Transformasjon av Probiotiske gjær og deres utvinning fra Gastrointestinale immun Vev Etter oralt inntak i Mus

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Presenteres her er en enhetlig beskrivelse av teknikker som kan brukes til å utvikle, omforme, administrere og teste heterologe protein uttrykk av de probiotiske gjær Saccharomyces boulardii.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Probiotiske mikroorganismer er en spennende potensielle hjelp av effektiv og økonomisk levere heterologe proteiner i fordøyelseskanalen. Disse organismene er i stand til å overleve passasje gjennom mage-tarmkanalen, men ikke kolonisere det 1, slik at kontrollert dosering og begrense eksponering for medikamentet uttrykt. Videre er muligheten til enkelt å konstruere disse organismene for å fremstille heterologe proteiner i stor skala gjør dem et økonomisk alternativ til syntetiske leverings partikler. Imidlertid utvikling av en slik tilnærming, som nylig demonstrert ved anvendelse av en auxotrof stamme av de probiotiske gjæren Saccharomyces boulardii 2, krever kunnskap om laboratorieteknikker som ikke tradisjonelt kombinert innenfor et gitt studie, som strekker seg fra gjær og molekylær biologi til dyr behandlingsteknikker og immunologiske metoder. Således, selv om de enkelte fremgangsmåtene beskrevet heri er ikke i seg selv nyelaboratorieprotokoller, er målet med dette manuskriptet er å presentere en helhetlig innføring i teknikker som trengs for eksperimentell testing av probiotiske gjær som narkotika levering kjøretøy til murine mage-tarmkanalen. Forutsatt er en samling av viktige protokoller for: 1) generasjon av auxotrofe mutant stammer av gjær som kan lett bli genetisk manipulerte; 2) transformasjon av gjærkulturer å uttrykke heterologe protein; 3) administrasjon av rekombinant gjær til tarmen via oral inntak; og 4) utvinning av levedyktige probiotiske rekombinant gjær fra den murine tarmen og vurdering av deres heterolog proteinekspresjon.

Første, selv om en rekke positive og negative seleksjonsfremgangsmåter eksisterer for manipuleringen av gjærarter, negativ seleksjon, for eksempel ved bruk av auksotrofe markører øker både effektivitet og letthet som gjær kan bli transformert og selektert. Positiv utvelgelse av trans bruker antibiotika, i samarbeidntrast, øker betydelig kostnaden for gjær manipulasjon. Videre kan utvalget av gjær på antibiotikaholdig faste medier gir mulighet for økt vekst av ikke-transformerte bakgrunns kolonier i forhold til valg av auxotrofe gjær på syntetisk slippe ut faste medier (upubliserte observasjoner). Auksotrof gjærstammer er som mangler enzymer kritiske for syntese av essensielle aminosyrer eller uracil. Slike gjær kan vokse bare hvis supplert med manglende metabolitt eller metabolsk genet, og dermed gjør negativ seleksjon når gjær er platet på syntetisk slippe ut media som mangler essensielle metabolitten. Mange brukte Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammer er nemlig allerede auxotrofe mutanter 3. Industrial, klinisk, og probiotiske gjærstammer, men er vanligvis prototrofe med evnen til å syntetisere alle nødvendige næringsstoffer. For å muliggjøre mer effektiv genetisk manipulering av slike gjær, kan auxotrofe gener selektivt målrettetå generere stammer som kan velges uten antibiotika. Spesifikk målretting av auxotrofe markørgener kan oppnås gjennom PCR-mediert genet avbrudd avhengig av homolog rekombinasjon eller senere gjennom CRISPR / Cas9 målgruppe 4-6. Alternativt kan UV-mutagenese for raskt å generere auxotrofe mutanter som til og med i gjærstammer hvor transformasjon med flere plasmider som er teknisk vanskelig 7. Mens PCR målretting og CRISPR / Cas9 er nøye beskrevet andre steder, presentert i del en av dette manuskriptet er en detaljert protokoll som beskriver en UV mutagenese tilnærming for å skape auxotrofe stammer som vil tillate for negativ seleksjon snarere enn positiv antibiotika utvalg av Gjærtransformanter.

Det neste nødvendige trinn i bruken av slike stammer auxotrofe for oral levering av heterologt protein er gjær transformasjon med plasmid DNA. Siden den første vellykkede transformasjonen av yeast sfæroplaster rapportert for Saccharomyces cerevisiae i 1978 8, har en rekke modifikasjoner blitt karakterisert for å øke effektiviteten og letthet som gjærarter kan bli genetisk modifisert. Bruken av elektroporering for vellykket transformasjon av DNA til S. cerevisiae ble først beskrevet i 1985 9 og har siden blitt forbedret ved tilsetning av 1 M sorbitol inkubasjon for å osmotisk støttelegemer 10. Electroporation effektivitet har dessuten vist seg å avhenge av gjær arter og belastning, cellenummer og vekstfase, elektroporering volum, feltstyrke, og bestemte buffere 11. Litiumacetat (LiOAc) transformasjon, opprinnelig beskrevet av Ito et al. 12, er blant de mest vanlig anvendte transformasjonsprotokoller som det krever ikke spesielt utstyr. Ytterligere analyser viste at effektiviteten av LiOAc gjærtransformasjons øker sterkt når celler er samlet i midt-log fasenav vekst og varmesjokkbehandlet i nærvær av polyetylenglykol (PEG) og DNA ved 42 ° C 12. Inkubasjon av hele intakte gjær med PEG er en forutsetning for effektiv omforming, eventuelt gjennom å forbedre binding av DNA til cellemembranen samt via andre effekter på membranen 13. Litium seg også øker permeabiliteten av intakte celler 14. Selv om de fleste laboratorium S. cerevisiae-stammer kan lett bli transformert ved anvendelse av LiOAc transformasjon 3, kan andre gjærarter bli mer effektivt transformert ved hjelp av alternative protokoller. Pichia pastoris, for eksempel, er mest effektivt omdannes via elektroporering i stedet for LiOAc transformasjon 13. Det er avgjørende, og derfor, for å teste multiple metoder for transformasjon og for å optimalisere inkubasjonsperioder og reagenskonsentrasjoner når du forsøker å genetisk modifisere en uncharacterized gjærstamme. Dette manuskriptet beskriver således både LiOAc transformation og elektroporasjon som teknikker for transformasjon av auxotrofe mutant og vill type S. boulardii. Interesserte lesere henvises til siste anmeldelser for grundige beskrivelser av utviklingen av gjær transformasjon, alternative protokoller, og videre diskusjoner om mulige virkningsmekanismer 13,15. Transformasjon av gjær med plasmid som koder for en lett påvisbar protein er dessuten essensiell for nedstrøms testing for å sikre riktig ekspresjon og funksjon av heterologt protein. Myriad forskjellige proteiner kan velges avhengig av endelige formålet med den terapeutiske studier og antistoffer som er tilgjengelige for protein deteksjon av immunblotting, ELISA, og andre teknikker. Protokoller for disse teknikker er blitt grundig beskrevet andre steder 16,17, og kan brukes til å bestemme nivåer av heterolog proteinproduksjon fra transformert gjær ved sammenligning med standardkurver. I forbindelse med demonstrasjon og å visevellykket produksjon av en meget vanlig brukt protein i gjær biologi, presenterer dette manuskriptet transformasjon med plasmid som koder for grønt fluorescerende protein (GFP), noe som gir mulighet for etterfølgende påvisning ved hjelp av fluorescens mikroskopi.

