रात्मक स्तर पर विश्वसनीय हैं। जल्दी समय अंक (मानव संसाधन) स्ट्रोक शामिल होने के बाद में axonal आणविक संगठन में परिवर्तन (चित्रा 2) का पता लगाया जा सकता है। 7 दिन में, स्ट्रोक axonal हानि (चित्रा 1 ए) के एक घिरा क्षेत्र के लिए इसकी परिपक्वता पूरा करती है। हमारे हाथ में, इस विधि के एक केन्द्र सफेद पदार्थ घाव approxima का उत्पादनtely 800 माइक्रोन क्षैतिज व्यास में और महासंयोजिका के पूर्वकाल पीछे अक्ष के साथ लगभग 1 मिमी तक है। 7 दिन के द्वारा, औसत कुल रोधगलितांश आकार मोटे तौर पर 0.200 मिमी 3 और एक अंडाकार आकार का होगा। हम दोनों के बीच जानवरों और वर्गों, जहां अंडाकार में अनुभाग होता है पर निर्भर बीच स्ट्रोक आकार में लगभग 10% परिवर्तनशीलता मनाया गया है। रोधगलितांश के आकार के विकास में आगे शायद ही कभी 7 दिन से देखा जाता है।

परत 5 और 6 परत न्यूरोनल सेल शरीर है कि एक्सोन स्ट्रोक के क्षेत्र के माध्यम से पेश (चित्रा 3) में महत्वपूर्ण न्यूरोनल लेबलिंग में dextran अमाइन परिणामों के एक साथ इंजेक्शन के अलावा। Overlying cortical न्यूरॉन्स कि प्रक्रिया (ठीक सुई के पारित होने) का दिखावा पहलुओं से क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं, बाहर का axonal नुकसान से गुजरना और एल एनआईओ तैयारी के साथ एक अनुरेखक के शामिल किए जाने से पहचाना जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग था D 8 स्ट्रोक के बाद अक्षतंतु प्रारंभिक खंड में गतिशील परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए।

स्ट्रोक से प्रभावित ऊतक के क्षेत्र के छोटे आकार जैसे 2,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला अन्य आम तकनीकों के उपयोग को सीमित करता है, वहीं सफेद पदार्थ स्ट्रोक क्षेत्र ताजा ऊतक में पहचाना जा सकता है। इस तरह के फास्ट ग्रीन के रूप में एक आम डाई के अलावा एक पहचान है कि एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदित जा सकता है (चित्रा 4) ऊतक के क्षेत्र पैदा करता है। एक बार यह ऊतक विच्छेदित पश्चिमी धब्बा या immunoprecipitation, या आरएनए अलगाव और विश्लेषण (चित्रा 4C) के लिए प्रोटीन के साथ विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विभिन्न ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के उपयोग के माध्यम से, नवीन दृष्टिकोण की एक किस्म सेल भाग्य मानचित्रण अध्ययन और लेजर कब्जा microdissection (चित्रा 4C) सहित फोकल सफेद पदार्थ स्ट्रोक के बाद तंत्रिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

तम्बू "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
चित्रा 1:। फोकल सफेद पदार्थ स्ट्रोक दोनों औसत दर्जे का है और पीछे Angled दृष्टिकोण का उपयोग कर neurofilaments के लिए Immunofluorescent लेबलिंग (ए, लाल) औसत दर्जे का दृष्टिकोण का उपयोग कर axonal नुकसान सात दिनों के झटके के बाद की डिग्री को दर्शाता है। पीछे कोणीय दृष्टिकोण का प्रयोग, सफेद पदार्थ स्ट्रोक घाव अभी पार्श्व वेंट्रिकल (बी, सी) के ऊपर निशाना बनाया और तीव्र microglial (बी) और astrocytic जेट (सी) से पता चलता है। दो astrocyte मध्यवर्ती रेशा मार्कर, vimentin (लाल) और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP, हरा), दोनों स्ट्रोक (सी) के बाद सफेद पदार्थ (रेशेदार) astrocytes की आकृति विज्ञान के क्षेत्र में परिवर्तन का पता चलता है। स्केल सलाखों = 500 माइक्रोन। देखें एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा के सायन।

चित्र 2
चित्रा 2:। सफेद पदार्थ स्ट्रोक बदलता Axonal Microdomain संगठन सफेद पदार्थ स्ट्रोक प्रेरण, axonal microdomain संगठन नोड पर, बीटा-चतुर्थ spectrin (लाल) और paranode पर द्वारा चिह्नित है, contactin जुड़े प्रोटीन द्वारा चिह्नित की 3 घंटा (caspr के भीतर, हरा), बाधित है (तीर, बी)। Contralateral सफेद पदार्थ एक्सोन नियमित नोडल, paranodal, और juxtaparanodal संगठन (ए और सी) दिखाने जबकि ipsilateral सफेद पदार्थ नोडल और paranodal बढ़ाव कि खो axoglial संपर्क (बी और डी) के साथ एक्सोन की खासियत है पता चलता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रतिगामी Neuronal Labelinसफेद पदार्थ स्ट्रोक के साथ जी Axonal क्षति के साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान करता है। स्ट्रोक प्रेरण के समय में फ्लोरोसेंट dextran अमाइन (लाल) के सह इंजेक्शन स्ट्रोक से घायल एक्सोन के साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान के लिए अनुमति देता है। लेबलिंग की सबसे परत 5 भीतर axons और स्ट्रोक overlying प्राथमिक ज्ञानेन्द्रिय cortices में 6 न्यूरॉन्स में होता है। छवि स्ट्रोक के बाद 7 दिनों का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। स्ट्रोक प्रेरण के समय में फास्ट ग्रीन के बायोकेमिकल और Transcriptional Assays सह इंजेक्शन में उपयोग के लिए सफेद पदार्थ स्ट्रोक घावों की Microdissection 24 घंटा (ए, ऊपरी पैनल) में घायलों से इस क्षेत्र की जल्दी पहचान देता है। Immunoblottiविशिष्ट axonal प्रोटीन के लिए एनजी लड़का (ए, कम पैनल) स्ट्रोक के क्षेत्र में कटौती को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है। लंबे समय के बिंदुओं पर, सफेद पदार्थ स्ट्रोक (बाएं पैनल) के क्षेत्र focally विशिष्ट लेबलिंग (बी) के बिना विच्छेदित किया जा सकता है। जबकि निचले सही पैनल स्ट्रोक (बी) युक्त सफेद पदार्थ की विच्छेदित क्षेत्र से पता चलता सही ऊपरी पैनल विच्छेदित क्षेत्र को हटाने के बाद सफेद पदार्थ के क्षेत्र से पता चलता है। Oligodendrocyte-विशिष्ट सफेद पदार्थ (सी) से विच्छेदित क्षेत्रों से अलग शाही सेना का उपयोग जीनों के लिए पीसीआर। आईएल ipsilateral =; सीएल = contralateral; सी = नियंत्रण; एस = स्ट्रोक।

इंजेक्शन आगे पीछे मध्यवर्ती / पार्श्विक पृष्ठीय / उदर
0.22 0.22 -2.10
2 0.70 0.15 -2.16
3 1.21 0.15 -2.18

तालिका 1: पार्श्व Angled दृष्टिकोण (मिमी में) के लिए स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक।

इंजेक्शन आगे पीछे मध्यवर्ती / पार्श्विक पृष्ठीय / उदर
-0.75 -0.96 -2.10
2 -1.00 -0.96 -2.05
3 -1.25 -0.96 -2.00

तालिका 2: पोस्टीरियर Angled दृष्टिकोण (मिमी में) के लिए स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक।

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Discussion

Subcortical स्ट्रोक की पूर्व मॉडल की एक संख्या चूहे 12-14 और माउस 6,15 में आंतरिक कैप्सूल में endothelin -1 का केन्द्र इंजेक्शन, subcortical सफेद पदार्थ और स्ट्रिएटम सहित वर्णित किया गया है। छोटे फोकल स्ट्रोक की अधिक हाल के मॉडल कैरोटिड धमनी 16 में कोलेस्ट्रॉल microemboli इंजेक्शन और एक भी मर्मज्ञ धमनिका 17 की photothrombotic रोड़ा उपयोग किया है। इन मॉडलों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान दोनों 5 है। वर्तमान में वर्णित मॉडल एक घाव विशेषताओं है कि axonal असामान्यताएं और हानि, माइलिन गिरावट, एक केन्द्र परिगलित कोर और एक नैदानिक ​​घाटा है कि कम से कम है और काफी तेजी से वसूली 7 साल की उम्र पर निर्भर दर्शाता सहित मानव lacunar रोधगलन की नकल की एक संख्या है कि पैदा करता है। murine सफेद पदार्थ लक्ष्य निर्धारण आनुवंशिक जोड़तोड़ कि यंत्रवत अध्ययन का समर्थन कर सकते हैं की एक विस्तृत विविधता की अनुमति देता है।

महत्वपूर्णप्रोटोकॉल के कदम सटीक स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक का उपयोग भी शामिल है। क्योंकि murine सफेद पदार्थ आकार में छोटा है और तनाव से तनाव से भिन्न होता है, स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक में संशोधन के लिए प्रयोग किया जाता उम्र और माउस के तनाव के आधार पर की जरूरत हो सकती है। इंजेक्शन की मात्रा का नियंत्रण के रूप में इस सीधे रोधगलितांश के आकार को जोड़ा जाता है यह भी महत्वपूर्ण है। बड़ी इंजेक्शन बड़ा स्ट्रोक कि overlying कोर्टेक्स और अंतर्निहित स्ट्रिएटम पर अतिक्रमण का उत्पादन होगा।

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर एट-1 की फोकल इंजेक्शन सूचना दी गई है लेकिन endothelin -1 oligodendrocyte भेदभाव और परिपक्वता 10,18 के बाद स्ट्रोक सफेद पदार्थ जीव विज्ञान के अध्ययन confounding पर प्रत्यक्ष पैराक्राइन प्रभाव है दिखाया गया था। इसके विपरीत, एल एनआईओ दृष्टिकोण लक्ष्यों endothelial कोशिकाओं अकेले हैं, जबकि एक समान घाव उत्पादन और चोट की प्रतिक्रिया में शामिल कोशिकाओं पर कोई confounding पैराक्राइन प्रभाव को समाप्त। एल एनआईओ सीधे साइटोटोक्सिक और selec नहीं हैटेड खुराक प्रारंभिक खुराक वृद्धि प्रयोगों द्वारा निर्धारित किया गया था (डेटा) नहीं दिखाया। पीछे angled दृष्टिकोण और अधिक ठीक प्राथमिक मोटर प्रांतस्था से काटकर एक्सोन अधिक से अधिक व्यवहार घाटा कि सफेद पदार्थ की चोट के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है उत्पादन के लिए विकसित किया गया था। औसत दर्जे का कोणीय दृष्टिकोण भी नुकसान मोटर प्रांतस्था एक्सोन लेकिन अधिक laterally फैली हुई है और प्राथमिक संवेदी कोर्टेक्स अंतर्निहित एक्सोन शामिल है।

स्ट्रोक घाव काफी तेजी से पहले 24 घंटा से अधिक फैलता है। सात दिन तक, रोधगलितांश के आकार के लिए अधिक से अधिक है और हम उस समय से परे महत्वपूर्ण घाव विकास नहीं मनाया है। अतिरिक्त सेलुलर घटनाओं और axonal अध: पतन इस प्रारंभिक चरण से आगे घटित होगा लेकिन रोधगलितांश आकार के रूप में परिगलित कोर द्वारा मापा किसी प्रकार के हस्तक्षेप के अभाव में काफी परिवर्तन नहीं होगा।

स्ट्रोक के समय neuroanatomical ट्रेसर के सह इंजेक्शन इस्कीमिक axonal चोट का सामना न्यूरॉन्स को पहचानती है। का प्रयोग या तो मेडial या पीछे कोणीय दृष्टिकोण, क्षतिग्रस्त axonal अनुमानों के साथ neuronal सेल निकायों अहानिकर रहेगा। यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र न्यूरॉन्स पर इस्कीमिक axotomy के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाता है। हम dextran amine और Fluorogold सहित मुख्य रूप से पतित ट्रेसर, जो दोनों स्ट्रोक क्षतिग्रस्त एक्सोन द्वारा उत्कृष्ट तेज दिखाने का उपयोग किया है। ट्रांसजेनिक और नाक आउट माउस लाइनों की व्यापक विविधता का काम करके, इस प्रोटोकॉल के उन न्यूरोनल सफेद पदार्थ स्ट्रोक चोट प्रतिक्रिया और मरम्मत में शामिल जीनों की विशिष्ट भूमिका की जांच कर सकते हैं।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgements

एसएन और MDD एनआईएच K08 NS083740 और तंत्रिका विज्ञान के यूसीएलए विभाग की ओर से समर्थन मिला। AJG डॉ मरियम और शेल्डन जी Adelson मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन और लैरी एल Hillblom फाउंडेशन द्वारा समर्थन मानता है। KLN कृतज्ञता अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 14BFSC17760005 एएसए-Bugher स्ट्रोक केंद्र से समर्थन मानता है। बीमार, ईजीएस और एसटीसी एनआईएच R01 NS071481 द्वारा समर्थित थे। JDH एनआईएच K08 NS083740 से समर्थन मानता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

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References

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