Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Immunology and Infection

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Summary

Se presenta aquí una descripción unificada de las técnicas que se pueden utilizar para desarrollar, transformar, administrar y poner a prueba la expresión de proteínas heterólogas de la levadura probiótica Saccharomyces boulardii.

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Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

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Abstract

Introduction

Los microorganismos probióticos son un medio potenciales interesantes de la entrega de manera eficiente y económica proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal. Estos organismos son capaces de sobrevivir el paso a través del tracto gastrointestinal sin embargo no colonizarlo 1, lo que permite la dosificación controlada y limitar la exposición a la droga expresó. Además, la capacidad de diseñar fácilmente estos organismos para producir la proteína heteróloga a gran escala las hace una alternativa económica a las partículas de entrega sintéticos. Sin embargo, el desarrollo de un enfoque de este tipo, como se ha demostrado recientemente el uso de una cepa auxotrófica de la levadura Saccharomyces probióticas boulardii 2, requiere el conocimiento de las técnicas de laboratorio sin combinar tradicionalmente en un estudio dado, que van desde la levadura y la biología molecular de las técnicas de manipulación de los animales y métodos inmunológicos. Así, aunque los procedimientos individuales descritos en este documento no son en sí mismos novelaprotocolos de laboratorio, el objetivo de este manuscrito es presentar una introducción a las técnicas unificada necesarios para las pruebas experimentales de la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos en el tracto gastrointestinal murino. Proporcionada es una compilación de los protocolos esenciales para: 1) la generación de cepas mutantes auxotróficos de levadura que pueden ser fácilmente manipulados genéticamente; 2) la transformación de cultivos de levaduras para expresar la proteína heteróloga; 3) la administración de levadura recombinante al intestino a través de una sonda nasogástrica; y 4) la recuperación de la levadura recombinante probiótico viable desde el intestino murino y evaluación de su expresión de la proteína heteróloga.

En primer lugar, si bien existen numerosos métodos de selección positivos y negativos para la manipulación de especies de levadura, selección negativa tal como mediante el uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto la eficiencia y la facilidad con la que la levadura puede ser transformada y seleccionado. La selección positiva de los transformantes usando antibióticos, en contrast, aumenta significativamente el coste de la manipulación de la levadura. Por otra parte, la selección de la levadura en medio sólido que contiene los antibióticos puede permitir un mayor crecimiento de las colonias transformadas fondo relativos a la selección de la levadura auxotrófico en caída sintética a cabo los medios sólidos (observaciones no publicadas). levadura auxotrófico es cepas que carecen de enzimas críticas para la síntesis de los aminoácidos esenciales o uracilo. Tal levadura puede crecer solamente si se complementa con el metabolito falta o genes metabólicos, lo que permite que la selección negativa cuando la levadura se cultivó en placas sobre gota sintética a cabo los medios de comunicación que carece del metabolito esencial. Muchos Saccharomyces comúnmente usados ​​son cepas de laboratorio cerevisiae, de hecho, ya mutantes auxotróficos 3. Industrial, clínica, y las cepas de levadura probióticas, sin embargo, son típicamente prototrophic con la capacidad de sintetizar todos los nutrientes requeridos. Para permitir la manipulación genética más eficiente de tal levadura, genes auxotróficos pueden ser dirigidos selectivamentepara generar cepas que se pueden seleccionar sin antibióticos. La orientación específica de los genes marcadores auxotróficos se puede lograr a través de la interrupción de genes mediada por PCR basándose en la recombinación homóloga o más recientemente a través de CRISPR / Cas9 orientación 4-6. Como alternativa, la mutagénesis UV puede generar rápidamente los mutantes auxotróficos incluso en cepas de levadura para las que la transformación con múltiples plásmidos es técnicamente difícil 7. Si bien la orientación CRISPR PCR y / Cas9 han sido ampliamente descritos en otras partes, presentado en la primera parte de este manuscrito es un protocolo detallado que describe un enfoque de mutagénesis UV para crear cepas auxotróficas que permitan la selección negativa en lugar de los antibióticos de selección positiva de los transformantes de levadura.

El siguiente paso necesario en el uso de tales cepas auxotróficas para la administración oral de la proteína heteróloga es la transformación de levadura con ADN de plásmido. Desde la primera transformación con éxito de síest esferoplastos reportados para Saccharomyces cerevisiae en 1978 8, numerosas modificaciones se han caracterizado para aumentar la eficiencia y la facilidad con la que las especies de levadura se pueden modificar genéticamente. El uso de electroporación para la transformación exitosa de ADN en S. cerevisiae fue descrita por primera vez en 1985 9 y desde entonces ha sido mejorada mediante la adición de incubación de 1 M de sorbitol al 10 osmóticamente células de apoyo. Eficiencia electroporación Además, se ha demostrado que dependen de la especie de levadura y cepa, el número de células y la fase de crecimiento, el volumen de la electroporación, la intensidad de campo, y tampones específicos 11. La transformación de litio de etilo (LiOAc), originalmente descrita por Ito et al. 12, es uno de los protocolos de transformación más comúnmente utilizados, ya que no requiere ningún equipo especial. Análisis adicionales mostraron que la eficiencia de transformación de levadura LiOAc aumenta en gran medida cuando las células se recogen en fase semilogarítmicade crecimiento y se sorprendió de calor en presencia de polietilenglicol (PEG) y el ADN a 42 ° C 12. La incubación de la levadura intacta entera con PEG es esencial para la transformación eficiente, posiblemente a través de la mejora de la unión de ADN a la membrana celular, así como a través de otros efectos sobre la membrana 13. Sí litio también aumenta la permeabilidad de las células intactas 14. Aunque la mayor parte de laboratorio S. cepas cerevisiae pueden ser fácilmente transformado mediante LiOAc transformación 3, otras especies de levaduras pueden ser transformadas de manera más eficiente a través de protocolos alternativos. Pichia pastoris, por ejemplo, es más eficiente transformado a través de la electroporación en lugar de transformación LiOAc 13. Es crucial, por lo tanto, para probar múltiples métodos de transformación y para optimizar los periodos de incubación y las concentraciones de reactivos cuando se trata de modificar genéticamente una cepa de levadura sin caracterizar. Por tanto, este manuscrito describe tanto LiOAc transformation y electroporación como técnicas para la transformación del mutante auxotrófico y de tipo salvaje S. boulardii. Los lectores interesados ​​pueden dirigirse a las recientes revisiones para descripciones exhaustivas de la evolución de la transformación de levadura, protocolos alternativos, y más discusiones de posibles mecanismos de acción 13,15. Transformación de levadura con el plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable es, además, esencial para las pruebas de aguas abajo con el fin de asegurar la expresión y función de la proteína heteróloga adecuada. proteínas Myriad diferentes pueden seleccionarse en función del objetivo final del estudio terapéutico y los anticuerpos disponibles para la detección de proteínas por inmunotransferencia, ELISA, y otras técnicas. Los protocolos para estas técnicas se han descrito a fondo en otra parte 16,17, y se pueden utilizar para determinar los niveles de producción de proteínas heterólogas a partir de levadura transformada por comparación con las curvas de calibración. Para los propósitos de demostración y para mostrarproducción exitosa de una proteína muy utilizado comúnmente en la biología de la levadura, este manuscrito presenta transformación con plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), que permite la posterior detección mediante microscopía de fluorescencia.

Igualmente importante para la producción de organismos probióticos que expresan la proteína heteróloga es la adecuada administración y detección de estos microorganismos dentro de los tejidos gastrointestinales, como se describe en partes tres y cuatro. La administración de levadura recombinante a través de una sonda oral permite la entrega de cantidades controladas de levadura directamente en el estómago, de la que C57BL / 6 ratones son naturalmente incapaz de vómitos 18. Sin embargo, el manejo de animales inadecuada y alimentación forzada puede conducir a daño esofágico y perforación, perforación gástrica, administración traqueal, y neumonía por aspiración 19,20. Una técnica deficiente y la falta de experiencia, además, pueden aumentar la variabilidad en la respuesta inmune murina experimental y results, que han sido atribuidos a estrés de los animales sobre una sonda oral 21,22. La práctica en la técnica apropiada de este modo no sólo puede atenuar las molestias animal, pero también puede aumentar la precisión de los resultados experimentales. Este manuscrito describe y demuestra la manipulación de animales y una sonda nasogástrica para la administración de dosis controladas de levadura recombinante.

Por último, es vital para confirmar la entrega exitosa de levadura recombinante mediante el análisis de tejidos linfoides para la presencia de la levadura y la proteína heteróloga. Los tejidos inmunes gastrointestinales que pueden más fácilmente y de manera previsible ser examinados para la presencia de la levadura son las placas de Peyer. Placas de Peyer son órganos linfoides secundarios a lo largo del intestino delgado que son sitios clave de la mucosa inducción respuesta inmune 23. Antígenos de los lumen se transfieren transcelular a través de micropliegues células (M) en el epitelio y se liberan en las placas de Peyer, exponiendo así encerrard antígeno de células presentadoras de contenido luminal intestinal. Aunque la absorción de partículas a través del epitelio intestinal también se puede lograr por las células caliciformes, estas células se ha demostrado que sólo ocupan partículas de menos de 0,02 m de diámetro 24. Dendritas transepiteliales extendieron a partir de células dendríticas CD103 + (DC) también ocupan pequeñas partículas desde el lumen intestinal 25; Sin embargo, actualmente no existen informes que demuestran que CD103 + DC ocupan las partículas más grandes que las bacterias. Por lo tanto, la levadura probiótica intacto, de tamaño medio de entre 3 a 6 m de diámetro, son más propensos a ser absorbidos por las células M y se transfirió a las placas de Peyer. Descrito aquí es un protocolo de recogida y selección de las placas de Peyer para levadura recombinante viable, aunque este procedimiento también se puede adaptar fácilmente para la evaluación de la absorción de bacterias probióticas.

En resumen, la evaluación de la levadura recombinante probiótico para la entrega de larapeutic proteínas en el intestino requiere el dominio de las técnicas de laboratorio que abarcan la biología molecular para el manejo de animales e inmunología. Aquí se presentan son los protocolos para 1) la generación y selección de cepas de levadura auxotróficos que puede ser fácilmente seleccionado negativamente sin antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar la levadura y permiten la expresión de la proteína heteróloga, 3) demostraciones de técnicas de manejo de animales adecuados y sonda oral durante intragástrico la entrega de la levadura recombinante, y 4) protocolos para la disección de las placas de Peyer y la detección de levadura recombinante viable y funcional proteína heteróloga. Combinados, estos protocolos permitirán la generación y prueba de una cepa de levadura probiótico capaz de entregar proteína terapéutica heterólogo en el tracto gastrointestinal.

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Protocol

1. Mutagénesis UV para generar cepas de levadura auxotroficos

  1. Generar curvas de supervivencia para determinar las dosis necesarias de la irradiación UV
    1. Preparar YPD (extracto de levadura de peptona dextrosa) medios de comunicación y otros reactivos enumerados en la Tabla 1 de acuerdo con procedimientos estándar 26 e inocular colonias individuales en 5 a 10 ml de medio YPD. Incubar culturas en un tambor de rodillo a 30 ° CO / N a la saturación por lo menos durante 8 hr.
    2. Determinar la concentración de células de cultivos O / N utilizando un espectrofotómetro mediante la dilución de las células de 01:10 en agua en una cubeta de plástico. Diluir las células hasta una concentración de 10 7 células / ml en 20 ml de agua destilada estéril.
    3. Verter células diluidas en una placa de Petri de plástico estéril y, con la tapa quitada, coloque la placa de 14 cm por debajo de una lámpara de UV.
    4. Exponer las células a 5.000 mu J serie y 10.000 dosis de irradiación UV mu J, extrayendo 500 l de células después de cada incremento de tal manera que las célulasse muestrean después de la exposición a 0 mu J, 5.000 mu J, 10.000 mu J, 15.000 mu J, 20.000 mu J, 25.000 mu J, 30.000 mu J, 40.000 mu J y 50.000 mu J de la irradiación UV. muestras de células de transferencia estéril extraído para tubos de 1,5 ml y se diluyen en serie a las 1:10 incrementos en agua estéril.
    5. Precipitar las células en cada dilución por centrifugación en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en un volumen de 100 l de agua estéril apropiada para el recubrimiento de las células de levadura. Pipetear el volumen completo de células resuspendidas sobre placas que contienen medio sólido YPD y utilizar un esparcidor estéril para distribuir uniformemente las células a través de cada placa.
    6. Envolver bordes de la placa en Parafilm para evitar la desecación de los medios de comunicación y las placas de cubierta en papel de aluminio para evitar la foto-reactivación y la reparación de las mutaciones inducidas por UV. Incubar las placas al revés a 30 ° C durante 2-4 días para permitir el crecimiento de colonias de levadura viables (Figura 1).
    7. Contar el number de colonias, opcionalmente con la ayuda de un bolígrafo para marcar de colonias contadas, una pluma contador electrónico de mano, o un contador de pie con la ampliación. Parcela como un porcentaje del total de células chapados en cada dosis mu J de la irradiación UV para generar una curva de supervivencia para la levadura irradiado (Figura 2).
      NOTA: haploide cepas de levadura se puede esperar que requieren dosis más bajas de UV irradiación con relación a las cepas diploides para alcanzar el mismo porcentaje de supervivencia. Una cepa de levadura que carece de las enzimas de reparación del ADN funcionales, tales como la rad1 S. cerevisiae mutante, se puede utilizar como un control positivo para indicar la presencia de la irradiación UV a dosis muy bajas.
    8. Determinar la dosis de mutagénesis UV que se utiliza para la detección por referencia a la curva de supervivencia establecida en 1.1.7. El valor x del punto a lo largo de la curva de supervivencia en la que y es igual a 50 es la dosis de irradiación UV a la que 50% de levadura de sobrevivir. La detección de mutantes en esta baja supervivencia por ciento puede resultar en unamayor rendimiento de cepas mutadas con éxito, en particular para la levadura diploide. La dosis de supervivencia de 50% para WT S. boulardii, como se muestra en la Figura 2, es de aproximadamente 18.000 mu J.
      NOTA: A pesar de que tales dosis de rayos UV puede aumentar el riesgo de mutaciones en los genes de las vías celulares distintos del gen marcador auxotrófico de interés, este inconveniente debe ser equilibrada con la necesidad de inducir mutaciones en ambas copias del gen marcador auxotrófico. Para las cepas haploides en la que debe mutarse solamente una copia del gen, la detección en un porcentaje de supervivencia más alta, tal como al 90%, disminuye el riesgo de mutaciones adicionales y todavía permite la generación suficiente de mutantes auxotróficos.
  2. mutagénesis UV y la detección de cepas de levadura auxotróficos
    1. Preparar la levadura como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.3.
    2. Exponer a la levadura a la dosis de irradiación UV correspondiente a la supervivencia del 50%, como se determina en 1.1.8. Para WT S. boulardii, esta dosis was se determinó que aproximadamente 18.000 mu J (Figura 2).
    3. Recoger volúmenes de 1 ml de UV irradiados levadura y pellet por centrifugación en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 1 min. células sobrenadante y resuspender aspirado en 100 l de agua estéril.
      1. La selección de mutantes
        1. Si se utiliza la selección tal como con ura3 - mutantes auxotróficos, la placa se irradió la levadura en medios que contiene ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) para seleccionar las células que carecen de una enzima funcional URA3.
          NOTA: Cualquier levadura que contiene copias funcionales de Ura3 convertirá 5-FOA a la toxina 5-fluorouracilo, lo que lleva a la muerte celular y que permite una fácil selección de ura3 - colonias que carecen de un funcional URA3 27. Análogos criterios de selección son posibles para los LYS2 y LYS5; marcadores y MET2 y MET15 utilizando medios que contienen ácido α-aminoadıpico 28; TRP1; 5-fluoroácido antranílico 29; y 30,31 metil mercurio, respectivamente.
        2. Pipetear los 100 l de células resuspendidas en medio mínimo que contenían 5-FOA y utilizar un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa. Envolver las placas en Parafilm y se incuba boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días para permitir el crecimiento de las colonias de levaduras viables.
        3. Para confirmar el ura3 - fenotipo de cualquier colonia que aparece en 5-FOA placas por restreaking en YPD, uracilo - y las placas 5-FOA (Figura 3). Use la punta de un palillo estéril para recoger parte de una sola colonia y arrastrar suavemente las células a través de YPD fresco, uracilo -, y las placas 5-FOA. Una vez más incubar las placas envueltas boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días.
          NOTA: aparecerá colonias viables, como se plantea, unos crecimientos circulares mientras que las células no viables aparecerán sólo como un frotis opaca sin ningún tipo de crecimientos elevados (Figura 3).
      2. screening de mutantes
        1. Si la generación de un mutante auxotrófico para los que los métodos de selección no están disponibles, se preparan diluciones seriadas 1:10 de UV irradiaron células de levadura en agua estéril y una pipeta de las diluciones a un medio YPD, usando un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa.
        2. Envolver las placas en Parafilm y se incuba boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días. Determinar lo que permitió el crecimiento de las colonias individuales que se puedan distinguir fácilmente entre sí, por lo general no más de aproximadamente 100 colonias por placa de dilución.
        3. mutagénesis UV de repetición de las muestras de levadura como se describe en 1.2.1-1.2.3 y la placa de células en este determinado dilución. Pipetear la levadura diluido en medios YPD, utilizar un esparcidor estéril para distribuir las células, y se incuban las placas envueltas al revés a 30 ° C durante 2-4 días.
        4. Pantalla para auxótrofos mediante siembra de réplica en medios selectivos que carecen del metabolito de interés. En primer lugar, asegurar un cojín de terciopelo estéril sobre una placa de soportee invertir la placa con colonias irradiados con UV en el terciopelo, que marca la orientación de la placa.
        5. A continuación, invertir un plato fresco que carece del metabolito de interés sobre el terciopelo y presione ligeramente para transferir células de la terciopelo a la placa. Guarde la placa original a 4 ° C. Envolver e incubar la nueva plancha boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días.
        6. Como alternativa al cultivo en placas replicadas, los mutantes de pantalla por colonias re-formación de vetas de YPD en medios selectivos. Utilice la punta de un palillo de dientes estéril para recoger parte de una sola colonia y suavemente arrastrar las células a través de una placa de YPD fresco y una placa que carece del metabolito de interés. Una vez más incubar las placas envueltas boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días.
          NOTA: Se debe tener cuidado para seleccionar colonias individuales y consecutivas a cabo colonias múltiples veces para confirmar una población homogénea de células auxotróficas verdaderos.
    4. confirmar aún más el fenotipo de las células irradiadas por inoculadosing colonias individuales en 5 a 10 ml de YPD y tanto los medios que carecen de la metabolito apropiado (por ejemplo, en uracilo - medios de comunicación para una ura3 - mutante). Incubar en un tambor de rodillo a 30 ° CO / N para confirmar el crecimiento de las células en medios YPD pero no en la ausencia del metabolito.
      NOTA: A pesar de que los patrones de crecimiento en medios sólidos deben indicar claramente el estado de levadura auxotrófico, es posible que algunos de levadura para tolerar el estrés y la forma, colonias pequeñas de crecimiento lento en medios sólidos, pero aún no tolera las mismas condiciones en medios líquidos (observaciones no publicadas). Inoculación en cultivos líquidos por lo tanto se debe realizar para confirmar a fondo los patrones de crecimiento de los mutantes UV irradiada.
    5. Para el almacenamiento a largo plazo de los mutantes auxotróficos confirmados, preparar las células madre de glicerol por inoculación en 10 ml de YPD y se incubaron en un tambor de rodillos O / N a 30 ° C. Precipitar las células por centrifugación durante 3 min a 2.500 xg y medios de aspirado. Resuspender las células en un 50%glicerol, filtrada y estéril, transferir a un criovial, y se almacena a -80 ° C.
      NOTA: levaduras mutagenizado UV contiene potencialmente mutaciones en múltiples genes distintos en el marcador auxotrófico de interés. Antes de continuar con el uso de mutantes auxotróficos verificadas, estas cepas deben ser analizados a través de la secuenciación de genes y la evaluación de la resistencia a pH, las tensiones de ácidos biliares, y otras características relevantes de cepas probióticas, como se describe en otro lugar 2. Además, el uso de homología PCR o CRISPR / Cas9 la orientación de mutar de forma más selectiva marcadores auxotróficos deben ser considerados como una alternativa a la mutagénesis UV 4 - 6.

2. Transformación de la levadura

  1. LiOAc Transformación de levadura
    1. Se inoculan colonias de levadura individuales en 5-10 ml de medio YPD y se incuba en un tambor de rodillos a 30 ° CO / N.
    2. Para inducir la fase logarítmica de crecimiento y aumentar la eficiencia de la captación de plásmido, deconcentración celular Termine utilizando un espectrofotómetro para medir una dilución 1:10 de las células en agua estéril en una cubeta de plástico. Diluir O / N culturas a un OD 600 de 0,16 a 0,2 (aproximadamente 2 x 10 6 - 2,5 x 10 6 células / ml) en 50 ml de YPD caliente fresco y se incuban las células en un agitador de plataforma orbital ajustado a 200 rpm hasta que el cultivo llega a aproximadamente 1 x 10 7 células / ml, generalmente alrededor de 4 horas.
      NOTA: Eficacia de la transformación se puede medir como una función del número de unidades formadoras de colonias de levadura transformadas con éxito (UFC) por g de ADN plásmido. El aumento de la eficiencia en las colonias más transformadas por g de ADN plásmido. Subcultivo de células de levadura y recogida durante la fase logarítmica de crecimiento es un factor que aumenta la eficiencia de transformación 12.
    3. Precipitar las células por centrifugación a 2500 xg durante 3 min.
    4. Aspirar las células sobrenadante y transferir a un tubo de 1.5 ml por resuspensión del pelly en 1 ml de agua estéril.
    5. Precipitar las células por centrifugación a 16.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga, aspirar el sobrenadante y se lavan las células mediante resuspensión en 1 ml de TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) buffer.
    6. Repita células de centrifugación y resuspender en tampón TE / LiOAc a una concentración de 2 x 10 9 células / ml.
    7. Preparar las mezclas de transformación con cada uno de los siguientes: 50 l de levadura preparado en tampón TE / LiOAc, 5 l de ADN portador (10 g / l), y 1 l de ADN plásmido (1 mg). Microgramos de plásmido de ADN puede ser titulada como el aumento de cantidades de ADN pueden o no pueden conducir a una mayor eficiencia de transformación 32
      NOTA: Para obtener una cepa de levadura mutante que carece de un marcador auxótrofo, un solo plásmido que codifica el marcador puede ser transformado por muestra. Además, el uso de un plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable, tal como GFP, permitirá la determinación eficiente de plegado y la expresión de PR heteróloga adecuadaOtein por la cepa de levadura después de la transformación.
    8. Para cada preparación, añadir 300 l de PEG / LiOAc / TE y mezclar bien. La incubación de células intactas con PEG es esencial para la transformación eficiente 13.
    9. Incubar los preparativos a 30 ° C durante 30 minutos con agitación mediante la colocación de tubos de microcentrífuga en un vaso de precipitados se coloca sobre un agitador de plataforma orbital a 200 rpm.
    10. Añadir 35 l de DMSO a cada célula de reacción y de choque térmico durante 15 minutos en un baño de agua 42 ° C. Aunque hay informes contradictorios de la ventaja añadida de DMSO 33, de choque térmico de células de levadura intactas se ha demostrado que aumenta en gran medida la eficiencia de transformación 12.
    11. Lavar las células mediante sedimentación a través de centrifugación como en 2.1.5, aspiración o pipeteado el sobrenadante, y resuspender en 1 ml de agua estéril. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper el sedimento celular.
      NOTA: Es fundamental para eliminar completamente el sobrenadante debido a que el uso de los mediosd en la generación de células competentes puede inhibir el crecimiento de la levadura y la formación de colonias.
    12. Repita la granulación celular como en 2.1.5, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de agua estéril. Pipetear el volumen completo sobre una placa selectiva y utilizar un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa con levadura transformada.
    13. Envolver bordes de las placas revestidas en Parafilm para evitar el secado de los medios de comunicación e incubar al revés a 30 ° C durante 2 días para permitir el crecimiento de células de levadura transformadas. El éxito, la transformación eficiente y selección auxotrófico de Saccharomyces cerevisiae produce un alto número de colonias por preparación transformación, aunque el rendimiento puede ser mucho menor para otras cepas (Figura 4).
    14. placas de levadura tienda para el corto plazo (generalmente 1-3 semanas) en posición invertida y cubierta a 4 ° C. Preparar las existencias de glicerol de levadura transformada como se describe en 1.2.5 para el almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Nuevos estudios de pruebas transformado CFT son necesarios para determinar la estabilidad del plásmido y evaluar la expresión apropiada de la proteína heteróloga. Descripciones exhaustivas de la estabilidad del plásmido 34, el uso de inmunotransferencia para la detección de proteínas desnaturalizadas recuperados de muestras de células 17, enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar correctamente plegada tres proteínas dimensionales 16, y el uso de GFP en los estudios de levadura 35 están disponibles en otros lugares. Figura la figura 6 muestra una imagen representativa de la expresión de GFP éxito en S. transformado cerevisiae relación con las células no transformadas. El uso de una proteína tal fluorescente es un medio para determinar de manera eficiente la producción de proteína heteróloga éxito.
  2. Electroporación de levadura
    1. Se inoculan colonias de levadura individuales en 5-10 ml de medio YPD y se incuba en un tambor de rodillos a 30 ° CO / N.
    2. Determinar la concentración de células utilizando un espectrofotómetro para medir una dilución 1:10 de las células en agua estéril. dilaúd O / N en cultivos de 100 ml calientes frescos de los medios YPD a un OD 600 equivalente a aproximadamente 0,3. Incubar las subculturas a 30 ° C en un juego de plataforma de agitación a 200 rpm hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 1,6, por lo general 4-5 hr. Cada subcultura 100 ml generará suficientes células condicionadas por dos reacciones de transformación.
    3. Precipitar las células por centrifugación a 2500 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y lavar las células mediante resuspensión en 50 ml de hielo agua estéril fría. Repetir el lavado sedimentando las células, aspirando el sobrenadante y resuspender en 50 ml de hielo fresca agua estéril fría.
    4. Sedimentar las células de nuevo y volver a suspender en 50 ml de hielo frío tampón de electroporación (1 M sorbitol, 1 mM CaCl 2).
    5. Repita el giro como en 2.2.3, se aspira el sobrenadante y volver a suspender las células en 20 ml de H LiOAc / 10 mM de DTT 0,1. Incubar suspensión de células en un tambor de rodillo a 30 ° C durante 30 min. La preincubación de las células en LiOAc y DTT aumenta sinérgicamente laeficiencia de la electroporación 36.
    6. Sedimentar las células como en el punto 2.2.3, eliminar el sobrenadante y lavar por resuspensión en 50 ml de hielo frío tampón de electroporación. Repita células de centrifugación y resuspender en tampón de electroporación de hielo frío a un volumen final de 1 ml.
    7. Preparar en el hielo: acondicionado, células de levadura, cubetas de electroporación estériles, y el ADN plásmido. Inmediatamente después de la resuspensión final de células acondicionado en tampón de electroporación de 1 ml, se combinan 400 l de células de levadura acondicionado con aproximadamente 1 g de ADN plásmido y añadir a un hielo frío de 0,2 micras electroporación cubeta. El uso de mayores cantidades de DNA puede aumentar ligeramente la eficiencia de transformación 11. Incubar la reacción en hielo durante 5 minutos, después se electroporate con el conjunto electroporador a 2,5 kV y 25 mF.
      NOTA: Como se describe en 2.1.7, una cepa de levadura mutante que carece de un marcador auxotrófico puede ser transformada con un único plásmido que codifica el marcador mutado por muestra. Además, el usoun plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable tal como GFP permite la determinación eficiente de plegado y la expresión de proteína heteróloga después de la transformación apropiada.
    8. Transferencia de las células a electroporación en 8 ml de una mezcla 1: 1 de YPD: 1 M sorbitol y permitir que las células se incuban en un tambor de rodillo a 30 ° C durante 60 min.
    9. Precipitar las células como en los puntos 2.2.3 y resuspender en 100 l 1: 1: 1 YPD M sorbitol. Placa de todo el volumen en medios selectivos que contienen 1 M sorbitol, envolver bordes de las placas en Parafilm, y se incuban las placas al revés a 30 ° C durante 2-5 días para permitir el crecimiento de células de levadura transformadas.
      NOTA: Es muy importante levadura transformada prueba para evaluar la expresión adecuada de proteína heteróloga, tal como se describe en 2.1.14 y 2.2.7.

3. sonda oral de ratones con levadura transformada

  1. Realizar todos los procedimientos de cuidado de los animales y de manipulación de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Laboratorio Unimals y Animal Care institucional y la aprobación del Comité de Uso.
  2. Preparar cultivos O / N de la levadura mediante la inoculación de colonias individuales de levadura auxótrofo transformado en 5-10 ml de medio selectivo. Incubar cultivos O / N para al menos 8 horas en un tambor de rodillo a 30 ° C hasta que se satura.
    NOTA: El uso de proteínas de prueba plásmido que codifica tales como GFP permitirá la facilidad de las pruebas de la expresión de proteínas en la levadura alimentado a la fuerza, como se describe en 4.7.
  3. Para la inducción máxima de la expresión de proteínas y para inducir el crecimiento de fase log, preparar subcultivos de la O / N cultivos por dilución a un OD 600 de aproximadamente 0,16 a 0,2 equivalentes en 50 ml de medio de comunicación adecuado como se describe en 2.1.2.
  4. Determinar la concentración de las células subcultivadas como en 1.1.2 y ajustar a 10 9 células / ml. Preparar una dosis de 100 l para cada ratón, con unos pocos cientos volumen l extra por grupo para mejorar la precisión y la facilidad de carga de la muestra.
  5. Precipitar las células por centrifugación a 2.500 xg durante3 min o en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células mediante la adición de un volumen igual de agua estéril y suavemente pipeteando arriba y abajo.
  6. Fijar una aguja de calibre por sonda adecuada (22 G para los ratones 15-20 g) en una jeringa y la levadura de carga muestra de 1 ml estéril, asegurándose de eliminar las burbujas y establecer émbolo a un incremento de 100 l. Cargar una jeringa adicional con agua estéril para los ratones de control de alimentación por sonda y verificar la presencia de cualquier contaminante de levadura.
  7. Recoger el ratón para ser alimentado a la fuerza con la mano no dominante, con el dedo índice y el pulgar firmemente agarrando la piel alrededor del cuello (Figura 6A). Meter la cola bajo el dedo pequeño para evitar el movimiento de la parte inferior del cuerpo. Asegúrese de que el agarre es seguro y prohíbe el ratón se mueva la cabeza con el fin de evitar daños en los tejidos internos durante la alimentación por sonda.
    NOTA: estimar hasta qué punto se debe insertar la aguja de sonda mediante la celebración de la aguja contra el ratón de tal manera quela bombilla es incluso con el apéndice xifoides del esternón. Inserción de esta longitud de la aguja típicamente permitirá que el bulbo aguja de sonda entre en el estómago.
  8. El uso de la mano dominante, introduzca suavemente la aguja de sonda en el esófago del ratón inclinando la aguja a lo largo del techo de la boca y de la garganta, manteniendo ligeramente a la izquierda del centro. Espere a que el ratón para tragar la bombilla de la aguja y permita que la aguja desciende un poco más hasta el punto estimado en 3,7 (Figura 6B). Si cualquier siente resistencia durante la inserción de la aguja de sonda o si el ratón en cualquier momento empieza a jadear, eliminar suavemente la aguja y de nuevo tratar de encontrar el esófago.
  9. Después de que el ratón se ha tragado el bulbo de la aguja de sonda, presione suavemente el émbolo de la jeringa para administrar 100 l (10 8 CFU) de levadura directamente en el estómago de ratón.
    NOTA: Aunque los ratones son incapaces de vomitar cualquiera de la solución alimentado a la fuerza después de la administración 18,19 21,37. La inserción adecuada de la aguja de sonda, así como el ajuste del volumen y la viscosidad de la solución, puede ayudar a limitar el reflujo y asegurar una dosificación precisa.
  10. Retire cuidadosamente la aguja de sonda en el estómago y el esófago del ratón y devolver el ratón a la jaula. Compruebe que el ratón está respirando y moviéndose normalmente después de alimentación forzada para asegurar que la aguja de sonda se inserta adecuadamente durante todo el procedimiento y que ninguna solución se aspiró.

4. Cosecha de las placas de Peyer murinas y aislamiento de colonias de levaduras viables

  1. En el momento apropiado punto de post alimentación forzada, por lo general de 4 horas, los ratones sacrificio utilizando métodos aprobados IACUC. Compruebe si hay falta de capacidad de respuesta tras una pizca dedo del pie, y el uso de una medida secundaria como dislocación cervical a sacrificar el ratón. puntos de tiempo adicionales también pueden ser probados, ya que numerosos estudios han demostrado que la eficiencia y la sincronización de hastatomar a través del epitelio depende 38,39 partícula.
  2. Coloque el ratón con el abdomen totalmente expuesto y esterilizar la zona abdominal por pulverización con EtOH al 70%. Hacer una incisión transversal a través de la piel y cuero con tijeras, con cuidado de no dañar los tejidos internos. palanca manual de la incisión abierta para exponer aún más el peritoneo, el revestimiento serosa delgada que cubre los órganos abdominales. levante suavemente el peritoneo y hacer una incisión transversal para exponer los intestinos.
  3. Con cuidado, usar fórceps romos para provocar el intestino delgado de las arterias mesentéricas, la grasa y otros tejidos. Exponer el intestino delgado desde el estómago, en el cuadrante superior izquierdo del abdomen del ratón, hasta el ciego, el bolsillo grande de tejido intestinal en el inicio del intestino grueso.
  4. Aislar las placas de Peyer mediante la búsqueda de 1-3 mm parches aproximadamente circulares de tejido opaco a lo largo del intestino delgado (Figura 7). El uso de los LIC de disección curvassores, cortar la cúpula de la placa de Peyer, dejando márgenes para asegurar que se recoge ninguna de la lámina propia de los alrededores.
    NOTA: La mayoría de los ratones tienen entre 4-8 parches fácilmente visibles de Peyer. Realizar el procedimiento en un área con iluminación cenital directa aumentará la facilidad con la que las placas de Peyer se pueden visualizar.
  5. Recoger el diseccionado las placas de Peyer en completo Iscove modificado medios (IMDM) de Dulbecco.
    NOTA: Es importante utilizar una técnica estéril e incluyen antibióticos en los medios de recogida con el fin de evitar la contaminación bacteriana gastrointestinal de placas de levadura.
  6. parches de Peyer cepa a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los medios de recogida. parches de Peyer de lavado con IMDM completo fresco sobre un tubo de 50 ml y utilizar un émbolo de una jeringa de 1 ml para romper suavemente hacia arriba las placas de Peyer. Precipitar las células por centrifugación tensas a 1.800 rpm durante 7 min. células sobrenadante y resuspender en Aspirarun volumen final de aproximadamente 100 l.
  7. Aplicar las células de levadura tensas en medios selectivos y utilizar un difusor de placa para distribuir uniformemente las células. Envolver bordes de la placa en Parafilm y se incuban las placas al revés a 30 ° C durante 2 días para permitir el crecimiento de cualquier levadura viable recuperado de las placas de Peyer murino.
    NOTA: Estudios adicionales después de la recuperación de la levadura de las placas de Peyer son necesarios para confirmar que las cepas son capaces de entregar proteína heteróloga correctamente plegada a estos tejidos inmunes. Como se describe en 2.1.14, tales métodos pueden incluir inmunotransferencia, ELISA, o microscopía de fluorescencia para detectar las proteínas fluorescentes, tales como GFP 2,40.

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Representative Results

Generación de una curva de supervivencia después de la irradiación UV requiere placas de células de levadura diluidas de tal manera que unidades formadoras de colonias (CFU) distintos son capaces de formar. Cada muestra de 500 l recogida como se ha descrito anteriormente contiene aproximadamente 5 x 10 6 células; Sin embargo, más de 100 colonias por placa son difíciles de distinguir con precisión. Revestimiento de la muestra sin diluir así como de serie diluciones 1:10 de las células irradiadas por lo tanto asegura que CFU se puede enumerar en cada dosis de UV, como se demuestra en la Figura 1. El recuento de CFU, multiplicado por el factor de dilución, se divide por el número total de células irradiadas originales en cada muestra de 500 l con el fin de determinar el porcentaje de supervivencia a cada dosis. la Figura 2 muestra el porcentaje calculado de tipo salvaje diploide S. boulardii células capaces de sobrevivir a 0 mu J, 5.000 mu J, 10.000 mu J, 15.000 mu J, 20.000 mu J, 22.500 mu J, 25.000mu J, 35000 mu J, y 50.000 mu J. Estos datos establecen una curva claro que se puede utilizar para encontrar la dosis que corresponde a 50% de supervivencia.

Después de la selección de la dosis de UV y la irradiación de células de levadura, es crítico para las colonias mutantes pantalla para confirmar la falta de un gen marcador auxotrófico funcional. El uso de un método de selección, como se describe en 1.2.3.1 y se muestra en la Figura 3, aumenta significativamente la eficiencia de confirmación fenotipo. Se muestra un ejemplo de selección URA3 que se aprovecha de la conversión de 5-FOA a la toxina 5-FU por Ura3 intacto. Enfoques análogos relativos LYS2 y LYS5; TRP1, y MET2 y MET15 e incrementar la eficiencia de la selección de estas mutaciones. Se debe tener cuidado para seleccionar las colonias individuales durante el cribado. El crecimiento constante de las colonias de mutantes en YPD y 5-FOA, pero no uracilo -, placas indicatit fenotipo auxotrófico.

La figura 4 muestra la eficiencia de transformación de tipo salvaje S. boulardii (Sb) con respecto a un laboratorio de uso común S. cerevisiae cepa (Sc) utilizando tanto el LiOAc (LiOAc) y técnicas de electroporación (Electro). Aunque la transformación LiOAc es muy eficiente para S. cerevisiae, la eficiencia de transformación de S. boulardii se mejora en gran medida el uso de la electroporación. La figura 5 muestra el uso de la microscopía de fluorescencia como un ejemplo de método de análisis de expresión de la proteína adecuada a partir de levadura transformada. Campo claro (A) y de fluorescencia (B), las imágenes se muestran para S. cerevisiae transformada con un plásmido URA3 de codificación GFP, lo que demuestra la expresión funcional de la proteína heteróloga a partir de la levadura transformada. Las células pueden inmovilizarse para una mejor visualización utilizando cubreobjetos recubiertos en concanavalina A (capa 5 l de un 2mg / ml de solución madre en agua sobre cada cubreobjetos de 22 x 22 micras y secar al aire).

La figura 6A muestra un 6 de ratón C57BL / celebrada justo antes de una sonda nasogástrica. La mano agarra la espalda y el cuello del ratón firmemente de manera que el ratón no es capaz de mover la cabeza en cualquier dirección. Esta posición permite que la aguja de sonda que se coloca con precisión y con menor riesgo de daños en los tejidos. La figura 6B muestra la aguja de sonda llevada a cabo después el ratón se traga la aguja de sonda. Después del período de incubación, el intestino delgado del ratón sacrificado debe ser cuidadosamente, se separan de los tejidos circundantes, como se muestra en la Figura 7. Esta manipulación permite la fácil identificación de las placas de Peyer y para la disección limpia de los parches sin recoger cualquier de los alrededores lámina propia. Finalmente, la Figura 8 muestra la recuperación típica de CFU de levadura viable de las placas de Peyer. soluciones Medios de levadura y Placas Reactivos de transformación El polietilenglicol (PEG) 50%: YPD: TE / LiOAc: 250 g PEG 3350 20 g de peptona 50 ml de 10x TE 500 ml de agua estéril 20 g de dextrosa 50 ml de 10x (1M) LiOAc Se esteriliza con filtro 10 g de extracto de levadura 400 ml de agua estéril 1 l de agua Se esteriliza con filtro Autoclave TE 10x: YPD placas: PEG / TE / LiOAc: Tris 100 mM 20 g de peptona 400 ml 50% PEG EDTA 10 mM 20 g de dextrosa 50 ml de 10x TE pH a 7,5 y esterilizar filtro 20 g de agar 50 ml de 10x (1M) LiOAc 10 g de extracto de levadura 1 l de agua Autoclave 20% de glucosa: Uracilo - medios selectivos ADN portador (ADN SS): 200 g de dextrosa 2 g de la mezcla de aminoácidos que carece de uracilo Almacenar a -20 ° C antes de su uso y el calor durante 1-2 minutos a 100 ° C para fundir filamentos y almacenar en hielo 1 l de agua 6,7 g base nitrogenada de levadura sin aminoácidos Se esteriliza con filtro 1 l de agua <tr> Esterilizar en autoclave o por filtración estéril Añadir 20% de glucosa 1:10 antes del uso 50% de glicerol: - Uracilo placas: Tampón de electroporación: 500 ml de glicerol En un matraz de 250 ml: 1 M Sorbitol 500 ml de agua 2 g de la mezcla de aminoácidos que carece de uracilo 1 mM CaCl 2 Autoclave 6,7 g base nitrogenada de levadura sin aminoácidos Rellenar con agua destilada 150 ml de agua Autoclave y se almacena a 4 ° C En un matraz de 2 L: 20 g de agar 750 ml de agua frascos autoclave por separado, a continuación, mezclar con 100 ml 20% de glucosa IMDM completo Placas 5-FOA +: LiOAc / DTT 500 ml de Iscove modificado de Dulbecco medios Autoclave en un matraz de 2 L: 0,1 M LiOAc 5 ml de penicilina estreptomicina glutamina 100x 20 g de agar DTT 10 mM 500 l 2-mercaptoetanol 750 ml de agua 10% inactivado por calor suero fetal bovino Mezcla: 2,5 ml de piruvato sódico 100 mM 6,7 g base nitrogenada de levadura sin aminoácidos 2 g de la mezcla de aminoácidos sin uracilo 150 ml de agua tibia Cuando esté frío, añadir: 0,05 g de polvo de uracilo 1 g de 5-FOA Se agita y filtro de esterilizar Añadir a la solución de agar en autoclave Mezclar con 100 ml 20% de glucosa

Tabla Lista 1. Reactivos. Descritos son los reactivos necesarios para la fabricación de cada una de las soluciones, los medios de levadura y placas, y tampones de transformación utilizados para los protocolos en este manuscrito.

Figura 1
Figura 1. Las colonias de levadura cultivadas en un medio YPD. Ejemplo de placa YPD que muestra las unidades de colonias viables (CFU) de formación de probiotic levadura después de la irradiación UV. Las células se diluyeron en serie de tal manera que UFC individuo puede distinguirse y se contó. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Curva de supervivencia de la levadura probiótica diploide. Número de S. viable boulardii CFU como un porcentaje del total de células chapados se representó gráficamente para cada dosis mu J de la irradiación UV (línea continua). La línea roja vertical indica la mu J UV dosis que corresponde al 50% de supervivencia de esta cepa de levadura. Un mutante S. cerevisiae rad1, que no puede reparar los daños causados ​​por mutagénesis UV, se muestra como un control (línea discontinua). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ A>

figura 3
Figura 3. Confirmación de ura3 - fenotipo de UV irradiada células en YPD, uracilo -, y las placas 5-FOA Las células de colonias mutantes UV individuo se recogieron con la punta de un palillo de dientes estéril y suavemente cruzó YPD, uracilo -., Y 5 -FOA placas. Las células se sembraron en estrías primero en dos líneas que se cruzan perpendiculares, a continuación, un nuevo palillo de dientes se usa para pasar a través de la segunda línea y continuar propagación de las células hasta que las células individuales se separan. Un verdadero ura3 - mutante (mut) crece en medios YPD y en presencia de 5-FOA, pero no en la ausencia de uracilo. Ura3 Control - S. cerevisiae (ura3 -) y URA3 + sup> S. boulardii (URA3 +) se muestran para la comparación y para confirmar la preparación adecuada de los medios de levadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Eficacia de la transformación de cepas de Saccharomyces. Tipo salvaje S. boulardii (Sb) y un laboratorio S. cerevisiae cepa (Sc) se transformaron con el LiOAc descrito (LiOAc) y los protocolos de electroporación (Electro). Los resultados se representan como la media CFU obtiene por g de plásmido que codifica un marcador de resistencia a kanamicina. Las barras muestran la media de experimentos por duplicado con barras de error representan el error estándar de la media.en / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 5
Figura 5. Expresión proteína funcional por levadura transformada. S. cerevisiae transformada con el plásmido vacío (A) y el plásmido que codifica GFP (B) se analizaron usando un microscopio de fluorescencia. Fluorescencia en las células de levadura transformadas con el plásmido GFP indica exitosa producción de GFP funcional. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. El manejo apropiado de un ratón C57BL / 6 por sonda oral. El ratón es celebrada tightly en la mano no dominante con la cola escondido bajo el dedo pequeño de manera que no es posible el movimiento (A). La aguja de sonda se inserta en la faringe a lo largo del techo de la boca. Se permite que el ratón para tragar el bulbo de la aguja de sonda, permitiendo que la solución a continuación, introduzca el estómago cuando el émbolo está presionado (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Preparación y disección de las placas de Peyer. El intestino delgado se diseca se muestra lejos de los demás órganos y tejidos internos, con flechas apuntando a algunas de las placas de Peyer. Haga clic aquí para conocer el Versi más grandesel de esta figura.

Figura 8
Figura 8. Levadura La recuperación de las placas de Peyer. Un ejemplo de CFU viable detectado después de la disección, la homogeneización, y el chapado de células de los parches de Peyer total de de un ratón alimentado a la fuerza con S. boulardii. Las células se sembraron en medios de levadura YPD y se incubaron a 30 ° C durante 2 días. Rendimiento típico de UFC recuperadas por ratón es inferior a 10. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Juntos, los protocolos en este documento se describen los pasos esenciales necesarios para el desarrollo y prueba de cepas de levadura auxotróficos probióticos para la entrega de la proteína terapéutica heteróloga al intestino. Esta manipulación y el ensayo de levadura viva recombinante requiere técnicas y recursos con los que cualquier laboratorio individuo puede no estar familiarizado actualmente. Por lo tanto, a pesar de numerosos estudios anteriores han descrito los protocolos anteriores para múltiples cepas de levadura y el ratón, estos métodos no tienen el conocimiento de los autores ha presentado en una forma detallada y unificada. Además, la presente manuscrito hace especial hincapié en la adaptación de los actuales protocolos estandarizados para la manipulación genética de la levadura probiótica, que no están tan bien caracterizado que las cepas de levadura de laboratorio de uso común. Muchos de los pasos, tanto para la mutagénesis (discutidos en la parte 1) y transformación (parte 2) deben ser optimizados para la manipulación de tales diploide, isolat probiótico de levaduraES. Este manuscrito también discute peligros potenciales asociados con el manejo de animales (parte 3) y la disección de los tejidos inmunes de parches de Peyer del intestino delgado (parte 4).

Como muchas cepas de levadura industriales y clínicamente relevantes no son inmediatamente adaptable a la manipulación genética a gran escala, es necesario en primer lugar para generar cepas tales como mutantes auxotróficos que pueden cultivarse y seleccionarse sin antibióticos caros. Mutagénesis UV es uno de estos enfoques que permite la rápida mutación específica de los genes auxotróficos 7,41. Las curvas de supervivencia pueden ser fácilmente generados (Figuras 1 y 2) para determinar la dosis apropiada para la selección de mutantes. Sin embargo, este enfoque conlleva el riesgo de inducción de mutaciones fuera de destino que puedan afectar a la tasa de crecimiento u otras propiedades de la cepa de levadura. knockouts Targeted lugar se pueden generar utilizando PCR construye o el sistema / Cas9 CRISPR. posterior selección o la selección(Figura 3) de mutantes permite la identificación de levadura auxotrófico. El uso de la selección en placas en medios 5-FOA, por ejemplo, permite una rápida eliminación de cualquier levadura que contiene todavía un gen auxotrófico URA3 funcional. Cuando sea posible, este enfoque de selección puede ser preferible a una pantalla, que requiere el análisis de todas las colonias generadas. Con cualquiera de selección o de detección, sin embargo, es crítico para llevar a cabo las rayas repetida de colonias de levadura individuales en medios selectivos para confirmar el estado auxotrófico.

Transformación de los mutantes generados se puede lograr a través de diferentes protocolos. Aunque la transformación LiOAc es eficaz en la transformación de muchas cepas de levadura, particularmente para el laboratorio más comúnmente utilizado S. cepas cerevisiae, protocolos alternativos, tales como la electroporación pueden transformar otras levaduras aislados con mayor eficiencia (Figura 4). Cada nueva cepa debe ser probado USIng múltiples protocolos para determinar las condiciones óptimas para la transformación. La variación de los tiempos de incubación y la concentración de ADN, por ejemplo, puede influir en la eficiencia general de transformación y debe ser probado y optimizado para cada cepa 33.

sonda oral permite la administración de dosis controlada de estos levadura recombinante directamente al tracto gastrointestinal murino, cuyos tejidos inmunológico entonces pueden ensayarse para la levadura y la proteína heteróloga. Adecuada técnica de sonda oral (Figura 6) es crítica para minimizar las molestias de los animales y aumentar la precisión experimental. Además, las placas de Peyer son sitios clave para evaluar la captación de levadura recombinante desde el intestino. Estas agrupaciones de tejido inmune son sitios importantes de muestreo de antígeno y la inducción de la respuesta inmune de la mucosa. antígenos grandes, incluyendo la levadura 3-6 micras de diámetro, son más propensos a ser absorbido por las células M de las placas de Peyer con el fin de cruzar la gaepitelio strointestinal e interactuar con las células inmunes. Se debe tener cuidado cuando la disección de las placas de Peyer para asegurar que sólo las células desde el interior del parche en vez de se recogen la luz intestinal o lámina propia (Figura 7). Nuevas medidas también deben ser tomadas después de la disección para evaluar la expresión y función de la proteína heteróloga en la levadura adecuada para reciclar (Figura 8). Preparación de la proteína total de los lisados ​​de levadura y la inmunotransferencia es un método estándar para evaluar la expresión de la proteína; Sin embargo, este enfoque no proporciona información sobre el plegamiento de proteínas y la función. Para evaluar la función de proteínas, la levadura puede ser transformada con un plásmido que codifica GFP y se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia después de la recuperación de las placas de Peyer para evaluar la expresión funcional de GFP (Figura 5).

En suma, este manuscrito presenta un conjunto unificado de protocolos experimentales detallados que abarcan pasos lado a otrom la generación de mutantes auxotróficos para la recuperación de la levadura probiótica del intestino murino. Mediante la compilación de protocolos que no caen tradicionalmente dentro de una sola área de especialización, estas descripciones facilitarán aún más estudios que prueban las respuestas inmunológicas a la levadura probiótica diseñado como vectores de suministro de fármacos orales. Los autores esperan que este estudio fomentar la discusión y promover la optimización de los métodos experimentales para cada cepa de levadura probado, allanando el camino para que los enfoques más eficientes para el desarrollo de nuevas terapias recombinantes basados ​​en probióticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen la financiación a través del Centro Infantil de Inmunología y Vacunas y un premio Innovador Nueva NIH (1DP2AI112242-01) adjudicado a Tracey J. Cordero. Los autores también agradecen a Natalya P. Degtyareva por la generosa contribución de rad1 S. cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

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References

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