Murine Dermal Fibroblast Isolation ved FACS

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fibroblaster er princippet celletype ansvarlig for secernerende ekstracellulær matrix og er en kritisk komponent i mange organer og væv. Fibroblast fysiologi og patologi til grund et spektrum af kliniske enheder, herunder fibroser i flere organer, hypertrofisk ardannelse efter brandsår, tab af hjertefunktion efter iskæmi, og dannelsen af ​​kræft stroma. Men fibroblaster stadig en dårligt karakteriseret type celle, hovedsagelig på grund af deres iboende heterogenitet. Eksisterende metoder til isolering af fibroblaster kræver tid i cellekultur, som har dybtgående indflydelse cellefænotype og adfærd. Derfor mange undersøgelser der undersøger fibroblast biologi stole på in vitro-manipulation og ikke præcist indfange fibroblast adfærd in vivo. For at overvinde dette problem har vi udviklet et FACS-baseret protokol til isolering af fibroblaster fra den dorsale hud voksne mus, der ikke kræver cellekultur, hvorved preserving den fysiologiske transkriptions- og proteomprofilen af ​​hver celle. Vores strategi giver mulighed for udelukkelse af ikke-mesenkymale slægter via en slægt negativ gate (Lin -) i stedet for en positiv markering strategi for at undgå forudgående udvælgelse eller berigelse af en delpopulation af fibroblaster udtrykker specifikke overflademarkører og være så omfattende som muligt på tværs af denne heterogene celletype.

Introduction

Fibroblaster ofte defineres morfologisk som spindel-formede celler, der overholder plastsubstrater. Fibroblaster er princippet celletype ansvarlig for syntese og remodeling den ekstracellulære matrix i embryoniske og voksne organer 1. Fibroblaster er således afgørende for udviklingen af ​​pattedyr og bidrager væsentligt til det ekstracellulære miljø, der påvirker adfærd nabolandet celletyper til stede i hvert væv og orgel.

Fibroblaster er også den primære celletype bag et bredt sæt af medicinske tilstande, der forårsager enorme klinisk byrde. Patologisk fibroblast aktivitet forringer normalt væv funktion og omfatter væv og organfibrose (såsom lunge og lever), ardannelse efter kutan sårheling, atherosklerose, systemisk sklerose, og dannelse af atheromatøse plaques efter blodkarbeskadigelse 2-5. Sårheling i særdeleshed, både akut og kronisk, involverer deposition af arvæv at hverken Ligner eller funktioner som det normale væv omkring det, og fører til betydelig sygelighed på tværs af forskellige patologiske tilstande. Efter skade, der er en overgang af fibroblaster til myofibroblaster, som derefter udskiller strukturelle ECM komponenter, udøver paracrine virkninger på nærliggende celletyper, og genoprette mekanisk stabilitet ved at deponere arvæv 6.

I kutane væv findes der betydelig variation i kvaliteten af ​​sårreparation tværs udviklingsmæssige tid og mellem anatomiske steder. I de første to trimestre af livet fosteret heler uden ardannelse; Men fra den tredje trimester, og gennem hele voksenlivet, mennesker helbrede med et ar. Stedspecifik, udover aldersspecifikke er der forskelle i sårheling. Sår i mundhulen remodel med minimal ardannelse 7,8, mens arvæv deponering inden kutane sår er væsentlig 9. Kontrovers fortsætter concerning den relative påvirkning af miljøet versus iboende egenskaber lokale fibroblaster om resultaterne af sårheling med hensyn til både alder og placering 10,11. I betragtning af de betydelige forskelle i helbredelsen af ​​mus oral vs kutane dermis og tidligere embryonale (E15) vs. senere embryonale (E18) dermis, er det sandsynligt, at iboende forskelle i populationer af fibroblaster på bestemte udviklingsmæssige aldre, og mellem forskellige anatomiske steder eksisterer .

I 1986 Harold F. Dvorak posited tumorer er sår, der ikke heler 12. Dvorak konkluderede, at tumorer opfører sig som sår i kroppen og fremkalde deres stroma ved at aktivere sårheling respons af værten. Talrige undersøgelser har siden undersøgt bidrag fibroblaster til progression af carcinomer 13-15, men som i tilfælde af sårheling, identitet og embryonale oprindelse af fibroblaster, der bidrager til det stromale rum af kutan carcinomas er ikke defineret tilstrækkeligt. Svaret på dette spørgsmål bærer medicinsk relevans givet de seneste undersøgelser udsætter tumor-associerede fibroblast som et potentielt effektivt mål for anti-cancer-terapi 16.

Identificering og fremadrettet isolere fibroblast slægter udstyret med fibrogene potentiale in vivo er et vigtigt skridt i retning af en effektiv manipulere deres reaktion på skade på tværs af en bred vifte af akutte og kroniske sygdomstilstande. I 1987 Cormack demonstrerede to subpopulationer af fibroblaster, en bosiddende i papillære og én inden for de retikulære dermis 17,18. En tredje subpopulation blev fundet associeret med hårsække i hudpapillen region folliklen 19,20. Når dyrkes, disse fibroblast undertyper udviser forskelle i vækstmuligheder, morfologi, og vækstfaktor / cytokiner profiler 21-24.

Til dato studier undersøger fibroblast hanterogeneity har i vid udstrækning undladt i tilstrækkelig grad karakterisere udviklingsmæssige og funktionel mangfoldighed blandt fibroblaster in vivo. Dette er delvis et resultat af en afhængighed af dyrkede fibroblast populationer og homogenisering virkning af cellekultur eller positiv selektion på grundlag af en selvstændig overfladereceptor ikke udtrykkes af alle fibroblaster 25. En nylig undersøgelse fra vores laboratorium viste en dybtgående overflade markør og transkriptionel skift i dyrkede fibroblaster vs. dyrkede isoleret ved FACS-baserede isolation metode præsenteres i dette håndskrift 26.

Efterfølgende har vi identificeret en specifik fibroblast afstamning inden for de murine dorsale dermis og fastslået, at dette afstamning, defineret ved embryonale udtryk for Engrailed-1, er hovedansvarlig for bindevæv aflejring i dorsale hud. Afstamning funktioner under både akutte og kroniske former for fibrose, herunder sårheling, cancer stromadannelse ogstrålingsinduceret fibrose 27. Karakterisering af forskellige fibroblast slægter har kritiske konsekvenser for behandlinger der tager sigte på at modulere fibrogene adfærd.

Snarere end at bruge eksisterende protokoller, der er baseret på in vitro-manipulation for at opnå celleisolering 28,29, vil høsten protokollen (figur 1) beskrevet her hjælpe yield informative analyser af fibroblaster, som mere præcist afspejler fænotype og adfærd in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol følger metoder er godkendt af Stanford University Administrativ Panel om Laboratory Animal Care.

1. Fordøjelse af murine Dermis

  1. Aflive mus ved cervikal dislokation efter anæstesi med en intraperitoneal injektion af ketamin 100 mg / kg + xylazin 20 mg / kg + acepromazin 3 mg / kg.
    Bemærk: Forskellige aldre og baggrunde kan anvendes.
  2. Barbering og fjerne hår ryghuden. Ca. 100.000 celler kan isoleres fra et stykke dorsal hud 60 mm x 100 mm.
  3. Nedsænk musen i 70% ethanol og sted på en ren, steril overflade for at tørre.
  4. Umiddelbart høste dorsale musehud anvendelse af sterile dissekere saks. I hunmus, undgå herunder brystvæv.
  5. Start af haleroden, brug pincet til telt op i huden og gøre en tværgående snit før dissekere langs overnationale fascial fly.
  6. Undgå omhyggeligt herunder enhver subkutant fedt, mens høsthuden. Undersøg høstede hud for enhver spæk og forsigtigt skrabe det af med den stumpe kant af en skalpel.
  7. Skyl det høstede hud i betadin efterfulgt af 5x PBS vaske på is.
    Bemærk: Det er vigtigt at holde huden så tæt på sterilt som muligt for at undgå forurening.
  8. Hak huden ved hjælp af barberblade og dissekere saks i en steril skål indtil prøven er af ensartet konsistens med 2-3 mm stykker.
  9. Forbered 50 ml koniske rør indeholdende 20 ml collagenase IV med en koncentration på 1 mg / ml i DMEM. Opdel dermis ind i rørene på grundlag af fem mus pr rør.
  10. Agitere prøver kraftigt, mens inkubering ved 37 ° C i 1 time i enten et vandbad eller ovn.
  11. Udtage prøver fra inkubatoren og passere gennem en 10 ml sprøjte uden nål 3-5x i en steril hætte.
  12. Placer prøverne tilbage i inkubatoren ved 37 ° C og rystes kraftigt i yderligere 30 minutter.
  13. I en steril hætte, Pipette prøverne op og ned 3-5x ved hjælp af en 10 ml pipette. Pipetteres prøven gennem en 100 um filter over i en ny 50 ml konisk rør.
  14. Pass 20 ml 10% FBS DMEM gennem det samme filter til at maksimere celleudbytte og bringe det totale volumen til 40 ml. Der centrifugeres ved 300 g i 8 minutter ved 4 ° C.
  15. Fjern supernatanten under anvendelse af en steril pipette glas, idet stor omhu for først at fjerne det øverste fedtlag før resterende supernatant.
    Bemærk: Dette trin er kritisk at reducere adipocyt forurening.
  16. Resuspender pillerne i 20 ml 10% FBS DMEM.
  17. Passere celle / DMEM suspensionen gennem en 70 um filter.
  18. Filteret skylles med 10 ml 10% FBS DMEM og centrifugeres den filtrerede suspensionen ved 300 g i 8 minutter ved 4 ° C.
  19. Fjern supernatanten ved hjælp af en steril glaspipette, igen at tage sig til først at fjerne eventuelt resterende fedtlag.
  20. Hvis der er en betydelig RBC forurening (pillen er synligt rød), re-suspendere pelletsi 20 ml ACK-lysepuffer og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Ellers gå til trin 24.
  21. Tilføj et lige volumen (20 ml) af FACS buffer (PBS, 10% FBS, 0,1% natriumazid), derefter blandes, og holde afsat en 5 ml alikvot som en ufarvet kontrol. Centrifugeres den resterende prøve ved 300 g i 8 minutter ved 4 ° C.
  22. Fjern supernatanten og sætte pellet på is. Cellerne kan fryses ned på dette tidspunkt, hvis FACS tiden ikke er til rådighed.

2. Isolering af fibroblaster ved FACS

  1. Lav 500 pi afstamning antistof inkubation mix for hver pellet. Gøre dette ved først at tilsætte 475 pi FACS buffer indeholdende DNase (10 ug / ml) til et rør, og derefter tilsætte fluorofor-konjugeret CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), og EpCAM (1: 100) antistoffer for at opnå den respektive fortynding for hvert antistof.
  2. Re-suspendere hver pellet i 500 pi afstamning antistof inkubation mix og inkuber denne suspension på is i 20 min.
  3. Tilføj 5ml FACS buffer indeholdende DNase (10 ug / ml) til prøven og bland forsigtigt. Der centrifugeres ved 300 g i 8 minutter ved 4 ° C.
  4. Fjern supernatanten og vask cellepelleten med 5 ml FACS buffer indeholdende DNase (10 ug / ml), og der centrifugeres ved anvendelse af de samme betingelser som i trin 26.
  5. Pellet resuspenderes i 500 pi FACS buffer indeholdende DNase (10 ug / ml) og lægge en 50 pi alikvot som viabilitetsfarvestoffet kontrol.
  6. Tilføj viabilitetsfarvestoffet valg til den resterende prøve i den angivne for den valgte farvestofkoncentration.
  7. Udfør FACS-analyse 31 og sortering for levedygtighed farvestofbaseret / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119. / EpCAM- celler (se figur 2A). Sorter direkte i FACS buffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gyldigheden af denne fremgangsmåde (figur 1) er blevet verificeret i en række måder, som kan undersøges i detaljer i vores seneste publikation 27. Heriblandt immunocytokemi af sorterede celler og masse celle og enkelt celle transkriptionel analyse af frisk sorterede celler. Sortering fibroblaster direkte snarere end at lægge kulturen mere præcist indfanger deres in vivo fænotype. Ved hjælp af en slægt negativ udtømning tilgang (figur 2A) snarere end en positiv udvælgelse, undgås forududvælgelse for bestemte subpopulationer. Værdien af denne tilgang blev for nylig påvist af Rinkevich et al. 27, identificerer tilstedeværelsen af CD26-positive fibroblaster på et niveau af de tidligere beskrevne ikke dermis.

For at bekræfte, at processen med dyrkning af fibroblaster fører til væsentlige ændringer i genekspression, brugte vi mikroarrays til at sammenligne dyrkede fibroblaster til ukultiverede fibroblaster. Vi dyrkede fibroblasterder blev isoleret ved to teknikker, levende høst protokollen beskrevet i dette manuskript og en velkendt vævseksplantat protokol 28. Hele-transkriptom microarray analyse viste, at dyrkede fibroblaster isoleret ved levende høsten (C.LH) og vævseksplantat (C.TE) metoder har en høj grad af lighed på et transkriptom-plan med en Pearson produkt øjeblik korrelationskoefficient (r ) 0,92 (Figur 2B). Til sammenligning dyrkede fibroblaster afveg væsentligt fra levende høstet ukultiverede fibroblaster (U.LH). En sammenligning mellem C.LH versus U.LH gav en R på 0,61, mens en sammenligning af C.TE versus U.LH gav en R på 0,64 (Figur 2B). Disse resultater fastslår vigtigheden af ​​at analysere levende høstet fibroblaster stedet dyrkede fibroblaster. For en mere fuldstændig analyse af transkriptionelle og proteom forskelle mellem dyrkede og ukultiverede fibroblaster isoleret ved hjælp af denne protokol henvises til Walmsley <em> et al. 26

Figur 1
Figur 1. Oversigt over fibroblast Isolation. Skematisk fremstilling af de primære trin i denne FACS-baserede isolation protokol. Genbruges med tilladelse fra Walmsley, GG Lev et al. Fibroblast Harvest afslører overflademarkør Shift in vitro. Tissue engineering. Del C, Methods, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. flowcytometri og microarray analyse. (A) FACS gating strategi viser udvælgelse af enkelte celler (venstre plot), selektion for levedygtige celler baseret på propidiumjodid stalingen (midterste plot), og udvælgelse af fibroblaster (højre plot) på basis af afstamning negativitet til CD31, CD45, Tie2, TER119 og EpCAM. (B) Microarray Analyse af ukultiverede Levende Høstet (U.LH) versus kulturperler Levende Høstet (C.LH) versus Cultured vævseksplantat (C.TE) fibroblaster. Ligheden af ​​genekspression mellem U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), og C.TE (n = 3) fibroblast populationer målt ved Pearsons korrelationskoefficient (r). [C.LH vs C.TE: r = 0,92]; [C.LH vs U.LH: r = 0,61]; [C.TE vs U.LH: r = 0,64]. Genbruges med tilladelse fra Walmsley, GG Lev et al. Fibroblast Harvest afslører overflademarkør Shift in vitro. Tissue engineering. Del C, Methods, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beskrevet i dette manuskript protokol giver et middel til at isolere fibroblaster ved FACS-sortering baseret, i forhold til de eksisterende metoder, som enten vælger for en subpopulation eller kræver tid i cellekultur, før de efterfølgende analyser. Den tid, der kræves fra høst af huden til sortering af fibroblaster er ca. 6 timer; dog vil antallet af mus anvendt i høsten påvirke dette skøn.

Flere punkter i protokollen kræver særlig pleje. Den første er begrænsende adipocyt forurening med fjernelse af fedt fra huden før fordøjelse og fjernelse af det øverste lipidlag supernatant efter spaltning og centrifugering under isolationsprocessen. Det kan også være nyttigt at skifte til friske rør efter at cellerne pelleteres som nogle lipidbestanddele overholde plastvæggene af rørene og kan forurene efterfølgende pellet skyllevand. Et andet punkt indebærer omhyggelige pleje til separate dermis fra epidermislangs epidermal-dermal krydset. Selvom kontaminerende epidermale celler vil blive fjernet af FACS udtømning strategi, skal stadig gøres en indsats for at begrænse forureningen her.

Begrænsningerne af denne fremgangsmåde omfatter den potentielle tilstedeværelse af kontaminerende celler ikke fanget af den nuværende slægt panelet. Når du vælger fluoroforen konjugeret til afstamning antistoffer (CD31, CD45, Tie2, TER119, EpCAM), skal forskerne sørge for at overveje anden overflade markør analyser, de måtte ønske at udføre. Yderligere pletter skal være i forskellige kanaler fra den valgte afstamning antistof fluorophor. Generelt fandt vi PacBlue at være en ideel konjugat, som bevarer et bredt udvalg af tilgængelige bølgelængder til yderligere analyse. Matchende viabilitetsfarvestoffet til slægt antistof fluorofor bevarer en yderligere bølgelængdeområde. For eksempel viabilitetsfarvestoffet DAPI exciterer og fluorescerer ved tilsvarende bølgelængder til PacBlue. På denne måde, alle DAPI posomt og afstamning antistof positive celler effektivt kan elimineres ved hjælp af en enkelt port, så kun levedygtige fibroblaster som målgruppen. Det skal også bemærkes, at celler udsættes for FBS under proceduren for begrænsede mængder af tid, og dette forventes påvirkninger genekspression isolation, en ukendt grad.

Evnen til inklusivt sortere alle fibroblast befolkninger udgør en mulighed for virkelig afhøre heterogenitet dette dårligt forstået celletype. Dette har anvendelse i forbindelse med den normale fysiologi samt en række sygdomme, der involverer overdreven fibrose og afvigende fibroblast adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af en bevilling fra NIH tilskud R01 GM087609 (til HPL), en gave fra Ingrid Lai og Bill Shu til ære for Anthony Shu (til HPL), NIH tilskud U01 HL099776 (til MTL), den Hagey Laboratoriet for Pediatric regenerativ medicin og The Oak Foundation (til MTL, GCG og HPL). GGW blev støttet af Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program, og NIGMS uddannelse tilskud GM07365. ZNM blev støttet af plastikkirurgi Fondens Forskningsenhed Fellowship Grant og Hagey Family Fund. MSH blev støttet af California Institute for regenerativ medicin (CIRM) Klinisk Fellow uddannelse tilskud TG2-01159, American Society of Maxillofacial kirurger (ASMS) / maxillofacial kirurger Foundation (MSF) Research Grant Award, og transplantationen og Tissue Engineering Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
  2. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
  3. Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
  4. Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
  5. Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
  6. Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
  7. Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
  8. Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
  9. Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
  10. Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
  11. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  12. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
  13. Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
  14. Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
  15. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  16. Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
  17. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
  18. Cormack, D. H. Ham's Histology. J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
  19. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
  20. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
  21. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
  22. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
  23. Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
  24. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
  25. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. e4425 (2013).
  26. Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).
  27. Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. (2015).
  28. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (2010).
  29. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
  30. Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
  31. Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics