Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

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Developmental Biology

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Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

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Abstract

Los fibroblastos son el tipo de célula principio responsable de la secreción de la matriz extracelular y son un componente crítico de muchos órganos y tejidos. Fisiología y patología de fibroblastos subyacen a un espectro de entidades clínicas, incluyendo fibrosis en múltiples órganos, cicatrización hipertrófica siguientes quemaduras, pérdida de la función cardíaca después de la isquemia, y la formación de estroma cáncer. Sin embargo, los fibroblastos siguen siendo un tipo mal caracterizado de la célula, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. Los métodos existentes para el aislamiento de los fibroblastos requieren tiempo en el cultivo celular que influye profundamente en el fenotipo celular y el comportamiento. En consecuencia, muchos estudios de investigación de la biología de los fibroblastos se basan en la manipulación in vitro y no reflejan con precisión el comportamiento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, hemos desarrollado un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de la piel dorsal de ratones adultos que no requiere el cultivo de células, con lo que preserving de la transcripción fisiológica y el perfil proteómico de cada celda. Nuestra estrategia permite la exclusión de linajes no mesenquimales través de una puerta negativa linaje (Lin -) en lugar de una estrategia de selección positiva para evitar la preselección o el enriquecimiento de una subpoblación de fibroblastos que expresan marcadores de superficie específicos y ser lo más inclusivo posible a través de esta heterogénea tipo de célula.

Introduction

Los fibroblastos se definen con frecuencia morfológicamente como células en forma de huso que se adhieren a sustratos de plástico. Los fibroblastos son el tipo de célula principio responsable de sintetizar y remodelación de la matriz extracelular en embrionarias y adultas órganos 1. Los fibroblastos son por lo tanto fundamental para el desarrollo de mamíferos y contribuyen sustancialmente al medio extracelular que influye en el comportamiento de la vecina tipos presentes en cada tejido y órgano de células.

Los fibroblastos son también el tipo célula principal detrás de un conjunto diverso de condiciones médicas que causan enorme carga clínica. Actividad de los fibroblastos patológica deteriora la función del tejido normal y incluye tejido y la fibrosis de órganos (tales como el pulmón y el hígado), la cicatrización después de la curación de la herida cutánea, la aterosclerosis, esclerosis sistémica, y la formación de placas de ateroma después de la lesión del vaso sanguíneo 2-5. La cicatrización de heridas, en particular, ambos, implica aguda y crónica deposition de tejido cicatrizal que ni se parece ni funciona como el tejido normal que lo rodea, y conduce a una morbilidad significativa a través de diversos estados patológicos. Después de una lesión, hay una transición de los fibroblastos para miofibroblastos, que luego se secretan componentes de ECM estructurales, ejercen efectos paracrinos en la vecina tipos de células, y restaurar la estabilidad mecánica mediante la deposición de tejido de cicatriz 6.

En los tejidos cutáneos existe una variación significativa en la calidad de la reparación de la herida a través del tiempo de desarrollo y entre los sitios anatómicos. En los dos primeros trimestres de la vida del feto se cura sin dejar cicatriz; Sin embargo, a partir del tercer trimestre de y durante la edad adulta, los seres humanos a sanar con una cicatriz. , Además de la edad específica, existen específica de sitio diferencias en la cicatrización de heridas. Las heridas en la cavidad oral remodelar con mínima formación de cicatriz 7,8, mientras que la deposición de tejido cicatricial dentro de heridas cutáneas es significativa 9. La controversia persiste concerning la influencia relativa del medio ambiente en comparación con las propiedades intrínsecas de los fibroblastos locales sobre el resultado de la cicatrización de heridas en lo que respecta a la edad y la ubicación 10,11. Teniendo en cuenta las diferencias significativas en la curación de ratón por vía oral vs. dermis cutáneas y embrionario temprano (E15) vs. tarde embrionaria (E18) dermis, es probable que existan diferencias intrínsecas en las poblaciones de fibroblastos a ciertas edades y de desarrollo entre los diversos sitios anatómicos .

En 1986, Harold F. Dvorak postuló tumores son heridas que no cicatrizan 12. Dvorak llegó a la conclusión de que los tumores se comportan como las heridas en el cuerpo y su estroma inducen mediante la activación de la respuesta de cicatrización de la herida del huésped. Ya que numerosos estudios han investigado la contribución de los fibroblastos para la progresión de los carcinomas de 13-15, pero como en el caso de la cicatrización de heridas, la identidad y el origen embrionario de los fibroblastos que contribuyen a la compartimiento del estroma de ca cutánearcinomas no se ha definido de manera adecuada. La respuesta a esta pregunta tiene relevancia médica dada estudios recientes que exponen el fibroblasto asociado al tumor como un objetivo potencialmente eficaz para la terapia contra el cáncer 16.

La identificación y el aislamiento de forma prospectiva los linajes de fibroblastos dotados de potencial fibrogénica in vivo es un paso esencial para manipular eficazmente su respuesta a una lesión en una amplia gama de enfermedades agudas y crónicas. En 1987, Cormack demostró dos subpoblaciones de fibroblastos, uno que reside dentro de la papilar y una dentro de la dermis reticular 17,18. Una tercera subpoblación se encontró asociado con los folículos pilosos de la región papila dérmica del 19,20 folículo. Cuando cultivadas, estas diferencias subtipos fibroblastos exhiben en el potencial de crecimiento, morfología y del factor de crecimiento / citoquinas perfiles 21-24.

Hasta la fecha, los estudios que examinan los fibroblastos queterogeneity han fracasado en gran medida para caracterizar adecuadamente la diversidad del desarrollo y funcional entre los fibroblastos in vivo. Esto es, en parte, es el resultado de una dependencia de poblaciones de fibroblastos cultivadas y el efecto homogeneizante de cultivo celular o selección positiva sobre la base de un receptor de superficie de uno mismo no se expresa por todos los fibroblastos 25. Un estudio reciente de nuestro laboratorio demostraron un marcador de superficie profunda y cambio transcripcional en cultivos de fibroblastos vs. incultos aislados por la metodología basada en el aislamiento FACS presentado en este manuscrito 26.

Posteriormente, se identificaron un linaje de fibroblastos específico dentro de la dermis dorsal murinos y determinamos que este linaje, que se define por la expresión embrionaria de Engrailed-1, es el principal responsable de la deposición de tejido conectivo en la piel dorsal. Las funciones de linaje durante ambas formas agudas y crónicas de la fibrosis, incluyendo la cicatrización de heridas, la formación de estroma cáncer, yradiación indujo fibrosis 27. La caracterización de los linajes de fibroblastos diferenciados tiene implicaciones importantes para las terapias dirigidas a la modulación de la conducta fibrogénica.

En lugar de utilizar protocolos existentes que se basan en la manipulación in vitro para lograr el aislamiento de células 28,29, el protocolo de la cosecha (Figura 1) se detalla aquí ayudará análisis informativos de rendimiento de los fibroblastos que capturan con mayor precisión el fenotipo y el comportamiento in vivo.

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Protocol

Este protocolo sigue los métodos aprobados por el grupo administrativo de la Universidad de Stanford en el Laboratorio Animal Care.

1. La digestión de murinos Dermis

  1. La eutanasia a los ratones por dislocación cervical después de la anestesia con una inyección intraperitoneal de acepromacina 3 mg / kg de ketamina 100 mg / kg + xilazina 20 mg / kg +.
    Nota: Varias edades y orígenes pueden ser utilizados.
  2. Afeitarse y depilarse la piel dorsal. Aproximadamente 100.000 células se pueden aislar a partir de un trozo de piel dorsal 60 mm x 100 mm.
  3. Sumerja el ratón en etanol al 70% y colóquelo sobre una superficie limpia y estéril para secar.
  4. Inmediatamente cosechar piel de ratón dorsal con tijeras de disección estériles. En los ratones hembra, evitar la inclusión del tejido mamario.
  5. Partiendo de la base de la cola, utilizar pinzas para carpa de la piel y hacer un corte transversal antes de la disección a lo largo del plano supra-fascial.
  6. Evitar cuidadosamente incluyendo la grasa subcutánea durante la cosechala piel. Examine la piel cosechados por cualquier grasa subcutánea y raspar con cuidado va a basar el borde romo de un bisturí.
  7. Enjuague la piel cosechado en betadine seguido de 5x lavados con PBS en hielo.
    Nota: Es importante mantener la piel lo más cerca posible estéril como sea posible para evitar la contaminación.
  8. Picar la piel usando cuchillas de afeitar y tijeras de disección en un plato estéril hasta que la muestra es de una consistencia uniforme con 2-3 piezas mm.
  9. Preparar 50 ml tubos cónicos de 20 ml que contienen colagenasa IV a una concentración de 1 mg / ml en DMEM. Divida la dermis en los tubos sobre la base de cinco ratones por tubo.
  10. Agitar las muestras vigorosamente mientras incubando a 37 ° C durante 1 hora, ya sea en un baño de agua o el horno.
  11. Extraer muestras de la incubadora y pasar a través de una jeringa de 10 ml sin aguja 3-5x en una campana estéril.
  12. Colocar las muestras de nuevo en la incubadora a 37 ° C y agitar vigorosamente durante 30 minutos más.
  13. En una campana estéril, Pipetear las muestras arriba y abajo 3-5x con una pipeta 10 ml. Pipetear la muestra a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
  14. Pasar 20 ml de DMEM 10% de FBS a través del mismo filtro para maximizar el rendimiento celular y llevar el volumen total a 40 ml. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  15. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de vidrio estéril, teniendo mucho cuidado de quitar primero la capa de grasa superior antes de sobrenadante restante.
    Nota: Este paso es fundamental para reducir la contaminación de los adipocitos.
  16. Resuspender los sedimentos en 20 ml 10% de FBS DMEM.
  17. Pasar la suspensión de células / DMEM través de un filtro 70 micras.
  18. Enjuague el filtro con 10 ml 10% de FBS DMEM y se centrifuga la suspensión se filtró a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  19. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de vidrio estéril, de nuevo teniendo cuidado de quitar primero cualquier capa de grasa restante.
  20. Si hay contaminación RBC significativa (el pellet es visiblemente rojo), volver a suspender los pelletsen 20 ml de tampón de lisis ACK y se incuba durante 5 min a TA. De lo contrario, vaya al paso 24.
  21. Añadir un volumen igual (20 ml) de tampón FACS (PBS, 10% de FBS, 0,1% de azida de sodio), a continuación, mezclar, y mantener a un lado una parte alícuota de 5 ml como un control sin teñir. Centrifugar la muestra restante a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  22. Eliminar el sobrenadante y poner de pellets en el hielo. Las células se pueden congelar abajo en este punto si el tiempo FACS no está disponible.

2. Aislamiento de los fibroblastos mediante FACS

  1. Hacer 500 l de mezcla de anticuerpos de incubación linaje para cada pellet. Para ello, primero mediante la adición de 475 l de tampón FACS que contienen DNasa (10 g / ml) a un tubo, y luego añadiendo-fluoróforo conjugado CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), y EpCAM (1: 100) anticuerpos para lograr la dilución respectiva para cada anticuerpo.
  2. Vuelva a suspender cada sedimento en 500 l de mezcla de anticuerpos de incubación linaje e incubar esta suspensión en hielo durante 20 min.
  3. Añadir 5ml FACS tampón que contenía ADNasa (10 mg / ml) a la muestra y mezclar suavemente. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  4. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento celular con tampón de FACS de 5 ml que contiene la ADNasa (10 mg / ml) y se centrifuga usando las mismas condiciones que en el paso 26.
  5. Resuspender el precipitado en 500 l de tampón FACS que contiene DNasa (10 mg / ml) y dejar a un lado una parte alícuota de 50 l como control de tinte viabilidad.
  6. Añadir colorante de viabilidad de elección para la muestra que queda en la concentración indicada para el colorante elegido.
  7. Realizar análisis FACS 31 y la clasificación para la viabilidad de tinte / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- células (véase la figura 2A). Ordenar directamente en tampón FACS.

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Representative Results

La validez de este enfoque (Figura 1) se ha verificado en varias formas, que pueden ser examinadas en detalle en nuestra publicación reciente 27. Estos incluyen inmunocitoquímica de células clasificadas y masa celular y celular solo análisis transcripcional de células recién ordenados. Clasificación fibroblastos directamente en lugar de depender de la cultura con mayor precisión capta su fenotipo in vivo. Utilizando un enfoque de linaje negativo agotamiento (Figura 2) en lugar de un enfoque de selección positiva evita pre-selección de subpoblaciones particulares. El valor de este enfoque se demostró recientemente por Rinkevich et. Al 27, la identificación de la presencia de fibroblastos CD26 positivos a nivel de la dermis previamente no descritas.

Para confirmar que el proceso de cultivar fibroblastos conduce a cambios significativos en la expresión génica, se utilizó microarrays para comparar fibroblastos cultivados a los fibroblastos no cultivados. Nos cultivadas fibroblastosque se aislaron mediante dos técnicas, el protocolo de cosecha en vivo se detalla en este manuscrito y un conocido protocolo de explante de tejido 28. Whole-transcriptoma análisis de microarrays reveló que los cultivos de fibroblastos aislados por la cosecha en vivo (C.LH) y por explante de tejido (C.TE) metodologías tienen un alto grado de similitud a nivel de todo el transcriptoma con un coeficiente de Pearson producto momento de correlación (r ) de 0,92 (Figura 2B). En comparación, los fibroblastos cultivados diferían significativamente de los fibroblastos incultos cosechados vivos (U.LH). Una comparación entre C.LH frente U.LH produjo un r de 0,61, mientras que una comparación de C.TE frente U.LH produjo un r de 0,64 (Figura 2B). Estos resultados establecen la importancia de analizar los fibroblastos cosechados en vivo en lugar de cultivos de fibroblastos. Para un análisis más completo de las diferencias de la transcripción y proteómicos entre fibroblastos cultivados y no cultivados aislados utilizando este protocolo, consulte Walmsley <em> et al. 26

Figura 1
Figura 1. Visión general de fibroblastos de aislamiento. Representación esquemática de los pasos principales que participan en este protocolo de aislamiento basado en FACS. Reutilizado con permiso de Walmsley, GG et al. Vive fibroblastos cosecha revela Superficie Shift Marker in vitro. La ingeniería de tejidos. Parte C, Métodos, doi:. 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. citometría de flujo y análisis de microarrays. (A) FACS estrategia gating mostrando la selección de células individuales (de izquierda parcela), la selección de células viables sobre la base de yoduro de propidio stanando (parcela media), y la selección de los fibroblastos (parcela derecha) sobre la base de la negatividad linaje para CD31, CD45, Tie2, Ter119 y EpCAM. (B) Análisis de microarrays de Uncultured vivo cosechada (U.LH) frente cultivadas en vivo Cosechado (C.LH) versus tejido cultivado explante (C.TE) Los fibroblastos. La similitud de la expresión génica entre U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), y C.TE (n = 3) poblaciones de fibroblastos según lo medido por el coeficiente de correlación momento-producto de Pearson (r). [C.LH vs. C.TE: r = 0,92]; [C.LH vs. U.LH: r = 0,61]; [C.TE vs. U.LH: r = 0,64]. Reutilizado con permiso de Walmsley, GG et al. Vive fibroblastos cosecha revela Superficie Shift Marker in vitro. La ingeniería de tejidos. Parte C, Métodos, doi:. 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo se describe en este manuscrito ofrece un medio para aislar los fibroblastos de la clasificación basada en la FACS, en comparación con los métodos existentes, que seleccionar para una subpoblación o requieren tiempo en cultivo celular antes de los análisis posteriores. El tiempo requerido desde la cosecha de la piel a la clasificación de los fibroblastos es de aproximadamente 6 horas; sin embargo, el número de ratones utilizados en la cosecha influirá en esta estimación.

Varios puntos en el protocolo requieren especial cuidado. El primero es limitar la contaminación de los adipocitos mediante la eliminación de la grasa de la piel antes de la digestión y la eliminación de la capa lipídica superior del sobrenadante después de la digestión y la centrifugación durante el proceso de aislamiento. También puede ser útil para cambiar a tubos nuevos después de que las células se sedimentan como algunos componentes lipídicos se adhieren a las paredes de plástico de los tubos y pueden contaminar los lavados posteriores de pellets. Un segundo punto consiste en la atención meticulosa a la dermis separadas de la epidermisa lo largo de la unión dermo-epidérmica. Aunque la contaminación de las células epidérmicas se eliminará por la estrategia de agotamiento FACS, todavía debe hacerse un esfuerzo para limitar la contaminación aquí.

Las limitaciones de este enfoque incluyen la presencia potencial de contaminación de las células que no refleje el panel de linaje actual. Al elegir el fluoróforo conjugado con los anticuerpos de linaje (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM), los investigadores deben tener cuidado para considerar otro marcador de superficie analiza que deseen realizar. Manchas, además, deben estar en canales distintos de la fluoróforo anticuerpos linaje escogido. En general, encontramos PacBlue ser un conjugado ideal que conserva una amplia gama de longitudes de onda disponibles para su posterior análisis. Coincidencia de la tintura viabilidad al fluoróforo anticuerpos linaje conserva una gama adicional de longitudes de onda. Por ejemplo, el colorante de viabilidad DAPI excita y emite fluorescencia a longitudes de onda similares a PacBlue. De esta manera, todo po DAPIcélulas positivas sitive y anticuerpos linaje se pueden eliminar de manera efectiva el uso de una sola puerta, dejando sólo los fibroblastos viables como la población objetivo. También debe tenerse en cuenta que las células se exponen a FBS durante el procedimiento de aislamiento por cantidades limitadas de tiempo y esto probablemente la expresión del gen influencias, en un grado desconocido.

La capacidad de ordenar inclusive para todas las poblaciones de fibroblastos representa una oportunidad para interrogar verdaderamente la heterogeneidad de este tipo de células poco conocidos. Esto tiene aplicación en el contexto de la fisiología normal, así como una variedad de enfermedades que involucran fibrosis excesiva y el comportamiento de fibroblastos aberrante.

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Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del NIH subvención R01 GM087609 (a HPL), un regalo de Ingrid Lai y Bill Shu en honor a Anthony Shu (a HPL), NIH U01 subvención HL099776 (a MTL), el Laboratorio Hagey para Pediátrica Medicina Regenerativa y La Fundación Oak (al MTL, GCG y HPL). GGW recibió el apoyo de la Escuela de Medicina de Stanford, el Programa de Capacitación de Stanford Medical Scientist, y GM07365 beca de formación NIGMS. ZNM fue apoyado por la Cirugía Plástica Fundación de Becas de Investigación Grant y el Fondo de la Familia Hagey. MSH fue apoyado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) Becario Clínico beca de formación TG2-01159, la Sociedad Americana de Cirujanos Maxilofaciales (ASMS) / Maxilofacial Cirujanos Foundation (MSF) Premio Beca de Investigación, y el Trasplante y Tissue Engineering Award Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

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References

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