Like viktig for fremstilling av probiotiske organismer som uttrykker heterologe proteinet er korrekt administrasjon og deteksjon av disse mikroorganismer i mage-tarm vev, som beskrevet i deler av tre og fire. Administrering av rekombinant gjær via oral tvangsforing gjør det mulig for avgivelse av kontrollerte mengder av gjær direkte inn i magesekken, som C57BL / 6 mus er naturligvis i stand til oppkast 18. Imidlertid kan feil dyr håndtering og føring føre til esophageal skader og perforering, mage perforering, tracheal administrasjon, og aspirasjonspneumoni 19,20. Dårlig teknikk og uerfarenhet kan dessuten øke variasjonen i murine immunresponser og eksperimentell resuLTS, som har blitt tilskrevet dyret stresset på oralt inntak 21,22. Praksis i riktig teknikk kan således ikke bare svekke dyret ubehag, men kan også øke presisjonen av eksperimentelle resultater. Dette manuskriptet beskriver og demonstrerer dyr håndtering og oral sonde for administrasjonen av kontrollerte doser av rekombinant gjær.

Endelig er det viktig å bekrefte vellykket levering av rekombinant gjær ved å analysere lymfevev for tilstedeværelsen av gjær og heterologt protein. Gastrointestinale immun vev som kan lettest og forutsigbart undersøkes for tilstedeværelse av gjær er Peyers lapper. Peyers patcher er sekundære lymfoide organer langs tynntarmen som er sentrale områder av mucosal immunrespons induksjon 23. Antigener fra lumen overføres transcellularly gjennom microfold (M) celler i epitelet og slippes ut i Peyers patcher, og dermed utsette vedlegged antigenpresenterende celler til intestinal luminale innhold. Selv om partikkelopptaket over tarmepitelet kan også oppnås ved slimceller, har disse cellene er vist å bare ta opp partikler mindre enn 0,02 pm i diameter 24. Transepitelial dendritter forlenget fra CD103 + dendritiske celler (DC) også ta opp små partikler fra den intestinale lumen 25; men det er foreløpig ingen rapporter som viser at CD103 + DC ta opp partikler større enn bakterier. Således intakt probiotisk gjær, med en gjennomsnittlig størrelse mellom 3-6 mikrometer i diameter, er mest sannsynlig å bli tatt opp av M-celler og overført til Peyers lapper. Beskrevet her er en protokoll for innsamling og screening av Peyers patcher for levedyktig rekombinant gjær, selv om denne prosedyren kan også enkelt tilpasses for å vurdere opptak av probiotiske bakterier.

I sammendraget, vurdere rekombinant probiotiske gjær for levering avrapeutic proteiner til tarmen krever ferdigheter i laboratorieteknikker som spenner molekylærbiologi til dyr håndtering og immunologi. Presenteres her er protokoller for en) generering og screening av auxotrofe gjærstammer som lett kan negativt valgt uten antibiotika, 2) alternative protokoller for å forvandle gjær og aktivere uttrykk for heterologe protein, 3) demonstrasjoner av riktig dyr håndtering teknikker og oralt inntak for intragastrisk levering av rekombinant gjær, og 4) protokoller for Peyer patch disseksjon og screening for levedyktige rekombinante gjær og funksjonelt heterologt protein. Til sammen vil disse protokollene tillate generering og testing av en probiotisk gjærstamme i stand til å levere heterologe terapeutiske protein til mage-tarmkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. UV Mutagenese å generere Auxotrofe gjærstammer

  1. Generere overlevelseskurver for å bestemme nødvendige doser av UV-bestråling
    1. Forbered YPD (gjærekstrakt pepton dekstrose) media og andre reagenser som er oppført i tabell 1, i henhold til standardprosedyrer, 26 og inokuler enkeltkolonier inn i 5-10 ml YPD medium. Inkuber kulturer på en berg-trommel ved 30 ° CO / N til metning i minst 8 timer.
    2. Bestem cellekonsentrasjon på O / N kulturer ved hjelp av et spektrofotometer ved å fortynne cellene 1:10 i vann i en plast kyvette. Fortynn cellene til en konsentrasjon av 10 7 celler / ml i 20 ml sterilt destillert vann.
    3. Hell fortynnede celler inn i en steril petriskål av plast, og med lokket fjernet, plasseres platen 14 cm under en UV-pære.
    4. Expose celler til serie 5000 μJ og 10.000 μJ doser av UV bestråling, trekke 500 mL av celler etter hvert trinn slik at celleneer samplet etter eksponering for 0 μJ, 5000 μJ, 10000 μJ, 15000 μJ, 20000 μJ, 25000 μJ, 30000 μJ, 40000 μJ, og 50.000 μJ av UV bestråling. Overførings ekstrahert celleprøver til sterilt 1,5 ml rør og serielt fortynnet i 1:10 trinn i sterilt vann.
    5. Pellet cellene i hver fortynning ved sentrifugering i en mikrosentrifuge ved 16 000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten og resuspender i et 100 ul volum av sterilt vann egnet for plettering av gjærceller. Pipetter fullt volum av resuspenderte celler på plater inneholdende YPD faste medier og bruke en steril spreder for å fordele cellene tvers over hver plate.
    6. Pakk metallkanter i Parafilm for å hindre uttørking av media og dekkplater i aluminiumsfolie for å hindre fotoreaktivering og reparasjon av UV-indusert mutasjoner. Inkuber platene opp ned på 30 ° C i 2-4 dager for å tillate vekst av levedyktige gjærkolonier (figur 1).
    7. Tell number kolonier, eventuelt med hjelp av en penn for å merke av telles kolonier, en håndholdt elektronisk teller penn, eller en teller stå med forstørrelse. Plot i prosent av totale belagt celler på hver μJ dose av UV-bestråling for å generere en overlevelseskurve for bestrålt gjær (figur 2).
      MERK: haploid gjærstammer kan forventes å kreve lavere doser av UV-bestråling i forhold til diploide stammer for å oppnå den samme prosent overlevelse. En stamme av gjær som mangler funksjonell DNA-reparasjonsenzymer, slik som rad1 S. cerevisiae mutant, kan benyttes som en positiv kontroll for å indikere nærvær av UV-bestråling ved meget lave doser.
    8. Bestemme den dose av UV-mutagenese for å bli brukt for screening ved å referere til overlevelse kurve etablert i 1.1.7. X-verdien på det punkt langs den overlevelseskurven hvor y er lik 50 er UV-bestråling dose ved hvilken 50% av gjær overleve. Screening mutanter på dette lave prosent overlevelse kan resultere i enhøyere utbytte av hell muterte stammer, spesielt for diploid gjær. Den 50% overlevelse dose for WT S. boulardii, som vist i figur 2, er omtrent 18 000 μJ.
      MERK: Selv om slike høye UV-doser øker risikoen for mutasjoner i genene for andre enn den auxotrofe markør genet av interesse cellulære trasé, må denne ulempen være balanseres mot behovet for å indusere mutasjoner i begge kopier av auxotrofe markørgenet. For haploide stammer hvor bare ett gen eksemplar skal muterte, screening ved en høyere prosent overlevelse, for eksempel ved 90%, reduserer risikoen for ytterligere mutasjoner og likevel gir tilstrekkelig for generering av auxotrofe mutanter.
  2. UV-mutagenese og screening for auxotrofe gjærstammer
    1. Forbered gjær som beskrevet i trinn 1.1.1-1.1.3.
    2. Expose gjær til dosen av UV-bestråling tilsvarende 50% overlevelse, som fastsatt i 1.1.8. For WT S. boulardii, denne dosen waer fast bestemt på å være ca 18 000 μJ (figur 2).
    3. Samle 1 ml volumer av UV-bestrålt gjær og pellet ved sentrifugering i en mikrosentrifuge ved 16 000 x g i 1 min. Sug supernatanten og resuspender cellene i 100 ul sterilt vann.
      1. Valg av mutanter
        1. Ved hjelp av utvalget, slik som med ura3 - auxotrofe mutanter, plate bestråles gjær på medier inneholdende 5-fluororotinsyre (5-FOA) for å selektere for celler som mangler en funksjonell URA3 enzym.
          MERK: Enhver gjær inneholder funksjonelle kopier av URA3 vil konvertere 5-FOA til toksinet 5-fluorouracil, som fører til celledød og åpner for enkelt valg av ura3 - kolonier som mangler et funksjonelt URA3 27. Analoge utvalgs tilnærminger er mulig for LYS2 og LYS5, TRP1, og MET2 og MET15 markører ved hjelp av medier som inneholder α-aminoadipinsyre 28; 5-fluoranthranilsyre 29; og metylkvikksølv 30,31, respektivt.
        2. Pipetter 100 ul resuspenderte celler på minimalt medium inneholdende 5-FOA og bruke en steril spreder for å belegge jevnt plate. Pakk platene i Parafilm og inkuber opp ned ved 30 ° C i 2-4 dager for å tillate vekst av levedyktige gjærkolonier.
        3. Bekrefte ura3 - fenotypen av enhver koloni som vises på 5-FOA-plater ved restreaking på YPD, uracil - og 5-FOA-plater (figur 3). Med tuppen av en steril tannpirker for å samle en del av en enkelt koloni og forsiktig trekke cellene på tvers av frisk YPD, uracil -, og 5-FOA platene. Igjen inkuber innpakket platene opp ned på 30 ° C i 2-4 dager.
          MERK: Levedyktige kolonier vises som hevet, omtrent sirkulære vekster mens ikke levedyktige celler vises bare som en ugjennomsiktig smøre uten hevet vekster (figur 3).
      2. Screening av mutanter
        1. Ved generering av en auxotrof mutant som seleksjonsmetoder ikke er tilgjengelige, fremstille serielle 1:10 fortynninger av UV-bestrålte gjærceller i sterilt vann og pipettere fortynninger på YPD-medium, ved hjelp av en steril spreder for å belegge jevnt plate.
        2. Pakk platene i Parafilm og inkuber opp ned ved 30 ° C i 2-4 dager. Bestemme hvilken fortynning tillatt for vekst av individuelle kolonier som lett kan skilles fra hverandre, vanligvis ikke mer enn omtrent 100 kolonier per plate.
        3. Gjenta UV mutagenese av gjærprøver som beskrevet i 1.2.1-1.2.3 og plateceller ved denne bestemt fortynning. Pipetter fortynnet gjær på YPD medium, bruker en steril spreder for å fordele cellene, og inkuber innpakket platene opp ned på 30 ° C i 2-4 dager.
        4. Screen for auxotrophs av kopiplate bort på selektive medier som mangler metabolitt av interesse. Først sikre en steril fløyel pad på en tallerken stativog snus platen med UV-bestrålt kolonier på fløyel, som markerer plate orientering.
        5. Neste, snu en fersk plate mangler metabolitten av interesse på fløyel og trykker forsiktig ned for å overføre celler fra fløyel til plate. Lagre den originale plate ved 4 ° C. Pakk og inkuber den nye platen opp-ned ved 30 ° C i 2-4 dager.
        6. Som et alternativ til kopiplate, skjerm mutanter ved å gjen striper kolonier fra YPD på selektive media. Med tuppen av en steril tannpirker for å samle en del av en enkelt koloni og forsiktig trekke cellene over en ny YPD-plate og en plate som mangler den metabolitt av interesse. Igjen inkuber innpakket platene opp ned på 30 ° C i 2-4 dager.
          MERK: Man må passe på å velge enkeltkolonier og strek ut kolonier flere ganger for å bekrefte en homogen befolkning av sanne auxotrofe celler.
    4. Ytterligere bekrefte fenotypen av bestrålte celler etter inoculating enkeltkolonier i 5-10 ml både YPD og media mangler riktig metabolitten (for eksempel i uracil - media for en ura3 - mutant). Inkuber på en valsetrommel ved 30 ° CO / N for å bekrefte vekst av celler i YPD media men ikke i fravær av metabolitten.
      MERK: Selv om vekstmønstre på faste medier skal klart angi gjær auksotrof status, er det mulig for noen gjær til å tåle påkjenninger og danner små, langsomt voksende kolonier på faste medier, men ennå ikke tolerere de samme forholdene i flytende medier (upubliserte observasjoner). Inoculation til flytende kulturer bør derfor utføres for å grundig bekrefte vekst mønstre av UV-bestrålt mutanter.
    5. For langtidslagring av bekreftet auxotrofe mutanter, forberede glyserol aksjer etter inokulering celler i 10 ml YPD og ruger på en berg-trommel O / N ved 30 ° C. Pellet cellene ved sentrifugering i 3 minutter ved 2500 xg og aspirer medier. Resuspender cellene i 50%sterilfiltrert glyserol, overføre til en kryoampulle, og oppbevar ved -80 ° C.
      MERK: UV mutagenisert gjær potensielt inneholde mutasjoner i andre enn i auxotrofe markør interesse flere gener. Før fortsetter med bruk av verifiserte auxotrofe mutanter, bør disse stammene bli ytterligere analysert gjennom gen-sekvensering og evaluering av resistens overfor pH, gallesyre påkjenninger, og andre egenskaper som er relevante for probiotiske stammer, som beskrevet andre steder 2. I tillegg bruk av PCR homologi eller CRISPR / Cas9 målgruppe til mer selektivt mutere auxotrofe markører bør vurderes som et alternativ til UV mutagenese 4-6.

2. Gjær Transformation

  1. LiOAc Transformasjon av gjær
    1. Vaksinere enkeltgjærkolonier i 5-10 ml YPD media og ruge på en berg-trommel ved 30 ° CO / N.
    2. For å indusere log fase vekst og øke effektiviteten av plasmid opptak, deTermine cellekonsentrasjon ved hjelp av et spektrofotometer for å måle en 1:10 fortynning av celler i sterilt vann i en plast kyvette. Fortynn O / N kulturer til en OD 600 på 0,16 til 0,2 (ca. 2 x 10 6 - 2,5 x 10 6 celler / ml) i 50 ml frisk varm YPD og inkuberes cellene på en orbital rysteplattform satt til 200 opm inntil kulturen når omtrent 1 x 10 7 celler / ml, vanligvis omkring 4 timer.
      MERK: Transformasjon effektivitet kan måles som en funksjon av antall vellykket transformerte gjær kolonidannende enheter (CFU) pr ug av plasmid-DNA. Økt effektivitet resulterer i mer transformerte kolonier per mikrogram av plasmid DNA. Subdyrking gjærceller og samling under log fase vekst er en faktor som øker transformasjon effektivitet 12.
    3. Pellet celler ved sentrifugering ved 2500 x g i 3 min.
    4. Aspirer supernatanten og overføre cellene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved resuspendering i pellet i 1 ml sterilt vann.
    5. Pellet cellene ved sentrifugering ved 16 000 x g i 1 min i en mikrosentrifuge, Aspirer supernatanten og vask celler ved resuspensjon i 1 ml TE / LiOAc (Tris-EDTA LiOAc) buffer.
    6. Gjenta sentrifugering og resuspender cellene i TE / LiOAc-buffer til en konsentrasjon på 2 x 10 9 celler / ml.
    7. Forbered transformasjons blandinger med hver av de følgende: 50 ul klare for gjær i TE / LiOAc-buffer, 5 ul av bærer-DNA (10 ug / ul), og 1 ul plasmid-DNA (1 pg). Mikrogram av plasmid-DNA kan titreres som økende mengder av DNA kan eller kan ikke føre til økt transformasjonseffektivitet 32
      MERK: For en mutant gjærstamme som mangler en auksotrof markør, kan bare en plasmid som koder for markør bli forvandlet per prøve. Videre er bruk av et plasmid som koder for en lett påvisbar protein, slik som GFP, vil gi rom for effektiv bestemmelse av riktig folding og ekspresjon av heterologe protein av gjærstammen etter at transformasjon.
    8. Til hver forberedelse, legge 300 mL av PEG / LiOAc / TE og virvle grundig. Inkubasjon av intakte celler med PEG er en forutsetning for effektiv omforming 13.
    9. Inkuber preparater ved 30 ° C i 30 min under agitering ved å plassere mikrosentrifugerør i et begerglass anbrakt på en orbital plattformen rystemaskin ved 200 opm.
    10. Legg 35 ul DMSO til hver reaksjon og varmesjokkceller i 15 minutter i et 42 ° C vannbad. Selv om det er motstridende rapporter om den ekstra fordelen av DMSO 33, har varmesjokk av intakte gjærceller er vist å øke transformasjon effektivitet 12.
    11. Vask cellene ved å pelletere via sentrifugering som i 2.1.5, aspirere eller pipettere av supernatanten, og resuspendering i 1 ml sterilt vann. Forsiktig pipettere opp og ned for å bryte opp celle-pellet.
      MERK: Det er viktig å grundig fjerne supernatanten fordi mediebrukd generere kompetente celler kan hemme gjær vekst og kolonidannelse.
    12. Gjenta cellepelle som i 2.1.5, aspirer supernatanten og resuspender cellene i 100 ul sterilt vann. Pipetter fullt volum på en selektiv plate og bruke en steril spreder til jevnt belegge platen med transformerte gjær.
    13. Vikle kanter av belagte plater i Parafilm for å hindre uttørking av media og inkuber opp ned ved 30 ° C i 2 dager for å tillate vekst av transformerte gjærceller. Vellykket, effektiv transformasjon og auxotrof utvalg av Saccharomyces cerevisiae gir et høyt antall kolonier pr transformasjon fremstillingen, selv om utbyttet kan være mye lavere for andre stammer (figur 4).
    14. Oppbevares gjær plater for på kort sikt (vanligvis 1-3 uker) opp ned og dekket ved 4 ° C. Forbered glyserol aksjer av transformert gjær som beskrevet i 1.2.5 for langtidslagring.
      MERK: Videre studier testing forvandlet CFU er nødvendig for å bestemme plasmidstabilitet og evaluere riktig ekspresjon av heterologt protein. Grundige beskrivelser av plasmidstabilitet 34, bruk av immunoblotting for å detektere denaturerte proteiner utvinnes fra celleprøver 17, enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) for å påvise riktig foldet tredimensjonale proteiner 16, og bruk av GFP i gjær studier 35 er tilgjengelige steder. Figur 6 viser et representativt bilde av vellykket GFP uttrykk i transformert S. cerevisiae i forhold til ikke-transformerte celler. Bruk av et slikt fluorescerende protein er en metode for effektivt å bestemme vellykket heterolog proteinproduksjon.
  2. Electroporation av gjær
    1. Vaksinere enkeltgjærkolonier i 5-10 ml YPD media og ruge på en berg-trommel ved 30 ° CO / N.
    2. Bestemme cellekonsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer for å måle en 1:10 fortynning av celler i sterilt vann. dilutt O / N kulturer i 100 ml fersk varme YPD medie til en OD 600 tilsvarer cirka 0,3. Inkuber underkulturer ved 30 ° C på en orbital rysteplattform satt til 200 opm inntil nådde en OD 600 på omtrent 1,6, vanligvis 4-5 timer. Hver 100 ml subkultur vil generere nok klimaanlegg celler for to transformasjonsreaksjoner.
    3. Pellet celler ved sentrifugering ved 2500 x g i 3 min. Aspirer supernatanten og vask cellene ved resuspendering i 50 ml iskald sterilt vann. Gjenta vaskingen ved å pelletere cellene, å aspirere supernatant, og resuspendering i frisk 50 ml iskald sterilt vann.
    4. Pellet cellene igjen og resuspender i 50 ml iskald elektroporering buffer (1 M sorbitol, 1 mM CaCl 2).
    5. Gjenta spinn som i 2.2.3, aspirer supernatanten og resuspender cellene i 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Inkuber cellesuspensjon på en valsetrommel ved 30 ° C i 30 minutter. Preinkubasjonstid av celler i LiOAc og DTT øker synergi påeffektiviteten av electroporation 36.
    6. Pellet cellene som i 2.2.3, fjern supernatanten, og vask av resuspending i 50 ml iskald electroporation buffer. Gjenta sentrifugering og resuspender cellene i iskald electroporation buffer til et sluttvolum på 1 ml.
    7. Forbered på is: aircondition gjærceller, sterile electroporation kyvetter og plasmid DNA. Umiddelbart etter endelig resuspensjon av kondisjonert celler i 1 ml buffer elektroporering, kombiner 400 mL kondisjonegjærceller med omtrent 1 pg plasmid DNA og tilsett til en iskald 0,2 pm elektroporering kyvette. Bruk av økte mengder av DNA kan lett øke transformasjon effektivitet 11. Inkuber reaksjon på is i 5 min, deretter electroporate med electroporator satt til 2,5 kV og 25 uF.
      MERK: Som beskrevet i 2.1.7, kan en mutant gjærstamme som mangler en auxotrofe markør transformeres med bare ett plasmid som koder for muterte markør per prøve. Også brukeret plasmid som koder for en lett påvisbar protein slik som GFP gjør det mulig for effektiv bestemmelse av riktig folding og ekspresjon av heterologt protein påfølgende transformasjon.
    8. Overføring elektroporert celler inn i 8 ml av en 1: 1 blanding av YPD: 1 M sorbitol og tillate cellene inkubert på en rulletrommel ved 30 ° C i 60 min.
    9. Pellet-celler som i 2.2.3 og resuspender i 100 mL 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Plate hele volumet på selektive medier inneholdende 1 M sorbitol, vikle kanter av platene i Parafilm, og inkuber platene opp ned på 30 ° C i 2-5 dager for å tillate vekst av transformerte gjærceller.
      MERK: Det er viktig å teste transformert gjær for å vurdere riktig uttrykk for heterologe proteiner, som beskrevet i 2.1.14 og 2.2.7.

3. oralt inntak av mus med Transformed Gjær

  1. Utføre alle dyr omsorg og håndteringsprosedyrer i henhold til Guide for omsorg og bruk av laboratorie Animals og Institutional Animal Care og bruk komité godkjenning.
  2. Forbered O / N gjærkulturer ved inokulering enkeltkolonier av forvandlet auxotrofe gjæren i 5-10 ml selektive medier. Inkubere kulturene O / N i minst 8 timer på en valsetrommel ved 30 ° C inntil metning.
    Merk: Bruk av plasmid som koder for proteiner slik som test GFP vil gi rom for å lette protein ekspresjon testing i gavaged gjær, som beskrevet i 4.7.
  3. For maksimal induksjon av proteinekspresjon, og for å indusere log-fase vekst, fremstille subkulturer fra O / N kulturer etter fortynning til en OD 600 på omtrent 0,16 til 0,2 ekvivalent i 50 ml passende media som beskrevet i 2.1.2.
  4. Bestemme konsentrasjonen av celler dyrket som i 1.1.2 og juster til 10 9 celler / ml. Forbered en 100 mL dose for hver mus, med noen få hundre mikroliter ekstra volum per gruppe for å forbedre nøyaktighet og brukervennlighet av prøven lasting.
  5. Pellet-celler ved sentrifugering ved 2500 xg i3 min, eller i en mikrosentrifuge ved 16 000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene ved tilsetning av et likt volum av sterilt vann og forsiktig pipettering opp og ned.
  6. Fiks en riktig tykkelse sonde nål (22 G for 15-20 g mus) på en 1 ml steril sprøyte og last gjær prøve, være sikker på å eliminere eventuelle bobler og sette stempelet til en 100 mL tilvekst. Legge en ekstra sprøyte med sterilt vann til sonde kontroll mus og kontroller for tilstedeværelse av eventuelle forurensende gjær.
  7. Plukk opp musen skal gavaged hjelp av ikke-dominante hånd, med pekefingeren og tommelen tett fatte huden rundt halsen (Figur 6A). Brette halen under liten finger for å forhindre bevegelse av det nedre legemet. Vær sikker på at grepet er sikker og forbyr musen fra å bevege hodet for å hindre skade på indre vev under tvangsforing.
    MERK: Beregn hvor langt sonde nålen skal settes inn ved å holde nålen mot musa slik atpæren er selv med xifoid prosessen av sternum. Sette denne lengden av nålen vil typisk tillate sonde nål pære å gå inn i magen.
  8. Ved hjelp av den dominerende hånd, forsiktig setter den gavage nålen inn i mus spiserøret ved å vinkle nålen langs taket i munnen og baksiden av halsen, holder litt til venstre for midten. Vent til musen for å svelge pære av nålen og la nålen til å stige litt lenger til det punktet anslått i 3,7 (figur 6B). Hvis noen kjenner motstand under innsetting av sonde nål eller om musa som helst begynner å gispe, forsiktig fjerne nålen og igjen prøve å finne spiserøret.
  9. Etter at musen har svelget pære av sonde nål, forsiktig trykk ned sprøytestempelet for å administrere 100 pl (10 8 CFU) av gjær direkte inn i musen magen.
    MERK: Selv om mus ikke klarer å kaste opp noen av gavaged løsning etter administrering 18,19 21,37. Riktig innføring av nålen sonde, samt justering av volumet og viskositeten av oppløsningen, kan bidra til å begrense tilbakeløpskjøling og sikre nøyaktig dosering.
  10. Fjern forsiktig sonde nål fra musen magen og spiserøret og returnere musen til buret. Sjekk at musen puster og beveger seg normalt etter sonde for å sikre at gavage nålen er satt riktig inn i hele fremgangsmåten, og at ingen løsning ble aspirert.

4. Harvest of Murine Peyers Patches og Isolering av Levedyktige gjær Colonies

  1. På det aktuelle tidspunktet post sonde, vanligvis fire timer, offer mus ved hjelp IACUC godkjente metoder. Se etter manglende respons etter en tå klype, og bruke en sekundær tiltak som halshugging å ofre musen. Andre tidspunkter kan også bli testet, som tallrike studier har vist at effektiviteten og tidspunktet for segta over epitelet er partikkel avhengig 38,39.
  2. Lå musen med magen fullt eksponert og sterilisere mageområdet ved sprøyting med 70% EtOH. Lag en tverrgående snitt gjennom pels og hud med saks, være forsiktig for ikke å skade noen interne vev. lirke manuelt snittet åpner videre for å eksponere peritoneum, den tynne serøse slimhinnen som dekker abdominal organer. Løft forsiktig bukhinnen og gjøre en tverrgående snitt å avsløre tarmen.
  3. bruke nøye sløv tang for å erte tynntarmen bort fra tarmens arterier, fett og andre vev. Utsette tynntarmen fra magen, i den øvre venstre kvadrant av abdomen mus, til cecum, er stor lomme av tarmvevet ved starten av tykktarmen.
  4. Isoler Peyers patcher ved å se etter 1-3 mm grovt sirkulære flekker av ugjennomsiktig vev langs tynntarmen (figur 7). Ved hjelp av buede disseksjon SCISsorer, klippe bort kuppelen på Peyer sin lapp, slik at marginene for å sikre at ingen av de omkringliggende lamina propria samles.
    MERK: De fleste mus har mellom 4-8 lett synlige Peyers patcher. Utfører prosedyren i et område med direkte overhead belysning vil øke brukervennligheten som Peyers patcher kan visualiseres.
  5. Samle dissekert Peyers patcher i fullstendig Iscove modifiserte Dulbeccos media (IMDM).
    NB: Det er viktig å bruke steril teknikk og inkluderer antibiotika i samlingen media for å hindre gastrointestinal bakteriell forurensning av gjær platene.
  6. Strain Peyers lapper gjennom en 40 mikrometer celle sil for å fjerne samling media. Vask Peyers flekker med frisk fullstendig IMDM enn en 50 ml tube og bruke et stempel fra en 1 ml sprøyte til å forsiktig bryte opp Peyers patcher. Pellet anstrengt cellene ved sentrifugering ved 1800 rpm i 7 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene iet endelig volum på omtrent 100 pl.
  7. Påfør anstrengt celler på selektive gjær medier og bruk en plate spreader å fordele celler. Vikle platekantene i Parafilm og inkuber platene opp ned på 30 ° C i 2 dager for å tillate vekst av enhver levedyktig gjær utvinnes fra den murine Peyers lapper.
    MERK: Videre studier etter utvinning av gjær fra Peyer 'patcher er nødvendige for å bekrefte at stammene er i stand til å levere brettet skikkelig heterologe protein til disse immun vev. Som beskrevet i 2.1.14, kan slike metoder omfatter immunblotting, ELISA, eller fluorescens mikroskopi for å påvise fluorescerende proteiner som GFP 2,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering av en overlevelseskurve etter UV-bestråling krever plettering av fortynnede gjærceller, slik som forskjellige kolonidannende enheter (CFU) er i stand til å danne. Hver 500 pl prøve oppsamlet som beskrevet ovenfor, inneholder ca. 5 x 10 6 celler; imidlertid, er større enn 100 kolonier per plate er vanskelig å nøyaktig skille. Plating ufortynnet prøve samt serielle 1:10 fortynninger av bestrålte celler dermed sørger for at CFU kan være nummerert ved hver UV-dose, som vist i figur 1. Den CFU teller, multiplisert med fortynningsfaktoren, blir deretter dividert med det totale antall opprinnelige bestrålte cellene i hver 500 pl prøve for å bestemme prosent overlevelse ved hver dose. Figur 2 viser den beregnede prosent av diploide villtype S. boulardii celler i stand til å overleve 0 μJ, 5000 μJ, 10000 μJ, 15000 μJ, 20000 μJ, 22500 μJ, 25000μJ, 35000 μJ, og 50000 μJ. Disse data etablerer en klar kurve som kan anvendes for å finne den dose som tilsvarer 50% overlevelse.

Etter seleksjon av UV-dose og bestråling av gjærceller, er det avgjørende å skjerm mutante kolonier for å bekrefte mangelen på en funksjonell auxotrof markør-gen. Anvendelse av et utvalg fremgangsmåten, som er beskrevet i 1.2.3.1 og vist på figur 3, øker effektiviteten av fenotype bekreftelse betydelig. Vist er et eksempel på URA3 utvalg som utnyttet konvertering av 5-FOA til toksinet 5-FU ved intakt URA3. Analoge tilnærminger er tilgjengelig for LYS2 og LYS5, TRP1, og MET2 og MET15 og øke effektiviteten i utvalg for disse mutasjonene. Hensyn må tas for å velge individuelle kolonier under screening. Den jevn vekst av mutante kolonier på YPD og 5-FOA, men ikke uracil -, plater .indikatoreres auxotrofe fenotype.

Figur 4 viser transformasjon effektivitet for villtype S. boulardii (Sb) i forhold til et vanlig laboratorie S. cerevisiae stamme (Sc) med både LiOAc (LiOAc) og electroporation (elektro) teknikker. Selv LiOAc transformasjon er svært effektiv for S. cerevisiae, transformasjon effektivitet for S. boulardii er sterkt forbedret ved hjelp av elektroporering. Figur 5 viser bruk av fluorescens mikroskopi som et eksempel metode for å analysere riktig protein ekspresjon fra transformert gjær. Lysfelt (A) og fluorescens (B) er vist for S. cerevisiae transformert med et plasmid som koder GFP URA3, noe som viser funksjonell ekspresjon av heterologt protein fra den transformerte gjær. Celler kan immobiliseres for bedre visualisering ved hjelp av dekkglass belagt i concanavalin A (strøk 5 ul av en 2mg / ml stamløsning i vann på hver 22 x 22 um dekkglass og lufttørk).

Figur 6A viser en C57BL / 6 mus holdt like før oral sonde. Hånden griper rygg og nakke av musen fast slik at musen ikke er i stand til å bevege hodet i alle retninger. Dette holder gjør at sonde nål skal plasseres nøyaktig og med redusert risiko for vevsskade. Figur 6B viser sonde nålen holdes etter at musen svelger sonde nål. Etter inkubasjonsperioden, bør tynntarmen av de avlivede mus omhyggelig revet løs fra omgivende vev, slik som vist i figur 7. Denne manipulasjon muliggjør enkel identifisering av Peyers lapper og for ren disseksjon av lappen uten å samle noe av det omgivende lamina propria. Til slutt viser figur 8 typisk utvinning av levedyktig gjær CFU fra Peyers patcher. Solutions Gjær Media og Plates Transformation Reagenser Polyetylenglykol (PEG) 50%: YPD: TE / LiOAc: 250 g PEG 3350 20 g pepton 50 ml 10x TE 500 ml sterilt vann 20 g dextrose 50 ml 10x (1M) LiOAc filter sterilisere 10 g gjærekstrakt 400 ml sterilt vann 1 L vann filter sterilisere autoklav TE 10x: YPD plater: PEG / TE / LiOAc: 100 mM Tris 20 g pepton 400 ml 50% PEG 10 mM EDTA 20 g dextrose 50 ml 10x TE pH til 7,5 og filter sterilisere 20 g agar 50 ml 10x (1M) LiOAc 10 g gjærekstrakt 1 L vann autoklav 20% glukose: Uracil - selektive medier Carrier DNA (SS DNA): 200 g dextrose 2 g aminosyre blanding mangler uracil Oppbevar ved -20 ° C og før bruk varme for 1-2 minutter ved 100 ° C for å smelte fibrene og lagres på is 1 L vann 6,7 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer filter sterilisere 1 L vann <tr> Steriliser ved autoklave eller steril filtrering Legg 20% ​​glukose 01:10 før bruk 50% glycerol: Uracil - plater: Electroporation buffer: 500 ml glyserol I en 250 ml kolbe: 1 M sorbitol 500 ml vann 2 g aminosyre blanding mangler uracil 1 mM CaCl2 autoklav 6,7 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer Fyll med destillert vann 150 ml vann Autoklav og oppbevares ved 4 ° C I en 2 liters kolbe: 20 g agar 750 ml vann Autoklaver kolber separat, og bland sammen med 100 ml 20% glukose komplett IMDM 5-FOA + plater: LiOAc / DTT 500 ml Iscove modifiserte Dulbeccos Media Autoklaver i en 2 liters kolbe: 0,1 M LiOAc 5 ml penicillin streptomycin glutamin 100x 20 g agar 10 mM DTT 500 pl 2-merkaptoetanol 750 ml vann 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum Blande: 2,5 ml natriumpyruvat 100 mM 6,7 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer 2 g aminosyre blanding uten uracil 150 ml varmt vann Når kjølig, legge til: 0,05 g uracil pulver 1 g 5-FOA Rør og filter sterilisere Legg til autoklaveres agar løsning Bland med 100 ml 20% glukose

Tabell 1. Reagenser listen. Beskrevet er de reagenser som er nødvendig for å gjøre hver av oppløsningene, gjær media og plater, og transformasjons buffere som brukes til protokollene i dette manuskriptet.

Figur 1
Figur 1. gjær kolonier dyrket på YPD media. Eksempel YPD plate som viser levedyktig kolonidannende enheter (CFU) av probiotic gjær etter UV-bestråling. Celler ble fortynnet i serie slik at den enkelte CFU kan skilles og telles. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Overlevelseskurven for diploid probiotisk gjær. Antall levedyktige S. boulardii CFU som en prosent av det totale belagte celler, ble plottet for hver μJ dose av UV-bestråling (heltrukket linje). Den vertikale rød linje angir μJ UV-dose som tilsvarer 50% overlevelse av denne gjærstamme. En rad1 S. cerevisiae mutant, som ikke kan reparere skader fra UV mutagenese, er vist som en kontroll (stiplet linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>

Figur 3
Figur 3. Bekreftelse på ura3 - fenotype av UV bestrålt celler på YPD, uracil - og 5-FOA plater Celler fra individuelle UV mutante kolonier ble samlet inn ved hjelp av tuppen på en steril tannpirker og forsiktig stripete over YPD, uracil -., Og fem -FOA plater. Celler ble først streket i to vinkelrette kryssende linjer, da en ny tannpirker ble anvendt for å passere gjennom den andre linje og fortsette å spre cellene til individuelle celler separat. En sann ura3 - mutant (mut) vokser på YPD medier og i nærvær av 5-FOA, men ikke i fravær av uracil. Kontroll ura3 - S. cerevisiae (ura3 -) og URA3 + sup> S. boulardii (URA3 +) er vist for sammenligning og for å bekrefte riktig forberedelse av gjær medier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Transformasjon Effektivitet av Saccharomyces stammer. Wild typen S. boulardii (Sb) og et laboratorium S. cerevisiae stamme (Sc) ble transformert ved hjelp av den beskrevne LiOAc (LiOAc) og electroporation (elektro) protokoller. Resultatene er plottet som midlere CFU oppnådd pr ug av plasmid som koder for et kanamycin-resistensmarkør. Linjer viser gjennomsnittet av duplikate eksperimenter med feilfelt som viser standardavvik av gjennomsnittet.es / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Funksjonell Protein Expression av transformerte gjær. S. cerevisiae transformert med tomt plasmid (A) og plasmid som koder GFP (B) ble analysert ved bruk av en fluorescerende mikroskop. Fluorescens i gjærceller transformert med GFP plasmid indikerer vellykket produksjon av funksjonelle GFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Forsvarlig håndtering av en C57BL / 6 mus for oral sonde. Musen er holdt tightly i den ikke-dominerende hånd med halen gjemt under den lille finger, slik at ingen bevegelse er mulig (A). Den gavage nål settes inn i svelget langs taket av munnen. Musen er tillatt å svelge pære av sonde nål, slik at løsningen deretter inn magen som stempelet er deprimert (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Utarbeidelse og disseksjon av Peyers patcher. Tynntarmen er vist dissekert bort fra de andre indre organer og vev, med piler som peker til noen av Peyers patcher. Klikk her for å se et større Versipå denne figuren.

Figur 8
Figur 8. Gjær Recovery fra Peyers Patches. Et eksempel på levedyktig CFU oppdaget etter disseksjon, homogenisering, og plating av total Peyers patch celler fra en mus gavaged med S. boulardii. Celler ble platet på YPD gjær media og inkubert ved 30 ° C i 2 dager. Typisk utbytte av CFU gjenvunnet per mus er mindre enn 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammen protokollene her beskrive de grunnleggende trinnene som er nødvendige for utvikling og testing av auxotrofe probiotiske gjærstammer for levering av heterologe terapeutiske protein til tarmen. Dette manipulasjon og testing av rekombinant probiotiske gjær krever teknikker og ressurser som ethvert individ laboratorium ikke kan nå være kjent. Derfor, selv om mange tidligere studier har beskrevet ovenfor protokoller for flere gjær og musestammer, disse metodene har ikke til forfatternes kunnskap blitt presentert i en detaljert, enhetlig form. Videre plasserer den fore manuskriptet særlig vekt på å tilpasse nåværende standardiserte protokoller for den genetiske manipulering av probiotiske gjær, som er mindre godt karakterisert enn vanlig brukte laboratoriegjærstammer. Mange fremgangsmåten for både mutagenese (omtalt i del 1) og transformasjon (del 2) må optimaliseres for manipulering av slike diploid, probiotiske gjær isolasjones. Dette manuskriptet drøfter også mulige fallgruver forbundet med dyrehåndtering (del 3) og disseksjon av Peyers patch immun vev i tynntarmen (del 4).

Så mange industrielle og klinisk relevante gjærstammer ikke er umiddelbart tilpasses til stor-skala genetisk manipulering, er det først nødvendig å generere stammer slik som auxotrofe mutanter som kan dyrkes og utvalgte uten kostbare antibiotika. UV-mutagenese er en slik metode som gir mulighet for rask ikke-spesifikk mutasjon av auxotrofe gener 7,41. Overlevelseskurven kan lett bli generert (figur 1 og 2) for å bestemme den passende dose for screening mutanter. Imidlertid fører denne tilnærmingen risiko for indusering av mål-mutasjoner som kan påvirke veksten eller andre egenskaper av gjærstamme. Målrettede knockouts kan i stedet bli generert ved hjelp av PCR konstruerer eller CRISPR / Cas9 system. Etterfølgende screening eller utvalg(Figur 3) av mutanter som gir mulighet for identifisering av auksotrof gjær. Bruk av det merkede ved utsåing på 5-FOA media, for eksempel, tillater rask eliminering av enhver gjær som fremdeles inneholder en funksjonell URA3-auxotrof genet. Når det er mulig, kan dette valget tilnærmingen være å foretrekke fremfor en skjerm, som krever analyse av alle koloniene som genereres. Med enten valg eller filtrering, derimot, er det avgjørende å utføre gjentatt strekdannelse av de enkelte gjærkolonier på selektive medier for å bekrefte auxotrof status.

Transformasjon av de genererte mutanter kan oppnås gjennom forskjellige protokoller. Selv om LiOAc transformasjon er effektiv i omdanning av mange gjærstammer, spesielt for de mest brukte laboratorie S. cerevisiae-stammer, kan alternative protokoller som for eksempel elektroporering omdanne andre gjær isolater med større effektivitet (figur 4). Hver ny stamme bør testes USIng flere protokoller for å bestemme de optimale forhold for transformasjon. Varierende inkubasjonstider og konsentrasjonen av DNA, for eksempel, kan påvirke den samlede transformasjonseffektivitet og bør testes og optimalisert for hver stamme 33.

Oral sonde gjør det mulig for levering av kontrollerte doser av disse rekombinant gjær direkte til den murine gastrointestinalkanalen, hvis immun vev kan så bli analysert for gjær og heterologt protein. Riktig oral føring teknikk (figur 6) er avgjørende for å minimalisere ubehag dyr og øke eksperimentell nøyaktighet. Videre Peyers patcher er viktige områder for å vurdere opptak av rekombinant gjær fra tarmen. Disse klynger av immun vev er viktige områder av antigen prøvetaking og induksjon av slimhinneimmunresponser. Store antigener, inkludert gjær 3-6 mikrometer i diameter, er mest sannsynlig å bli tatt opp av M-cellene i Peyers lapper for å krysse gastrointestinal epitel og samhandle med immunceller. Hensyn må tas når dissekere Peyers patcher for å sikre at bare celler innenfra lappen i stedet for tarmlumen eller lamina propria er samlet (figur 7). Ytterligere tiltak må også tas etter disseksjon å vurdere riktig ekspresjon og funksjon av heterologt protein i den utvunnede gjær (figur 8). Fremstilling av total protein fra gjær lysater og immunblotting er en standardmetode for å vurdere proteinekspresjonen; Men ikke denne tilnærmingen ikke gi informasjon om proteinfolding og funksjon. For å vurdere protein funksjon, kan gjær transformeres med et plasmid som koder GFP og analysert under et fluorescerende mikroskop etter utvinning fra Peyers lapper for å vurdere funksjonell GFP uttrykk (figur 5).

I sum viser dette manuskriptet et enhetlig sett med detaljerte eksperimentelle protokoller spenner trinn from generering av auxotrofe mutanter til utvinning av probiotiske gjær fra den murine tarmen. Ved å sammenstille protokoller som ikke tradisjonelt faller innenfor et enkelt område av kompetanse, vil disse beskrivelsene lette videre studier testing immunologiske reaksjoner på probiotiske gjær utformet som muntlig stoff levering vektorer. Forfatterne håper denne studien vil oppmuntre til diskusjon og fremme optimalisering av eksperimentelle metoder for hver gjærstamme testet, banet vei for de mest effektive tilnærminger til utvikling av nye, probiotiske-baserte rekombinante terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner finansiering gjennom Barnas senter for immunologi og vaksiner og en NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) tildelt Tracey J. Lamb. Forfatterne takker også Natalya P. Degtyareva for den generøse bidrag rad1 S. cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73, (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9, (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41, (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32, (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5, (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23, (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153, (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1, (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30, (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8, (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49, (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34, (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38, (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197, (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118, (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14, (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67, (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13, (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1, (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71, (1), 312-319 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics