Трансформация пробиотических дрожжей и их восстановление из желудочно-иммунных тканей После желудочный зонд у мышей

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Представленные здесь единое описание методов, которые могут быть использованы для разработки, преобразования, администрировать и проверить гетерологичный экспрессию белка пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Пробиотические микроорганизмы интригующая потенциальным средством эффективно и экономично доставлять гетерологичных белков в желудочно-кишечном тракте. Эти организмы способны выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт еще не колонизировать это один, что позволяет контролируемой дозировки и ограничение воздействия на препарат выражены. Кроме того, способность легко проектировать эти организмы производить гетерологичный белок в больших масштабах оказывает им экономичной альтернативой синтетических частиц доставки. Однако разработка такого подхода, как недавно продемонстрировано с использованием ауксотрофным пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди 2, требует знания лабораторных методов, которые традиционно не объединенных в пределах данного исследования, начиная от дрожжей и молекулярной биологии, к способам обработки животных и иммунологическими методами. Таким образом, хотя отдельные процедуры, описанные здесь, сами по себе не новаялабораторные протоколы, цель этой рукописи является представление единой введение в методы, необходимые для экспериментальной проверки пробиотических дрожжей в качестве средств доставки лекарств к мышиной желудочно-кишечного тракта. При условии, представляет собой подборку основных протоколов: 1) поколения ауксотрофных мутантных штаммов дрожжей, которые могут быть легко генетически измененных; 2) превращение дрожжевых культур, чтобы выразить гетерологичный белок; 3) введение рекомбинантного дрожжей в кишечник через желудочный зонд; и 4) восстановление жизнеспособных пробиотических рекомбинантного дрожжей из мышиного кишечника и оценки их экспрессии гетерологичных белков.

Во-первых, хотя многочисленные положительные и отрицательные методы отбора существуют для манипулирования видов дрожжей, негативный отбор, например, посредством использования ауксотрофных маркеров увеличивает как эффективность и легкость, с которой дрожжи могут быть преобразованы и выбран. Положительный отбор трансформантов с использованием антибиотиков, в сотрудничествеntrast, значительно увеличивает стоимость манипуляции дрожжей. Кроме того, выбор дрожжей на содержащую антибиотик твердых средах может позволить усиленному росту нетрансформированных фоновых колоний относительно отбора ауксотрофной дрожжей на синтетической отсева твердых средах (неопубликованные данные). Ауксотрофная дрожжи штаммы, которые испытывают недостаток ферментов критические для синтеза заменимых аминокислот или урацил. Такое дрожжи могут расти только тогда, когда дополняется пропавшего метаболита или метаболического гена, что позволяет негативный отбор, когда дрожжи высевали на синтетической отсева СМИ, что не хватает существенную метаболита. Многие широко используемые Saccharomyces CEREVISIAE лабораторные штаммы, на самом деле уже ауксотрофные мутанты 3. Промышленное, клиническая и пробиотические штаммы дрожжей, однако, как правило, прототрофным способностью синтезировать все необходимые питательные вещества. Чтобы обеспечить более эффективное генетических манипуляций такого дрожжей, ауксотрофные гены могут быть избирательно нацеленыгенерировать штаммов, которые могут быть выбраны без антибиотиков. Специфическое нацеливание ауксотрофных маркерных генов может быть достигнуто путем ПЦР-опосредованный разрушения гена, опираясь на гомологичной рекомбинации или совсем недавно через CRISPR / cas9 таргетинга 4 - 6. В качестве альтернативы, УФ мутагенеза может быстро генерировать ауксотрофные мутанты даже в дрожжевых штаммов, для которых преобразование с несколькими плазмид технически сложно 7. В то время как ПЦР таргетинг и CRISPR / cas9 были подробно описаны в другом месте, представлены в первой части этой рукописи является Подробный протокол описания мутагенеза подход УФ создать ауксотрофные штаммы, которые позволят негативной селекции, а не позитивной селекции антибиотиками дрожжевых трансформантов.

Следующий необходимый шаг в использовании таких ауксотрофных штаммов для пероральной доставки гетерологичного белка является превращение дрожжи с плазмидной ДНК. С первого успешного преобразования поименныйт сферопласты сообщенные для Saccharomyces CEREVISIAE в 1978 8, многочисленные модификации были охарактеризованы с целью повышения эффективности и легкости, с которой виды дрожжей могут быть генетически модифицированы. Использование электропорации для успешной трансформации ДНК в S. CEREVISIAE был впервые описан в 1985 году 9 и с тех пор улучшилась с помощью добавления 1 M сорбита инкубации к осмотически клеток поддержки 10. Эффективность Электропорация Кроме того, было показано, что зависит от вида дрожжей и штамм, количество клеток и фазы роста, объем электропорация, напряженности поля, а также конкретные буферы 11. Литий ацетата (LiOAc) преобразование, впервые описан Ito и др. 12, является одним из наиболее часто используемых протоколов трансформации, так как не требует специального оборудования. Дополнительные анализы показали, что эффективность дрожжевого трансформации LiOAc значительно возрастает, когда клетки собирают в середине логарифмической фазыроста и тепловому шоку в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ) и ДНК при 42 ° С 12. Инкубация всей неповрежденной дрожжей с ПЭГ имеет важное значение для эффективной трансформации, возможно, за счет повышения прикрепление ДНК к клеточной мембране, а также с помощью других эффектов на мембране 13. Сама литий также повышает проницаемость интактных клетках 14. Хотя большинство лабораторных S. Штаммы CEREVISIAE может быть легко преобразована с помощью преобразования LiOAc 3, другие виды дрожжей могут быть более эффективно трансформированы с использованием альтернативных протоколов. Pichia pastoris, например, наиболее эффективно преобразуется с помощью электропорации, а не трансформации LiOAc 13. Это имеет решающее значение, поэтому, чтобы испытать множественный методы преобразования и оптимизации инкубации и концентрации реагентов при попытке генетически модифицировать неохарактеризованных штамм дрожжей. Таким образом, эта рукопись описывает как LiOAc трansformation и электропорации также методы трансформации ауксотрофной мутанта и дикого типа S. boulardii. Заинтересованные читатели направлены на недавних обзоров для тщательной описаний эволюции трансформации дрожжей, альтернативных протоколов, и дальнейших обсуждений возможных механизмов действия 13,15. Трансформация дрожжей с плазмиду, кодирующую легко обнаружить белок является, кроме того, важное значение для нисходящего тестирования в целях обеспечения надлежащего выражения и функцию чужеродного протеина. Myriad различные белки могут быть выбраны в зависимости от конечной цели терапевтического исследования и антителами, доступных для обнаружения белка с помощью иммуноблоттинга, ELISA, и другими методами. Протоколы для этих методов были тщательно описаны в другом месте 16,17, и может быть использовано для определения уровней гетерологичной продукции белка из трансформированных дрожжей по сравнению со стандартными кривыми. Для целей демонстрации и показатьуспешное производство очень широко используется белка в дрожжевой биологии, эта рукопись представляет преобразование с плазмидой, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), который позволяет для последующего обнаружения с помощью флуоресцентной микроскопии.

Не менее важно, чтобы производство пробиотических микроорганизмов, которые экспрессируют гетерологичный белок является надлежащее управление и обнаружение этих микроорганизмов, обитающих внутри желудочно-кишечного тракта тканей, как описано в части трех и четырех. Администрация рекомбинантного дрожжей через желудочный зонд позволяет для доставки контролируемых количеств дрожжей непосредственно в желудок, из которого мыши C57BL / 6, естественно неспособным рвота 18. Тем не менее, неправильное обращение животных и через желудочный зонд может привести к повреждению пищевода и перфорации, перфорация желудка, введения трахеи и аспирационной пневмонии 19,20. Плохая техника и неопытность может, кроме того, повысить изменчивость в мышиных иммунных реакций и экспериментальной RESULTS, которые были отнесены к животным стресса на желудочный зонд 21,22. Практика в правильной технике может, таким образом, не только ослабить животное дискомфорт, но может также увеличить точность экспериментальных результатов. Эта рукопись описывает и демонстрирует обработку животных и желудочный зонд для введения контролируемых дозах рекомбинантного дрожжей.

Наконец, важно, чтобы подтвердить успешную доставку рекомбинантного дрожжей путем анализа лимфоидных тканей на присутствие дрожжей и гетерологичного белка. Желудочно-кишечного иммунные ткани, которые могут наиболее легко и предсказуемо быть рассмотрены на присутствие дрожжей пейеровы бляшки. Пейеровы бляшки являются вторичными лимфоидных органах вдоль тонкой кишки, которые являются ключевыми сайты слизистой индукции иммунного ответа 23. Антигены из просвета переносятся transcellularly через микроскладкой (M) клеток в эпителии и высвобождаются в пейеровы бляшки, тем самым подвергая вложитьd антиген представляющих клеток кишечного просвета содержимое. Хотя поглощение частиц через кишечный эпителий также может быть достигнуто путем бокаловидных клеток, эти клетки, как было показано только занимают частиц менее 0,02 мкм в диаметре 24. Трансэпителиальная дендриты продлен с CD103 + дендритные клетки (ДК) также занимают небольшие частицы из просвета кишечника 25; Однако, не существует в настоящее время никаких сообщений, демонстрирующих, что CD103 + ДК занимают частицы более бактерий. Таким образом, нетронутыми пробиотик дрожжи, среднего размера между 3-6 мкм в диаметре, скорее всего, будет рассмотрен М-клеток и переносили в пейеровы бляшки. Описанный здесь является протоколом для сбора и скрининга пейеровы бляшки для жизнеспособного рекомбинантного дрожжей, хотя эта процедура также может быть легко адаптированы для оценки поглощение пробиотических бактерий.

Таким образом, оценивая рекомбинантный пробиотик дрожжи для доставки изrapeutic белки в кишечнике требует знания в лабораторных методик, охватывающих молекулярной биологии к обработке животных и иммунологии. Представленные здесь протоколы для 1) генерация и отбор ауксотрофных штаммов дрожжей, которые могут быть легко отрицательно выбран без антибиотиков, 2) альтернативные протоколы для преобразования дрожжи и позволяют экспрессию гетерологичного белка, 3) демонстрации надлежащих методов обработки животных и желудочный зонд для внутрижелудочной доставки рекомбинантного дрожжей и 4) протоколы для коммутационной диссекции Пейера и скрининга жизнеспособного рекомбинантного дрожжей и функциональной гетерологичного белка. В совокупности эти протоколы позволят для генерации и проверки пробиотика штамма дрожжей, способных доставлять гетерологичный терапевтический белок в желудочно-кишечном тракте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. УФ мутагенеза для генерации Ауксотрофные штаммов дрожжей

  1. Создать кривые выживаемости определение необходимой дозы УФ-облучения
    1. Подготовьте YPD (дрожжевой экстракт пептон декстроза) носитель и другие реагенты, перечисленные в таблице 1, в соответствии со стандартными процедурами 26 и инокуляции единичных колоний в 5-10 мл YPD средах. Выдержите культур на роликовом барабане при температуре 30 ° CO / N до насыщения, по крайней мере 8 часов.
    2. Определить концентрацию клеток O / N культур с использованием спектрофотометра путем разбавления клеткам 1:10 в воде в пластиковую кювету. Развести клетки в концентрации 10 7 клеток / мл в 20 мл стерильной дистиллированной воды.
    3. Налейте разведенного клетки в стерильный пластиковый чашку Петри и, с крышкой удалены, поместите пластины 14 см ниже ультрафиолетовой лампы.
    4. Expose клетки к последовательному 5000 мкДж и 10000 мкДж дозы УФ-облучения, извлечение 500 мкл клеток после каждого приращения такой, что клеткиотбираются после воздействия 0 мкДж, 5000 мкДж, 10000 мкДж, 15000 мкДж, 20000 мкДж, 25000 мкДж, 30000 мкДж, 40000 мкДж и 50000 мкДж УФ облучения. Передача экстрагируют образцы клеток в стерильную 1,5 мл пробирки и серийно разбавленных в 1:10 шагом в стерильной воде.
    5. Гранул клеток в каждом разведении путем центрифугирования в микроцентрифуге при 16000 х г в течение 1 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в объеме 100 мкл стерильной подходящей воды для посева дрожжевых клеток. Пипетировать полного объема ресуспендировали клеток на чашки, содержащие YPD твердые носители и использовать стерильные разбрасыватель для равномерного распределения клеток по каждой пластине.
    6. Оберните края пластины в парафильмом, чтобы предотвратить высыхание носителя и накладок в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить фото-реактивации и ремонт УФ-индуцированных мутаций. Выдержите пластины с ног на голову на 30 ° С в течение 2-4 дней, чтобы для роста жизнеспособных колоний дрожжей (рисунок 1).
    7. Подсчитайте Numbeг колоний, необязательно с помощью пера для разметки подсчитанные колонии, ручные электронные счетчика пера, или счетчика стоять с увеличением. Участок в процентах от общего объема посеянных клеток при каждой дозе мкДж УФ-облучения для построения кривой выживаемости облученных дрожжей (Рис.2).
      Примечание: гаплоидных штаммы дрожжей можно ожидать потребовать более низкие дозы УФ-облучения по отношению к диплоидных штаммов для достижения той же выживание процентов. Штамм дрожжей хватает функциональные ферментов репарации ДНК, такие как Rad1 S. CEREVISIAE мутант, может быть использован в качестве положительного контроля, чтобы указывать на наличие УФ-облучения при очень низких дозах.
    8. Определить дозу УФ мутагенеза, которые будут использоваться для скрининга путем обращения к кривой выживаемости установленном в 1.1.7. Х значение точки вдоль кривой выживаемости, где у равен 50 УФ-облучение дозой, при которой 50% дрожжей выжить. Скрининг мутантов на таком низком выживания процентов может привести кболее высокий выход успешно мутировавших штаммов, в частности, для диплоидных дрожжей. Доза выживание 50% для WT S. boulardii, как показано на рисунке 2, примерно 18 000 мкДж.
      Примечание: Хотя такие высокого дозы УФ-излучения увеличивает риск мутаций в генах для клеточных путей, отличных от ауксотрофной маркерного гена интереса, этот недостаток должен быть сбалансированным с необходимостью приводить к мутациям в обеих копиях гена ауксотрофной маркера. Для гаплоидных штаммов, в которых должны быть мутировавших только один ген копию, скрининг на более высоком выживание процентов, например, на 90%, снижает риск дополнительных мутаций и до сих пор позволяет достаточной поколения ауксотрофных мутантов.
  2. УФ мутагенеза и скрининга ауксотрофных штаммов дрожжей
    1. Подготовьте дрожжи, как описано в шагах 1.1.1-1.1.3.
    2. Expose дрожжи в дозе УФ-облучения, соответствующего выживания 50%, как это определено в 1.1.8. Для WT S. boulardii, эта доза ваS определяется как примерно 18 000 мкДж (Рисунок 2).
    3. Сбор 1 мл объемы УФ облучении дрожжей и осадка путем центрифугирования в микроцентрифуге при 16000 х г в течение 1 мин. супернатант и ресуспендирования клеток вытяжку в 100 мкл стерильной воды.
      1. Выбор мутантов
        1. При использовании выбор таких как с ura3 - ауксотрофные мутанты, пластина облучается дрожжи на среде, содержащей 5-fluoroorotic кислоту (5-FOA) дл отбора клеток, не содержащих функциональным геном URA3 фермент.
          Примечание: Любые дрожжи, содержащий функциональные копии URA3 будет преобразовывать к 5-FOA, чтобы токсин 5-фторурацила, что приводит к гибели клеток и позволяет легко отбора ura3 - колоний, в которых отсутствует функциональным геном URA3 27. Аналогичные подходы отбора возможны для Lys2 и LYS5; маркеров и MET2 и MET15 использованием средств массовой информации, содержащие альфа-аминоадипиновая кислоты 28; TRP1; 5-фторантраниловой кислоты 29; и метил ртути 30,31, соответственно.
        2. Внесите 100 мкл ресуспендировали клеток на минимальных средах, содержащих 5-FOA и использовать стерильный разбрасыватель для равномерного покрытия пластины. Обертка пластин в Parafilm и инкубируют перевернутом при 30 ° С в течение 2-4 дней, чтобы позволить для роста жизнеспособных колоний дрожжей.
        3. Подтвердите URA3 - фенотип любой колонии, появляющиеся на 5-FOA пластин повторного посева штрихом на YPD, урацил - и 5-FOA пластины (Рисунок 3). Используйте кончик стерильным зубочисткой, чтобы собрать часть одной колонии и аккуратно перетащите ячейки на свежем YPD, урацил - и 5-FOA пластин. Опять инкубировать обернутые пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2-4 дней.
          Примечание: жизнеспособных колоний появится как поднял, примерно круговые наросты в то время нежизнеспособных клеток появится только в виде непрозрачной мазке без каких-либо поднятых наростов (рисунок 3).
      2. Screening мутантов
        1. Если генерации ауксотрофного мутанта, для которых методы отбора не доступен, подготовить последовательные 1:10 разведения УФ облучении дрожжевых клеток в стерильной воде и пипетки разведения на YPD СМИ, используя стерильный разбрасыватель для равномерного Покройте пластину.
        2. Оберните пластин в парафильмом и инкубировать с ног на голову на 30 ° С в течение 2-4 дней. Определить, какой разбавление допустимую для роста отдельных колоний, которые можно легко отличить друг от друга, как правило, не более примерно 100 колоний на чашку.
        3. Повторите УФ мутагенеза пробах дрожжей, как описано в 1.2.1-1.2.3 и пластинчатых клеток при этом определенной разбавления. Внесите разведенные дрожжи на YPD СМИ, использовать стерильные разбрасыватель распределить клетки и инкубировать обернутые пластины с ног на голову на 30 ° С в течение 2-4 дней.
        4. Экран для ауксотрофам по реплик на селективной среде, лишенных метаболит интерес. Во-первых, обеспечить стерильную бархатную подушку на тарелке стендеи пластину перевернули с УФ облучении колоний на бархате, отмечая ориентацию пластины.
        5. Далее, инвертировать свежий пластину, в которых отсутствует метаболит интерес на бархата и слегка придавить, чтобы передать клеток из бархата на тарелку. Хранить исходный планшет при 4 ° С. Оберните и инкубировать новый планшет вверх дном при 30 ° С в течение 2-4 дней.
        6. В качестве альтернативы реплик, мутантов экране, повторно полосатость колоний от YPD на селективных средах. Используйте кончик стерильным зубочисткой, чтобы собрать часть одной колонии и аккуратно перетащите ячейки на свежем YPD пластины и пластины, лишенного метаболит интерес. Опять инкубировать обернутые пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2-4 дней.
          Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы выбрать отдельные колонии и серию из колонии несколько раз, чтобы подтвердить однородное население верных ауксотрофных клеток.
    4. Далее подтвердить фенотип облученных клеток путем inoculatING отдельных колоний в 5-10 мл как YPD и СМИ, не имеющих соответствующего метаболита (например, в урацил - медиа для URA3 - мутанта). Инкубируйте на роликовом барабане при 30 ° CO / N, чтобы подтвердить рост клеток в YPD сред, но не в отсутствие метаболита.
      Примечание: Хотя модели роста на твердых средах следует четко указать дрожжей ауксотрофного статус, это возможно для некоторых дрожжей терпеть стрессы и образуют небольшие медленно растущей колонии на твердых средах, но еще не потерпит таких же условий в жидких средах (неопубликованные наблюдения). Прививка в жидких культурах должны, таким образом, быть выполнена тщательно подтвердить динамику роста УФ облучении мутантов.
    5. Для длительного хранения подтвержденных ауксотрофных мутантов, подготовить запасы глицерина путем инокуляции клеток в 10 мл YPD и инкубации на валец O / N при 30 ° С. Гранул клетки центрифугированием в течение 3 мин при 2500 XG и аспирации СМИ. Ресуспендируют клеток в 50%стерильно фильтруют глицерин, трансфер в криопробирку и хранить при температуре -80 ° C.
      Примечание: УФ мутагенезу дрожжи потенциально содержат мутации в других, чем в ауксотрофной маркера интерес множества генов. Прежде чем продолжить с использованием проверенных ауксотрофных мутантов, эти штаммы должны быть дополнительно проанализированы с помощью секвенирования генов и оценки стойкости к рН, напряжений желчных кислот и других характеристик, относящихся к пробиотических штаммов, как описано в другом месте 2. Кроме того, применение ПЦР гомологии или CRISPR / cas9 нацеливания более избирательно мутировать ауксотрофные маркеры должны быть рассмотрены в качестве альтернативы УФ мутагенеза 4 - 6.

Трансформация 2. Дрожжи

  1. LiOAc Трансформация дрожжей
    1. Привить одиночные колоний дрожжей в 5-10 мл YPD СМИ и инкубировать на валец при 30 ° CO / N.
    2. Чтобы вызвать рост логарифмической фазе и повышение эффективности плазмиды поглощения, деКонцентрация лить клеток с использованием спектрофотометра для измерения разведении 1:10 клеток в стерильной воде в пластиковую кювету. Развести O / N культур до оптической плотности 600 из 0.16-0.2 (приблизительно 2 х 10 6 - 2,5 х 10 6 клеток / мл) в 50 мл свежего теплого YPD и инкубировать клетки на орбитальном шейкере платформы не установлен в 200 оборотов в минуту до культуры достигает примерно 1 × 10 7 клеток / мл, обычно около 4 ч.
      Примечание: Эффективность трансформации можно измерить как функцию количества успешно трансформированных образующих дрожжи колонии единиц (КОЕ) на мкг ДНК плазмиды. Увеличение результатов эффективности в более трансформированных колоний на мкг ДНК плазмиды. Субкультивирование дрожжевых клеток и сбор во время роста логарифмической фазе является одним из факторов, который увеличивает эффективность трансформации 12.
    3. Гранул клетки центрифугированием при 2500 х г в течение 3 мин.
    4. Аспирата супернатант и передачи клеткам в 1,5 мл трубки микроцентрифужных ресуспендирования ПеллET в 1 мл стерильной воды.
    5. Гранул клетки центрифугированием при 16000 х г в течение 1 мин в микроцентрифуге, аспирата супернатант и промыть клетки ресуспендируя в 1 мл ТЕ / LiOAc (Трис ЭДТА LiOAc) буфера.
    6. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в буфере ТЕ / LiOAc до концентрации 2 х 10 9 клеток / мл.
    7. Подготовьте смеси трансформации с каждым из следующих: 50 мкл приготовленной дрожжей в буфере ТЕ / LiOAc, 5 мкл ДНК-носителя (10 мкг / мкл) и 1 мкл ДНК плазмиды (1 мкг). Микрограммов плазмидной ДНК можно титровать как увеличение количества ДНК может или не может привести к увеличению эффективности трансформации 32
      Примечание: Для мутантного штамма дрожжей хватает одного ауксотрофного маркер, только один плазмиду, кодирующую маркер может быть преобразована в образце. Кроме того, использование плазмиды, кодирующей легко детектируемый белок, такой как GFP, позволит эффективно определения надлежащего сворачивания и экспрессии гетерологичной прotein дрожжевым штаммом последующей трансформацией.
    8. Для каждого препарата, добавить 300 мкл ПЭГ / LiOAc / TE и вихря тщательно. Инкубация интактных клеток с ПЭГ имеет важное значение для эффективной трансформации 13.
    9. Инкубируйте препаратов при 30 ° С в течение 30 мин при перемешивании путем размещения микроцентрифужных пробирок в стакане размещены на орбитальном шейкере при платформы 200 оборотов в минуту.
    10. Добавить 35 мкл ДМСО для каждой реакции и теплового шока клеток в течение 15 мин в C водяной бане 42 °. Хотя есть противоречивые сообщения о дополнительным преимуществом ДМСО 33, теплового шока интактных дрожжевых клеток было показано, чтобы значительно повысить эффективность преобразования 12.
    11. Вымойте клеток путем гранулирования с помощью центрифугирования, как в 2.1.5, аспирационных или пипетки надосадочную и ресуспендирования в 1 мл стерильной воды. Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток.
      Примечание: Очень важно, чтобы тщательно удалить супернатант, так как использование средств массовой информацииd в создании компетентных клеток может ингибировать рост дрожжей и образование колоний.
    12. Повторите клеток гранулирования, как в 2.1.5, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл стерильной воды. Внесите полный объем на выборочной пластины и использовать стерильный разбрасыватель для равномерного покрытия пластины с трансформированных дрожжей.
    13. Обертка края пластин с покрытием в Parafilm чтобы предотвратить высыхание сред и инкубировать перевернутом при 30 ° С в течение 2 дней, чтобы позволить роста трансформированные клетки дрожжей. Успешное, эффективное преобразование и ауксотрофная выбор Saccharomyces CEREVISIAE дает большое количество колоний на подготовке преобразования, хотя выход может быть значительно ниже для других штаммов (рисунок 4).
    14. Хранить дрожжи пластины для краткосрочной перспективе (как правило 1-3 недели) в перевернутом положении и закрытого при 4 ° С. Подготовьте запасы глицерина трансформированных дрожжей, как описано в 1.2.5 для длительного хранения.
      Примечание: Дальнейшие исследования тестирование превращается CFU необходимы для определения стабильности плазмид и оценивать надлежащий экспрессию гетерологичного белка. Тщательные описания стабильности плазмиды 34, использование иммуноблоттинга для обнаружения денатурированные белки восстановленные из образцов клеток 17, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для обнаружения правильно уложенный трехмерные белки 16 и использование GFP в дрожжевых исследований 35 доступны в другом месте. Рисунок 6 показан репрезентативный образ успешного выражения GFP в трансформированном S. CEREVISIAE относительно нетрансформированных клеток. Использование такого флуоресцентного белка является одним из способов эффективного определения успешного производства гетерологичный белок.
  2. Электропорация дрожжей
    1. Привить одиночные колоний дрожжей в 5-10 мл YPD СМИ и инкубировать на валец при 30 ° CO / N.
    2. Определить концентрацию клеток с использованием спектрофотометра для измерения разведении 1:10 клеток в стерильной воде. дилютня O / N культуры в 100 мл свежих теплые YPD СМИ к OD 600 эквивалент приблизительно 0,3. Инкубируйте субкультуры при 30 ° С на орбитальном наборе платформа шейкера до 200 оборотов в минуту до достижения внешний диаметр 600 примерно 1,6, обычно 4-5 ч. Каждые 100 мл субкультура будет генерировать достаточно условные ячейки для двух реакций трансформации.
    3. Гранул клетки центрифугированием при 2500 х г в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант и промыть клетки путем ресуспендирования в 50 мл охлажденного на льду стерильного воды. Повторите стирать гранулирования клетки, аспирации супернатант, и ресуспендирования в свежей 50 мл ледяной стерильной водой.
    4. Гранул клетки снова и ресуспендируют в 50 мл охлажденного льдом буфера (электропорации 1 М сорбит, 1 мМ CaCl 2).
    5. Повторите спин, как в 2.2.3, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 20 мл 0,1 М LiOAc / 10 мМ DTT. Инкубируйте клеточной суспензии на роликовом барабане при 30 ° С в течение 30 мин. Преинкубация клеток в LiOAc и DTT синергически повышаетЭффективность электропорации 36.
    6. Гранул клетки как в 2.2.3, удалить супернатант, и мыть путем ресуспендирования в 50 мл ледяной буфера холодной электропорации. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в ледяной буфера холодной электропорации до конечного объема 1 мл.
    7. Подготовьте на льду: кондиционером дрожжевых клеток, стерильные электропорации кюветы и плазмидной ДНК. Сразу же после окончательного взмучивания условных клеток в буфере электропорации 1 мл, сочетать 400 мкл условные дрожжевых клеток примерно 1 мкг плазмидной ДНК и добавить к охлажденному льдом 0,2 мкм электропорации кюветы. Использование повышенных количеств ДНК может незначительно повысить эффективность преобразования 11. Инкубируйте реакции на льду в течение 5 мин, затем электропорации с множеством электропораторе 2,5 кВ и 25 мкФ.
      Примечание: Как описано в 2.1.7, мутант штамма дрожжей хватает одного ауксотрофного маркер может быть трансформирован только один плазмиду, кодирующую мутированный маркер на отсчет. Кроме того, с помощьюплазмида, которая кодирует детектируемый белок легко такие как GFP позволяет эффективно определения надлежащего сворачивания и экспрессии гетерологичного белка последующей трансформацией.
    8. Передача электропорации клетки в 8 мл смеси 1: 1 YPD: 1 М сорбит, и позволяют клеткам инкубировать на роликовом барабане при 30 ° С в течение 60 мин.
    9. Гранул клетки как в 2.2.3 и ресуспендируют в 100 мкл 1: 1 YPD: 1 М сорбит. Пластинчатый полный объем на селективных средах, содержащих 1 М сорбит, обернуть края пластин в Parafilm, и инкубировать пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2-5 дней, чтобы позволить роста трансформированные клетки дрожжей.
      Примечание: Очень важно, чтобы тест-трансформированных дрожжей оценить надлежащую экспрессию гетерологичного белка, как описано в 2.1.14 и 2.2.7.

3. желудочный зонд мышей с трансформированных дрожжей

  1. Выполните все процедуры по уходу за животными и обработки в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных Animals и институциональная Уход за животными и утверждение Используйте комитета.
  2. Подготовьте O / N дрожжевых культур путем посева отдельных колоний трансформированных ауксотрофной дрожжей в 5-10 мл селективной среде. Инкубируйте культур O / N в течение по крайней мере 8 ч на вальцовой барабане при температуре 30 ° С до тех пор, пока насыщенный.
    Примечание: Использование плазмиды, кодирующей тестовых белков, таких как GFP позволит для простоты тестирования экспрессии белка в дрожжах через желудочный зонд, как описано в 4.7.
  3. Для максимальной индукции экспрессии белка и, чтобы вызвать рост логарифмической фазе, готовят субкультуры от O / N культуры путем разбавления до OD 600, эквивалентному примерно 0.16-0.2 в 50 мл соответствующих средах, как описано в 2.1.2.
  4. Определить концентрацию пересевают клетки, как в 1.1.2 и отрегулировать до 10 9 клеток / мл. Подготовьте дозу 100 мкл для каждой мыши, с несколькими сотнями мкл дополнительного объема в группе для повышения точности и легкости загрузки образца.
  5. Гранул клетки центрифугированием при 2500 мкг в течение3 мин или в микроцентрифуге при 16000 х г в течение 1 мин. Аспирировать супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления равного объема стерилизованной воды и осторожно пипеткой вверх и вниз.
  6. Зафиксируем соответствующий датчик через зонд иглу (22 г на 15-20 г мышей) на 1 мл стерильный шприц и нагрузки дрожжей образца, будучи уверенным, чтобы устранить любые пузыри и установить поршень к приращению 100 мкл. Загрузите дополнительный шприц стерильной водой до контрольных мышей через желудочный зонд и проверить на наличие любого загрязняющего дрожжей.
  7. Возьмите мышь, чтобы быть введенным зондом с использованием не доминантной рукой, с указательным и большим пальцем плотно захватывая кожу вокруг шеи (6А). Tuck хвост под мизинцем, чтобы предотвратить перемещение нижней части тела. Убедитесь, что рукоятка находится в безопасности, и запрещает мышь двигаться голову, чтобы предотвратить повреждение внутренних тканей во зонд.
    Примечание: Расчетный насколько через желудочный зонд игла должна быть вставлена, удерживая иглу против мыши такого, чтолуковица даже с мечевидного отростка грудины. Вставка эту длину иглы, как правило, позволяют через желудочный зонд иглы шарика, чтобы войти в живот.
  8. Использование доминирующую руку, аккуратно вставьте через зонд иглу в пищевод мыши по наклонив иглу вдоль нёба и задней части горла, слегка держась левой стороны от центра. Подождите мышь проглотить лампочку иглы и позволяют игла спускаться чуть дальше к точке оценивается в 3,7 (фиг.6В). Если какой-либо ощущается сопротивление во время введения через зонд иглы или если мышь в любое время начинает задыхаться, аккуратно удалить иглу и снова попытаться найти пищевод.
  9. После того, как мышь проглотил луковицу через зонд иглы, осторожно нажмите на поршень шприца для введения 100 мкл (10 8 КОЕ) дрожжей непосредственно в желудок мыши.
    Примечание: Хотя мыши неспособны к рвоте любого из через желудочный зонд раствора после введения 18,19 21,37. Правильное вставление зондового иглы, а также регулировка громкости и вязкость раствора, может помочь ограничить рефлюкс и обеспечить точное дозирование.
  10. Осторожно снимите через зонд иглу из желудка мыши и пищевода и вернуть мышь в клетке. Проверка того, что мышь дышит и движется нормально после введения через зонд для того, чтобы через желудочный зонд игла вставлена ​​в течение всей процедуры и что ни одно решение не отсасывали.

4. Урожай Патчи мышиных бляшках и Выделение жизнеспособных колоний дрожжей

  1. В соответствующее время точка сообщению зонд, как правило, 4 часа, жертва мышей с использованием IACUC одобрен методы. Проверьте отсутствие отзывчивости следующей ОО крайнем случае, и использовать вторичную меру, такие как смещения шейных позвонков пожертвовать мышь. Среди прочих время также могут быть проверены, так как многочисленные исследования показали, что эффективность и сроки допринять по эпителия зависит 38,39 частиц.
  2. Положите мышь с живота полностью открытой и стерилизовать области живота опрыскиванием 70% этанола. Сделать поперечный разрез через меха и кожи с помощью ножниц, соблюдая осторожность, чтобы не повредить внутренние ткани. Вручную вырвать разрез открыть дополнительно подвергать брюшины, тонкая серозная прокладку, охватывающую органы брюшной полости. Аккуратно поднимите брюшину и сделать поперечную разрез подвергать кишечник.
  3. Осторожно использовать тупые щипцов, чтобы дразнить тонкую кишку от брыжейки артерий, жира и других тканей. Защиту тонкую кишку из желудка, в верхнем левом квадранте живота мыши, чтобы слепой кишки, большой карман кишечной ткани в начале толстой кишки.
  4. Изолировать пейеровы бляшки, глядя на 1-3 мм примерно круговые пятнами непрозрачной ткани вдоль тонкой кишки (рис 7). Использование изогнутых рассечение SCISсоры, срезать купол патч бляшки, оставляя поля для того, чтобы ни один из окружающего собственной пластинке не собирается.
    Примечание: Большинство мышей имеют между 4-8 легко видимых пейеровы бляшки. Выполнение процедуры в районе с прямым верхним освещением увеличит легкость, с которой пейеровы бляшки могут быть визуализированы.
  5. Собрать расчлененный пейеровых бляшек в полном Айскоува в модифицированной медиа (IMDM) Дульбекко.
    Примечание: Очень важно, чтобы использовать стерильную технику и включают антибиотики в сборе информации в целях предотвращения желудочно бактериального заражения дрожжей пластин.
  6. патчи штамма бляшки через ячейки фильтра 40 мкм для устранения сбора информации. патчи мыть бляшки с свежей полной IMDM более 50 мл пробирку и использовать поршень из шприца емкостью 1 мл, чтобы аккуратно разбить пейеровы бляшки. Гранул натянутые клетки центрифугированием при 1800 оборотов в минуту в течение 7 мин. супернатант и ресуспендирования клеток вытяжку вконечный объем приблизительно 100 мкл.
  7. Применить напряженные клеток на селективных средах дрожжей и использовать пластины разбрасыватель для равномерного распределения клеток. Обертка края пластины в Parafilm и инкубировать пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2 дней, чтобы позволить для роста любого жизнеспособного дрожжей, извлеченного из пластырей мышиного Пейера.
    Примечание: Дальнейшие исследования после восстановления дрожжей из пейеровых бляшек 'необходимы, чтобы подтвердить, что штаммы способны доставить правильно уложенного чужеродного протеина в этих иммунных тканей. Как описано в 2.1.14, такие методы могут включать иммуноблоттинга, ИФА, или флуоресцентной микроскопии для обнаружения флуоресцентные белки, такие как GFP 2,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Генерация кривой выживаемости следующей УФ-облучения требует металлизацию разбавленных дрожжевых клеток таким образом, что различные колониеобразующих единиц (КОЕ) способны образовывать. Каждый образец 500 мкл собирали, как описано выше, содержит около 5 х 10 6 клеток; Однако, больше чем 100 колоний на пластину трудно точно отличить. Покрытие неразбавленный образец, а также серийные разведения 1:10 облученных клеток, таким образом, гарантирует, что КОЕ могут быть перечислены на каждой дозы ультрафиолета, как показано на рисунке 1. Подсчитайте КОЕ, умножается на коэффициент разбавления, затем делится на общее число оригинальные облученные клетки в каждой пробе 500 мкл с целью определения выживаемости процентов при каждой дозе. Рисунок 2 показывает расчетную процент диплоидных дикого типа S. boulardii клетки способны выживать 0 мкДж, 5000 мкДж, 10000 мкДж, 15000 мкДж, 20000 мкДж, 22500 мкДж, 25000мкДж, 35000 мкДж и 50000 мкДж. Эти данные установить четкую кривую, которая может быть использована, чтобы найти дозу, соответствующую выживание 50%.

После выбора дозы ультрафиолета и облучения дрожжевых клеток, важно, чтобы экран мутантных колоний для подтверждения отсутствия функционального гена ауксотрофной маркера. Использование метода отбора, как описано в 1.2.3.1 и показано на рисунке 3, значительно повышает эффективность подтверждения фенотипа. Показанный пример селекции URA3, что использует конверсии 5-FOA к токсину 5-FU по неповрежденной URA3. Аналогичные подходы доступны для Lys2 и LYS5; TRP1 и MET2 и MET15 и повысить эффективность отбора этих мутаций. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы выбрать отдельные колонии во скрининга. Последовательный рост мутантных колоний на YPD и 5-FOA, но не урацил - планшеты indicatэс ауксотрофного фенотип.

Рисунок 4 показывает эффективность преобразования для дикого типа S. boulardii (Sb) по отношению к обычно используемым лаборатории С. Штамм CEREVISIAE (Sc) с использованием как LiOAc (LiOAc) и электропорации методы (Electro). Хотя преобразование LiOAc является очень эффективным для S. CEREVISIAE, эффективность преобразования для S. boulardii значительно улучшается с помощью электропорации. Рисунок 5 показывает использование флуоресцентной микроскопии в качестве примера метода анализа надлежащего экспрессию белка из трансформированных дрожжей. Светлое (А) и флуоресценции (B) изображения отображаются для S. CEREVISIAE трансформируют кодирования GFP URA3 плазмиду, демонстрируя функциональной экспрессии гетерологичного белка из трансформированных дрожжей. Клетки могут быть иммобилизованы для лучшей визуализации с использованием покровные покрытыми конканавалина A (пальто 5 мкл 2мг / мл маточного раствора в воде на каждый покровное 22 х 22 мкм и сухой воздух).

показывает C57BL / 6 мыши проводиться до желудочный зонд. Рука сжимает спину и шею мыши твердо такой, что мышь не может двигаться головы в любом направлении. Этот запрет позволяет через желудочный зонд иглы для размещения точно и со снижением риска повреждения тканей. показывает иглу через зонд проводится после мышь глотает через зонд иглу. После периода инкубации, тонкой кишки жертвенного мыши должны быть тщательно при помощи иглы от окружающих тканей, как показано на рисунке 7. Эта манипуляция позволяет легко идентифицировать пейеровых бляшек и для чистого рассечения пластырей без сбора любой из окружающих собственная пластинка. Наконец, Рисунок 8 показывает типичный восстановление жизнеспособных дрожжей КОЕ от пейеровы бляшки. Решения Дрожжи Медиа и плиты Трансформация Реагенты Полиэтиленгликоль (ПЭГ) 50%: YPD: ТЕ / LiOAc: 250 г ПЭГ 3350 20 г пептона 50 мл 10x TE 500 мл стерильную воду 20 г декстрозы 50 мл 10x (1M) LiOAc Фильтр стерилизуют 10 г дрожжевого экстракта 400 мл стерильную воду 1 л воды Фильтр стерилизуют автоклав TE 10x: YPD пластины: ПЭГ / TE / LiOAc: 100 мМ Трис 20 г пептона 400 мл 50% ПЭГ 10 мМ ЭДТА 20 г декстрозы 50 мл 10x TE рН до 7,5 и стерилизуют фильтра 20 г агара 50 мл 10x (1M) LiOAc 10 г дрожжевого экстракта 1 л воды автоклав 20% глюкозы: Урацил - селективные среды ДНК Carrier (ДНК СС): 200 г декстрозы 2 г смеси аминокислота без урацила Хранить при -20 ° C и до использования тепла в течение 1-2 мин при температуре 100 ° С, чтобы расплавить нити и хранить на льду 1 л воды 6,7 г дрожжевого азотистого основания без аминокислот Фильтр стерилизуют 1 л воды <TR> Стерилизовать автоклавированием или стерильной фильтрации Добавить 20% глюкозы 1:10 перед использованием 50% глицерина: Урацил - пластины: Электропорация буфера: 500 мл глицерина В 250 мл колбу: 1 М сорбит 500 мл воды 2 г смеси аминокислота без урацила 1 мМ CaCl 2 автоклав 6,7 г дрожжевого азотистого основания без аминокислот Заполните дистиллированной водой 150 мл воды Автоклав и хранят при температуре 4 ° С В 2-литровую колбу: 20 г агара 750 мл воды Автоклав колбы отдельно, а затем смешать с 100 мл 20% раствора глюкозы Полный IMDM 5-FOA + пластины: LiOAc / DTT 500 мл Исков Модифицированная Дульбекко СМИ Автоклав в 2-литровую колбу: 0,1 М LiOAc 5 мл пенициллина стрептомицин глутамина 100x 20 г агара 10 мМ ДТТ 500 мкл 2-меркаптоэтанола 750 мл воды 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки Смешивание: 2,5 мл пирувата натрия 100 мМ 6,7 г дрожжевого азотистого основания без аминокислот 2 г смеси аминокислота без урацила 150 мл теплой водой Когда остынет, добавить: 0,05 г порошка урацил 1 г 5-FOA Перемешать и фильтр стерилизовать Добавить в автоклаве агар решения Смешайте 100 мл 20% глюкозы

Таблица 1. Реагенты Список. Описаны реагенты, необходимые для изготовления каждого из растворов, дрожжевые сред и пластин, и буферы преобразования, используемых для протоколов в этой рукописи.

Рисунок 1
Рисунок 1. колоний дрожжей, выращенных на YPD СМИ. Пример YPD пластина, показывающий жизнеспособной колониеобразующих единиц (КОЕ) на рrobiotic дрожжи после УФ-облучения. Клетки серийно разводили таким образом, что индивидуум КОЕ можно выделить и подсчитывали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

фигура 2
Рисунок 2. Выживание кривая диплоидной пробиотика дрожжей. Количество жизнеспособных S. boulardii КОЕ в виде процента от общего количества посеянных клеток наносили на график для каждой дозы мкДж УФ-облучения (сплошная линия). Вертикальная красная линия указывает мкДж УФ доза, соответствующая 50% выживания этого штамма дрожжей. RAD1 S.cerevisiae, мутант, который не может восстановить ущерб от УФ мутагенеза, показано в качестве контроля (пунктирная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре. </ А>

Рисунок 3
Рисунок 3. Подтверждение URA3 - фенотип УФ облучении клеток на YPD, урацил - и 5-FOA пластины Клетки от отдельных УФ мутантных колоний были собраны с помощью иглы стерильные зубочисткой и аккуратно пронесся YPD, урацил -., И 5 -FOA пластины. Клетки первого прожилками в двух перпендикулярных линий пересечения, то новый зубочистка была использована для передачи через вторую линию и продолжают распространять клетки до отдельных клеток не отделить. Истинный URA3 - мутант (Mut) растет на YPD среде и в присутствии 5-FOA, но не в отсутствие урацила. Контроль URA3 - С. CEREVISIAE (URA3 -) и URA3 + SUP> С. boulardii (URA3 +) показаны для сравнения и подтверждения надлежащего подготовку дрожжей СМИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 4
Рисунок 4. Трансформация Эффективность штаммов Saccharomyces. Дикого типа С. boulardii (Sb) и лаборатория С. CEREVISIAE штамм (Sc) были преобразованы с помощью описанного LiOAc (LiOAc) и электропорации протоколов (Electro). Результаты представлены как среднее КОЕ получены на мкг плазмиды, кодирующей устойчивости к канамицину маркер. Бары показать среднее дубликатов экспериментов с ошибками, изображающие стандартную ошибку среднего.ES / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 5
Рисунок 5. функционального белка выражение, трансформированных дрожжей. S. CEREVISIAE трансформировали пустой плазмидой (А) и плазмиды, кодирующей GFP (B) были проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа. Флуоресценции в клетках дрожжей, трансформированных GFP плазмиды указывает на успешное производство функциональной GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 6
Рисунок 6. Правильное обращение с C57BL / 6 мыши для перорального зонда. Мышь провела tightlу в не доминантной рукой с хвостом скрываются под мизинцем так, чтобы движение не возможно (А). Через желудочный зонд игла вставлена ​​в глотку вдоль крыше рот. Мыши разрешено проглотить лампочку такого зондового иглы, оставляя раствор затем введите желудок, как поршень находится в депрессии (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 7
Рисунок 7. Подготовка и вскрытие пейеровы бляшки. Тонкая кишка показана отсечен от других внутренних органов и тканей, с стрелки, указывающие на несколько пейеровы бляшки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное VERSIна этой фигуре.

Рисунок 8
Рисунок 8. Дрожжи Восстановление после пейеровых бляшках. Примером жизнеспособного КОЕ обнаруженного после вскрытия, гомогенизации и обшивки клеток патч общая бляшках от мыши через желудочный зонд с S. boulardii. Клетки высевали на YPD дрожжевых средах и инкубировали при 30 ° С в течение 2 дней. Типичный выход КОЕ извлеченного на мышь меньше 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Вместе протоколы в данном документе описываются основные шаги, необходимые для разработки и тестирования ауксотрофных пробиотических штаммов дрожжей для доставки гетерологичной терапевтического белка в кишечнике. Эта манипуляция и тестирование рекомбинантного пробиотика дрожжей требует методов и ресурсов, с которыми любой человек лаборатория не может себе быть знакомы. Таким образом, хотя многочисленные предыдущие исследования описывали выше протоколы для нескольких дрожжевых и мыши штаммов, эти методы имеют не известно авторам были представлены в подробном унифицированной форме. Кроме того, настоящее рукопись особое внимание уделяется адаптации текущие стандартизированные протоколы для генетической манипуляции пробиотика дрожжей, которые не так хорошо характеризуется чем обычно используемых штаммов лабораторных дрожжей. Многие шаги для обоих мутагенеза (обсуждаемые в части 1) и преобразования (часть 2) должны быть оптимизированы для манипуляции такого диплоидных, пробиотик дрожжи ISOLATES. Эта рукопись также обсуждает потенциальные проблемы, связанные с обработкой животного (часть 3) и рассечения накладными иммунных тканей Пейера тонкой кишки (часть 4).

Как и многие промышленные и клинически значимых штаммов дрожжей не сразу адаптируется к крупномасштабной генетической манипуляции, в первую очередь необходимо для создания штаммов, таких как ауксотрофных мутантов, которые могут быть выращены и выбранных без дорогостоящих антибиотиков. УФ мутагенеза является одним из таких подходов, который позволяет для быстрого неспецифической мутации ауксотрофных генов 7,41. Кривые выживаемости может быть легко генерируется (фиг.1 и 2), чтобы определить соответствующую дозу для скрининга мутантов. Тем не менее, этот подход несет в себе риск индукции от целевых мутации, которые могут повлиять на рост ставки или другие свойства штамма дрожжей. Целевые нокауты могут вместо быть получены с использованием ПЦР строит или система / cas9 CRISPR. Последующее обследование или выбор(Рисунок 3) мутантов позволяет идентифицировать ауксотрофной дрожжей. Использование отбора путем посева на 5-FOA сред, например, дает возможность быстрого устранения любой дрожжей еще содержащего функциональную URA3 ауксотрофного ген. Когда это возможно, этот выбор подход может быть предпочтительным, чтобы экран, который требует анализа всех колоний, полученных. При любом выборе или скрининга, однако, это имеет решающее значение для выполнения повторяющуюся полос индивидуальных колоний дрожжей на селективных средах, чтобы подтвердить статус ауксотрофного.

Преобразование из сгенерированных мутантов может быть достигнуто с помощью различных протоколов. Хотя LiOAc преобразование является эффективным в преобразовании многих штаммов дрожжей, в частности, для наиболее часто используемых лабораторных S. штаммы CEREVISIAE, альтернативные протоколы, такие как электропорации могут трансформироваться друга дрожжи изолирует с большей эффективностью (рисунок 4). Каждый новый штамм должен быть проверен USIнг несколько протоколов для определения оптимальных условий для трансформации. Варьируя время инкубации и концентрации ДНК, например, может влиять общую эффективность трансформации и должны быть проверены и оптимизированы для каждого штамма 33.

Желудочный зонд позволяет для доставки контролируемых дозах эти рекомбинантные дрожжи непосредственно к мышиным желудочно-кишечного тракта, чья иммунная ткани может быть затем анализировали на дрожжах и гетерологичного белка. Правильное оральная методика через желудочный зонд (фиг.6) имеет решающее значение, чтобы минимизировать животных дискомфорт и увеличить точности эксперимента. Кроме того, пейеровы бляшки являются ключевыми сайты по оценке потребления рекомбинантного дрожжей из кишечника. Эти кластеры иммунной ткани являются важными сайты антигена проб и индукции иммунных ответов слизистых. Большие антигены, в том числе дрожжи 3-6 мкм в диаметре, скорее всего, будет рассмотрен клеток м пейеровы бляшки, чтобы пересечь ГАstrointestinal эпителий и взаимодействовать с иммунными клетками. Необходимо соблюдать осторожность при вскрытии пейеровы бляшки, чтобы только клетки изнутри патч, а не в просвет кишечника или собственная пластинка собраны (Рисунок 7). Дальнейшие шаги должны быть также приняты следующие рассечения оценки надлежащего выражения и функцию чужеродного протеина в восстановленном дрожжей (рисунок 8). Получение общего белка от дрожжевых лизатов и иммуноблоттинга один стандартный метод оценки экспрессии белка; Однако, этот подход не дает информации о сворачивании белка и функции. Для оценки функции белка, дрожжи могут быть трансформированы плазмидой, кодирующей GFP и анализировали под флуоресцентным микроскопом после восстановления от пейеровых бляшек на оценку функциональной экспрессии GFP (рисунок 5).

В общем, эта рукопись представляет единый комплекс детальных экспериментальных протоколов, охватывающих этапы сюдам генерацию ауксотрофных мутантов с восстановлением пробиотика дрожжей из мышиного кишечника. Составитель протоколов, которые традиционно не подпадают одной области знаний, эти описания будут способствовать дальнейшие исследования тестирования иммунологических ответов на пробиотика дрожжей разработан как устные векторов доставки лекарств. Авторы надеются, что это исследование будет способствовать обсуждению и способствовать оптимизации экспериментальных методов для каждого штамма дрожжей испытанной, что открывает путь для наиболее эффективных подходов к разработке новых, пробиотик на основе рекомбинантных терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают финансирование через Детского Центра иммунологии и вакцинам и NIH Нью Новатор премии (1DP2AI112242-01) присуждена Трейси Дж Агнца. Авторы также благодарят Наталью П. Дегтярева за щедрое вклада Rad1 S. CEREVISIAE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73, (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9, (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41, (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32, (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5, (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23, (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153, (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1, (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30, (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8, (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49, (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34, (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38, (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197, (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118, (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14, (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67, (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13, (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1, (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71, (1), 312-319 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics