FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

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Developmental Biology

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Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

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Abstract

섬유 아세포는 세포 외 기질을 분비에 대한 책임 원칙 세포의 유형과 여러 장기와 조직의 중요한 구성 요소입니다. 섬유 아세포의 생리와 병리 여러 기관에서 fibroses, 비후성 흉터 다음 화상, 허혈 다음 심장 기능 상실, 암 기질의 형성을 포함하여 임상 기관의 스펙트럼을 기초. 그러나, 섬유 아 세포는 크게 인해 고유의 이질성에, 셀의 잘못 특성화 유형 남아있다. 섬유 아 세포의 분리를위한 기존의 방법은 근본적으로 세포의 표현형과 행동에 영향을 미치는 세포 배양의 시간이 필요합니다. 따라서, 섬유 아세포 생물학을 연구 많은 연구는 체외 조작에 의존하고 정확하게 생체 내에서 섬유 아세포의 동작을 캡처하지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 preservi함으로써, 세포 배양을 필요로하지 않는 성인 마우스의 등쪽 피부 섬유 아세포의 분리에 대한 FACS 기반 프로토콜을 개발생리적 전사 및 각 셀의 프로테옴 프로파일을 겨. 우리의 전략은 혈통 음의 게이트를 통해이 아닌 중간 엽 계통의 배제를 허용 (린 -)가 아니라 특정 표면 마커를 발현하는 섬유 아 세포의 하위 집단의 사전 선택 또는 농축을 방지하고이 이질적인에서 가능한 한 포함 될 수있는 긍정적 인 선택 전략을보다 세포 유형.

Introduction

섬유 아세포는 자주 플라스틱 기판에 부착 스핀들 모양의 세포로 형태 학적으로 정의된다. 합성 섬유 아세포 및 배아 및 성체 기관 (1)의 세포 외 매트릭스를 리모델링을 담당 원리 세포 유형이다. 섬유 아세포는 포유류의 개발에 중요하며, 따라서 각 조직 및 기관에 존재하는 세포 유형 이웃의 동작에 영향을 미치는 세포 외 환경에 실질적으로 기여한다.

섬유 아세포는 엄청난 임상 부담의 원인이 의료 조건의 다양한 세트 뒤에 주요 세포 유형입니다. 병리학 섬유 아세포 활성은 정상 조직의 기능 손상 및 피부 상처 치유, 죽상 동맥 경화증, 전신성 경화증, 혈관 손상 2-5 후 아테롬성 플라크의 형성 다음 조직 (예 : 폐, 간 등) 장기 섬유증, 반흔을 포함한다. 특히 상처 치유, 모두 급성과 만성, D를 포함정상 조직 등에도 유사한 기능이나 그것을 둘러싼, 다양한 병리학 적 상태에 걸쳐 상당한 이환율을 초래 흉터 조직의 eposition. 손상 후,이어서, 구조적 ECM 성분을 분비하는 세포 유형에 인접한 주변 분비 효과를 발휘하고, 흉터 조직 (6)을 증착하여 기계적 안정성을 복원 근섬유 아세포로의 전환이있다.

피부 조직에서 발달 시간에 걸쳐 감겨 수리의 품질 및 해부학 적 부위 사이에 상당한 변화가 존재한다. 인생의 첫 두 학기에 태아는 흉터없이 치유; 그러나,에 성인기에 걸쳐 세 번째 임신에서, 상처와 치유 인간. 사이트 별, 연령별 이외에, 상처 치유의 차이가 존재한다. 피부의 상처 흉터 조직 내의 증착 9 상당한 동안 구강에 상처, 최소 반흔 7,8으로 개조. 논쟁은 C를 지속연령 및 위치 10, 11 모두에 관해서 상처 치유의 결과를 로컬 섬유 아세포의 고유 특성에 비해 환경의 영향을 상대적 oncerning. 피부의 진피 및 이전 배아 (E15) 대 구강 마우스의 치료에 유의 한 차이를 감안할 대 이후 배아 (E18) 진피, 그것은 특정 발달 연령에 다양한 해부학 적 부위 중 섬유 아세포의 인구에 본질적인 차이가 존재하는 것 같다 .

1986 년 해롤드 F. 드보락은 종양이 12을 치유하지 않는 상처입니다 상정. 드보락은 종양이 신체의 상처처럼 동작하고 호스트의 응답 상처 치유를 활성화시킴으로써 그들의 기질을 유도한다는 결론을 내렸다. 많은 연구 이후 암 13-15의 진행에 섬유 아 세포의 기여를 조사하지만, 한 상처 치유, 정체성과 피부 캘리포니아의 기질 구획에 기여하는 섬유 아 세포의 배아 기원의 경우와 같이rcinomas 적절하게 정의되지 않았습니다. 이 질문에 대한 대답은 항암 치료 (16)에 대한 잠재적으로 효과적인 대상으로 종양 관련 섬유 아세포를 노출 최근의 연구 주어진 의료 관련을 맺는다.

식별 및 전향 생체 폐의 섬유 전위 부여 섬유 아세포 계통을 분리하는 것은 효과적으로 급성 및 만성 질환 상태의 넓은 범위에 걸쳐 손상에 대한 반응을 조작 향해 필수적인 단계이다. 1987 년 Cormack는 유두와 망상 진피 (17, 18) 내에서 하나의 내부에있는 섬유 아세포의 두 개체군, 하나를 보여 주었다. 세 번째 모집단은 여포 (19, 20)의 모유두 지역에서 모낭과 관련된 발견되었다. 때 배양, 성장 잠재력, 형태, 및 성장 인자 / 사이토 카인 이러한 섬유 아세포 아형 전시 차이는 21 ~ 24 프로필.

현재까지, 섬유 아세포를 조사 연구 그는terogeneity 크게 적절하게 생체 내에서 섬유 아세포 중 발달 및 기능 다양성의 특성을 실패했습니다. 이것은, 부분적으로, 배양 된 섬유 아세포의 집단에 의존하고, 모든 섬유 아세포 (25)에 의해 표현되는 자기 표면 수용체의 기초 하에서 세포 배양 또는 양성 선별의 균질화 효과의 결과이다. 우리의 실험실에서 최근의 연구는 깊은 표면 마커이 원고 (26)에 제시된 FACS 기반의 분리 방법에 의해 분리 대 교양 교양 섬유 아 세포에서 전사 변화를 보여 주었다.

그 후, 우리는 쥐의 등쪽 진피 내의 특정 섬유 아세포의 계보를 파악하고 Engrailed-1의 배아 식으로 정의이 계보는,, 등의 피부의 결합 조직 증착을위한 일차적 책임이 있다고 결정했다. 상처 치유, 암 기질 형성 등을 포함 섬유증의 급성 및 만성 형태 모두 동안의 계보 기능방사선 섬유증 (27)을 유도. 별개의 섬유 아세포 계통의 특성은 폐의 섬유 성 행동을 조절하기위한 치료를위한 중요한 의미를 가지고있다.

오히려 세포 격리 28, 29을 달성하기 위해 체외 조작에 의존하는 기존의 프로토콜을 사용하는 것보다, 여기에 설명 된 수확 프로토콜 (그림 1)보다 정확하게 생체 내에서 표현형과 동작을 캡처 섬유 아 세포의 수율 정보 분석을하는 데 도움이됩니다.

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Protocol

이 프로토콜은 실험 동물 관리에 스탠포드 대학 행정 패널에 의해 승인 된 방법을 따른다.

쥐 진피 1. 소화

  1. 케타민 100 ㎎ / ㎏ + 자일 라진 (20) ㎎ / ㎏ + 아세 프로 마진 3 ㎎ / ㎏의 복강 내 주사하여 마취 후 경추 탈구로 쥐를 안락사.
    참고 : 다양한 연령과 배경을 사용할 수 있습니다.
  2. 면도와 지느러미 피부를 털을 뽑다. 약 100,000 세포 등쪽 피부 조각 X 100mm 60mm로부터 분리 될 수있다.
  3. 깨끗한 건조 멸균 표면에 70 % 에탄올 대신에 마우스를 담근다.
  4. 즉시 멸균 해부 가위를 사용하는 등의 마우스 피부를 수확. 암컷 마우스에서 유방 조직을 포함한 피.
  5. 꼬리의 기초부터 텐트까지 피부에 집게를 사용하여 문헌-근막면을 따라 절개하기 전에 가로 절단을합니다.
  6. 조심스럽게 수확하는 동안 어떤 피하 지방을 포함하지 않도록피부. 어떤 피하 지방의 수확 피부를 검사하고 조심스럽게 메스의 무딘 가장자리를 사용하여 긁어.
  7. 얼음에 PBS 세척을 5 배 뒤에 betadine에서 수확 피부를 씻어.
    주 : 오염을 방지하기 위해 가능한 무균에 가까운 피부를 유지하는 것이 중요하다.
  8. 면도날을 사용하여 샘​​플이 2-3mm 조각 균일 일관성 때까지 멸균 접시에 가위를 해부 피부를 말하다.
  9. DMEM에 1 ㎎ / ㎖의 농도로 50 ml의 20 ㎖의 콜라게나 제 IV를 함유하는 원뿔형 튜브를 준비한다. 튜브 당 다섯 생쥐 기초 튜브로 진피를 나눈다.
  10. 수조 나 오븐 중 1 시간 동안 37 ℃에서 배양하는 동안 샘플을 격렬하게 교반한다.
  11. 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 멸균 후드에 바늘 3 ~ 5 배없이 10 ML의 주사기를 통해 전달합니다.
  12. 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 샘플을 놓고 추가로 30 분 동안 격렬하게 흔들어.
  13. 멸균 후드, 10 ml의 피펫을 사용하여 위 3 ~ 5 배 아래 샘플을 피펫. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 샘플을 피펫.
  14. 세포의 수율을 최대화하고 40 ml의 총 부피를 가지고 동일한 필터를 10 % FBS DMEM 20㎖를 전달한다. 4 ℃에서 8 분 300g에서 원심 분리기.
  15. 먼저 뜨는 나머지 이전에 상부 지방층을 제거하기 위해 큰 관심을 가지고, 멸균 유리 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다.
    참고 :이 단계는 지방 세포의 오염을 감소하는 것이 중요합니다.
  16. 20 ml의 10 % FBS DMEM으로 펠렛을 재현 탁.
  17. 70 μm의 필터를 통해 세포 / DMEM 서스펜션을 전달합니다.
  18. 4 ℃에서 8 분 동안 300g에 10 ml의 10 % FBS DMEM과 필터 원심 분리기 필터링 된 현탁액을 씻어.
  19. 다시 처음으로 남아있는 지방 층을 제거하기 위해주의하면서 멸균 유리 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다.
  20. RBC 상당한 오염이있는 경우 (펠릿 가시적 적색), 펠릿을 다시 일시20 mL의 ACK 용해 완충액 RT에서 5 분 동안 배양한다. 그렇지 않으면 24 단계로 건너 뜁니다.
  21. FACS 완충액 (PBS, 10 % FBS, 0.1 % 아 지드 화 나트륨)의 동일 부피 (20 ㎖)을 첨가 한 후 혼합하고 흠없는 대조군으로 제쳐 5 ml의 분취 량을 유지한다. 4 ℃에서 8 분 동안 300g에 남아있는 샘플을 원심 분리기.
  22. 상층 액을 제거하고 얼음에 펠렛을 넣어. FACS 시간을 사용할 수없는 경우 세포는이 시점에서 내려 고정 될 수있다.

FACS에 의한 섬유 아세포 2. 분리

  1. 각각의 펠릿에 대한 계보 항체 배양 믹스 500 μl를 확인합니다. , CD45 (1 : 200), Tie2의 (1시 50분), 테르을 : 먼저 튜브에 DNase의 (10 μg의 / ㎖)를 포함 외과 버퍼의 475 μl를 추가 한 다음 형광 접합 CD31 (100 1)를 추가하여이 작업을 수행 -119 (1 : 200), 및는 EpCAM (1 : 100)은 각각의 항체에 대한 항체를 각 희석액을 달성한다.
  2. 리니지 항체 배양 믹스 500 μL의 각 펠렛을 다시 중단하고 20 분 동안 얼음이 현탁액을 품어.
  3. 5 추가샘플의 DNase (10 μg의 / ㎖)를 포함하고 부드럽게 혼합 ml의 외과 버퍼. 4 ℃에서 8 분 300g에서 원심 분리기.
  4. 상등액을 제거하고, 단계 (26)에서와 같이 5 ㎖의 FACS DNase를 함유 완충액 (10 μg의 / ml) 및 동일한 조건을 이용하여 원심 분리 세포 펠렛을 세척 하였다.
  5. DNase의 (10 μg의 / ㎖)를 포함 500 μL FACS 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 생존 염료 컨트롤로 옆으로 50 μL 나누어지는했습니다.
  6. 선택한 염료에 대한 표시 농도의 나머지 샘플 선택의 생존 염료를 추가합니다.
  7. FACS 분석 (31)을 수행하고 생존 염료 - / CD31- / CD45- / Tie2- / 테르 - 119- / EpCAM- 세포 (그림 2A 참조) 정렬. 정렬 직접 FACS 버퍼에.

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Representative Results

이 방법 (도 1)의 유효 기간은 27 일 최근의 간행물에 상세하게 검사 할 수있는 방법의 다수 확인되었다. 이러한 분류 세포 대량 세포와 갓 분류 세포의 단일 세포 전사 분석의 면역 세포를 포함한다. 섬유 아세포를 정렬 직접보다는 더 정확하게 문화에 의존하는 것은 자신의 생체 표현형을 캡처합니다. 오히려 긍정적 인 선택 방식보다 혈통 부정적인 고갈 방식 (그림 2A)를 사용하면 특정 하위 집단에 대한 사전 선택을 방지 할 수 있습니다. 이 접근법의 값은 최근 전술하지 진피의 수준에서 CD26 양성 섬유 아세포의 존재를 식별 Rinkevich 외. (27)에 의해 입증되었다.

섬유 아세포의 배양 과정은 유전자 발현에서 유의 한 변화를 유도하는지 확인하기 위해, 우리는 섬유 아세포에 교양 배양 섬유 아세포를 비교하는 마이크로 어레이를 이용했다. 우리는 섬유 아세포를 배양즉 두 가지 기술이 원고 및 공지 조직 이식편 프로토콜 28에 자세히 라이브 수확 프로토콜에 의해 분리 하였다. 전체 사체 마이크로 어레이 분석 라이브 수확 (C.LH)에 의해 조직 이식편에 의해 단리 배양 섬유 아세포 (C.TE) 방법론 피어슨 곱 모멘트 상관 계수 사체 전사적 (R에서 높은 유사도가 밝혀 ) 0.92 (그림 2B). 대조적으로, 배양 된 섬유 아세포 라이브 수확 교양 섬유 아세포 (U.LH)에서 유의 한 차이. U.LH 대 C.TE의 비교는 0.64 (그림 2B)의 R을 산출하면서 U.LH 대 C.LH 사이의 비교, 0.61의 R을 얻었다. 이러한 결과는 섬유 아세포 배양보다는 실시간 분석 수확 된 섬유 아세포의 중요성을 확립한다. 이 프로토콜을 사용하여 분리 배양과 교양 섬유 아 세포 사이의 전사 및 단백체 차이보다 완벽한 분석을 위해, Walmsley <참조EM> 등. (26)

그림 1
섬유 아세포 절연의 그림 1. 개요.이 FACS 기반 격리 프로토콜과 관련된 기본 단계의 도식 표현. Walmsley의 허가를 재사용, GG 등. 섬유 아세포 수확이 체외. 조직 공학의 표면 마커 이동을 계시 살고 있습니다. 파트 C, 방법, 도이 :. 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 유동 세포 계측법 및 마이크로 어레이 분석. 요오드화 프로피 듐 역을 기준으로 가능한 세포에 대한 단일 세포의 선택 (왼쪽 그래프), 선택을 보여주는 (A) FACS 게이팅 전략ining (중간 플롯), 및 CD31, CD45, Tie2의, Ter119하고는 EpCAM에 대한 계보 부정에 기초 섬유 아세포 (오른쪽 그래프)의 선택. (B) 배양 라이브 수확 대 교양 라이브 수확 (U.LH)의 마이크로 어레이 분석 배양 된 조직 절편 (C.TE) 섬유 아 세포 대 (C.LH). U.LH (N = 3), C.LH 간의 유전자 발현의 유사도 (N = 3), 및 C.TE (N = 3) Pearson 적률 상관 계수 (R)에 의해 측정 된 섬유 아세포의 집단. [C.LH C.TE 대 : R = 0.92] [C.LH U.LH 대 : R = 0.61] [U.LH 대 C.TE : R = 0.64]. Walmsley의 허가를 재사용, GG 등. 섬유 아세포 수확이 체외. 조직 공학의 표면 마커 이동을 계시 살고 있습니다. 파트 C, 방법, 도이 :. 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 논문에 설명 된 프로토콜이 하위 집단을 위해 선택 또는 후속 분석하기 전에 세포 배양에서의 시간이 필요하거나 기존의 방법에 비해, FACS 기반 정렬하여 섬유 아세포를 분리하는 수단을 제공한다. 섬유 아세포의 선별을 피부로부터 채취 필요한 시간은 약 6 시간이고; 그러나, 수확에 사용 된 마우스의 수는이 추정에 영향을 미칠 것이다.

프로토콜의 몇 가지 포인트는 특별한주의가 필요합니다. 첫째는 분리 과정과 원심 분리 소화 다음 소화 상청 상부 지방층을 제거하기 전에 피부에서 지방의 제거에 의해 지방 세포의 오염을 제한한다. 일부 지질 구성 요소가 튜브의 플라스틱 벽에 부착 이후 펠렛 세척을 오염시킬 수 있으므로 세포 펠렛 후 또한 신선한 튜브로 변경하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 두 번째 점은 표피에서 별도의 진피에 세심한주의를 포함표피 - 진피의 접합을 따라. 표피 세포를 오염하는 것은 FACS 고갈 전략에 의해 제거되지만, 여기에 오염을 제한하는 노력이 계속되어야한다.

이 방법의 한계는 현재 리니지 패널에 의해 캡처되지 세포를 오염의 존재 가능성을 포함한다. 리니지 항체 (CD31, CD45, Tie2의, Ter119,는 EpCAM)에 결합 된 형광을 선택할 때, 연구자들은 다른 표면 마커들이 수행하실 수 있습니다 분석 고려할주의해야합니다. 추가 얼룩 선택한 혈통 항체 형광 구별 채널에 있어야합니다. 일반적인 경우, 추가 분석을 위해 사용 가능한 넓은 범위의 파장을 보존 공액 이상적인 것으로 PacBlue 알았다. 리니지 항체 형광에 생존 염료 매칭하는 파장의 추가 범위를 유지합니다. 예를 들어, 생존력 DAPI 염색은 흥분과 PacBlue 유사한 파장에서 형광을. 이러한 방식으로, 모든 DAPI 포sitive 리니지 항체 양성 세포가 효과적으로 표적 집단으로 만 가능한 섬유 아세포를 떠나, 하나의 게이트를 사용하여 제거 할 수있다. 또한, 세포가 알려지지 정도, 시간 제한된 양 및 가능성이 영향 유전자 발현에 대한 분리 과정 동안 FBS에 노출되는 것을 주목해야한다.

포괄적으로 모든 섬유 아세포 인구에 대한 정렬 할 수있는 능력은 정말이 제대로 이해 세포 유형의 이질성을 심문 할 수있는 기회를 나타냅니다. 이는 정상적인 생리의 맥락에서 응용 프로그램뿐만 아니라 과도한 섬유화 및 비정상적인 섬유 아세포의 행동을 포함하는 질병을 선사합니다.

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Acknowledgments

이 작품은 (HPL에) NIH 보조금 R01 GM087609, (MTL에) (HPL에) 앤서니 슈, NIH 보조금 U01의 HL099776의 명예에 잉그리드 라이 빌 슈의 선물, Hagey 실험실에서 보조금에 의해 부분적으로 지원 소아 재생 의학 및 오크 재단 (MTL에, GCG와 HPL). GGW 의학의 스탠포드 대학, 스탠포드 의료 과학자 훈련 프로그램에 의해 지원 및 NIGMS 훈련 보조금 GM07365했다. ZNM는 성형 외과 재단 연구 활동 그랜트와 Hagey 가족 기금에 의해 지원되었다. MSH는 캘리포니아 재생 의학 연구소 (CIRM) 임상 연구원 교육 교부금 TG2-01159, 악안면 외과 의사의 미국 사회 (ASMS) / 악안면 외과 재단 (MSF) 연구 그랜트 수상하고, 이식 및 조직 공학 원정대 수상에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

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References

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