Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Hier voorgesteld is een enkelvoudige beschrijving van technieken die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen, veranderen, beheren en testen heterologe eiwitexpressie van de probiotische gist Saccharomyces boulardii.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Probiotische micro- organismen een intrigerende potentieel middel efficiënt en economisch afleveren heterologe eiwitten aan het maagdarmkanaal. Deze organismen kunnen overleven passage door het maagdarmkanaal nog niet koloniseren 1, waardoor geregelde dosering en beperken van de blootstelling aan het geneesmiddel expressie. Bovendien de mogelijkheid om eenvoudig manipuleren deze organismen heterologe eiwit op grote schaal maakt ze een voordelig alternatief voor synthetische levering deeltjes. Echter, de ontwikkeling van een dergelijke benadering, zoals onlangs aangetoond met een auxotrofe stam van het probiotische gist Saccharomyces boulardii 2, vereist kennis van laboratoriumtechnieken gewoonlijk niet gecombineerd tot een bepaald onderzoek, van gist en moleculaire biologie dier behandelingstechnieken en immunologische werkwijzen. Hoewel dus de hierin beschreven afzonderlijke procedures op zichzelf niet nieuwlaboratoriumprotocollen het doel van dit manuscript is om een ​​uniforme inleiding technieken die nodig zijn voor experimentele testen van probiotische gist geneesmiddelafgiftedragers met het muize maagdarmkanaal aanwezig. Verschaft wordt een compilatie van essentiële protocollen: 1) productie van auxotrofe mutante giststammen die gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd; 2) transformatie van gist culturen heteroloog eiwit tot expressie brengen; 3) toediening van recombinant gist de darm via orale gavage; en 4) het herstel van levensvatbare recombinant probiotische gist uit de muizen darm en beoordeling van hun heterologe eiwitexpressie.

Eerst, hoewel talrijke positieve en negatieve selectie methoden bestaan ​​voor het manipuleren van gistsoorten, negatieve selectie bijvoorbeeld door het gebruik van auxotrofe merkers verhoogt de efficiëntie en het gemak waarmee gist kan worden getransformeerd en geselecteerd. Positieve selectie van transformanten het gebruik van antibiotica, in samenwerkingntrast, verhoogt de kosten van gist manipulatie. Bovendien kan selectie van gist op antibiotica bevattende vaste media zorgen voor meer groei van getransformeerde achtergrond kolonies ten opzichte van selectie van auxotrofe gist over synthetische drop-out vaste media (niet gepubliceerde waarnemingen). Auxotrofe gist stammen die enzymen die kritisch zijn voor de synthese van essentiële aminozuren of uracil ontbreekt. Dergelijke gist kan alleen groeien als aangevuld met de ontbrekende metaboliet of metabole gen, waardoor negatieve selectie wanneer gist wordt uitgeplaat op synthetische drop-out media dat de essentiële metaboliet ontbreekt. Veel veelgebruikte Saccharomyces cerevisiae laboratoriumstammen zijn in feite al auxotrofe mutanten 3. Industriële, klinische en probiotische giststammen zijn echter meestal prototrofe met de mogelijkheid om alle benodigde voedingsstoffen synthetiseren. Efficiëntere genetische manipulatie van dergelijke gist mogelijk te maken, kunnen auxotrofe genen selectief worden gerichtstammen die kunnen worden geselecteerd zonder antibiotica te genereren. Specifiek richten auxotrofe merker genen kan worden bereikt door PCR gemedieerde genverstoring beroep op homologe recombinatie of recenter tot CRISPR / Cas9 targeting 4-6. Als alternatief kunnen UV-mutagenese snel genereren auxotrofe mutanten zelfs in giststammen die transformatie met meerdere plasmiden is technisch moeilijk 7. Terwijl PCR targeting en CRISPR / Cas9 zijn uitgebreid elders zijn beschreven, gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript is een gedetailleerd protocol beschrijft een UV-mutagenese benadering van auxotrofe stammen die zal zorgen voor negatieve selectie in plaats van positief antibiotische selectie van gist-transformanten te creëren.

De volgende noodzakelijke stap in het gebruik van dergelijke auxotrofe stammen voor orale afgifte van heteroloog eiwit gist transformatie met plasmide-DNA. Sinds de eerste succesvolle transformatie van yeast sferoplasten gerapporteerd voor Saccharomyces cerevisiae in 1978 8, zijn talrijke wijzigingen gekarakteriseerd om de efficiëntie en het gemak waarmee gistsoort genetisch kunnen worden gemodificeerd. Gebruik van elektroporatie voor de succesvolle transformatie van DNA in S. cerevisiae werd eerst beschreven in 1985 9 en is sindsdien verbeterd via de toevoeging van 1 M sorbitol incubatie osmotisch steuncellen 10. Electroporatie efficiency is bovendien aangetoond dat afhangen van de gistsoort en stam celaantal en groeifase, elektroporatie volume, veldsterkte en specifieke buffers 11. Lithiumacetaat (LiOAc) transformatie, oorspronkelijk beschreven door Ito et al. 12, is een van de meest gebruikte transformatie protocollen zoals vereist geen speciale apparatuur. Aanvullende analyses toonden aan dat de efficiëntie van LiOAc gist transformatie verhoogt wanneer cellen worden verzameld in mid-log-fasegroei en worden warmteschok in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG) en DNA bij 42 ° C 12. Incubatie van intacte gist geheel met PEG is essentieel voor efficiënte transformatie, mogelijk door verbetering bevestiging van DNA aan het celmembraan en via andere effecten op het membraan 13. Lithium zelf verhoogt ook de permeabiliteit van intacte cellen 14. Hoewel de meeste laboratorium S. cerevisiae stammen kunnen gemakkelijk worden omgezet middels LiOAc transformatie 3, kunnen andere gistsoorten efficiënter omgezet alternatieve protocollen. Pichia pastoris, bijvoorbeeld, is het meest efficiënt omgezet via elektroporatie plaats LiOAc transformatie 13. Het is cruciaal derhalve testen meerdere methoden voor transformatie en incubatieperiode en reagens concentraties te optimaliseren bij een poging om genetisch te modificeren een uncharacterized giststam. Dit manuscript beschrijft dus zowel LiOAc transformation en elektroporatie als technieken voor de transformatie van auxotrofe mutant en wildtype S. boulardii. Geïnteresseerde lezers zijn gericht op de recente beoordelingen voor een grondige beschrijving van de evolutie van gist transformatie, alternatieve protocollen, en de verdere discussies over mogelijke werkingsmechanismen 13,15. Transformatie van gist met plasmide dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit ook van groot belang voor stroomafwaartse testen teneinde juiste expressie en functie van heteroloog eiwit te garanderen. Talloze verschillende eiwitten kunnen worden geselecteerd afhankelijk van het uiteindelijke doel van de therapeutische studie en de voor eiwit detectie antilichamen door immunoblotting, ELISA en andere technieken. Protocollen voor deze technieken zijn uitvoerig beschreven elders 16,17 en kunnen worden gebruikt om niveaus van heterologe eiwitproductie uit getransformeerde gist te bepalen in vergelijking met standaard curves. Voor demonstratiedoeleinden en tonensuccesvolle productie van een zeer algemeen gebruikte eiwit in gist biologie, dit manuscript geeft transformatie met plasmide dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP), waardoor voor daaropvolgende detectie middels fluorescentiemicroscopie.

Even belangrijk voor de productie van probiotische organismen die tot expressie heteroloog eiwit goed beheer en detectie van deze micro-organismen in het maagdarmkanaal weefsels, zoals uiteengezet onder drie en vier. Toediening van recombinant gist via orale sondevoeding maakt afgifte van gecontroleerde hoeveelheden gist direct in de maag, waar C57BL / 6-muizen van nature niet in staat 18 braken. Echter, ongepaste dierlijke behandeling en sondevoeding leiden tot slokdarmkanker schade en perforatie, maagperforatie, tracheale administratie en aspiratiepneumonie 19,20. Slechte techniek en onervarenheid kan verder toenemen variabiliteit in muizen immuunreacties en experimentele results, die zijn toegeschreven aan dierlijke nadruk op orale gavage 21,22. Praktijk de juiste techniek kan derhalve niet alleen ongemak verminderen dier, maar ook precisie van experimentele resultaten verhogen. Dit manuscript beschrijft en demonstreert dierlijke behandeling en orale sondevoeding voor het beheer van gecontroleerde doses van recombinant gist.

Tenslotte is het essentieel om succesvolle uitvoering van recombinante gist bevestigd door analyse lymfoïde weefsels op de aanwezigheid van gist en heteroloog eiwit. Het maag immune weefsels die het gemakkelijkst en voorspelbaar voor de vinding onderzocht zijn de plaques van Peyer. Peyer's patches zijn secundaire lymfoide organen langs de dunne darm dat de belangrijkste bezienswaardigheden van mucosale immuunrespons inductie 23 zijn. Antigenen uit de lumen worden overgedragen via transcellulair microfold (M) cellen in het epitheel en vrijkomen in de plaques van Peyer, aldus blootstellen omsluitend antigeenpresenterende cellen luminale inhoud intestinale. Hoewel deeltjes opname door de intestinale epitheel ook kan worden bereikt door slijmbekercellen werden deze cellen is aangetoond dat alleen van deeltjes kleiner dan 0,02 pm in diameter 24. Transepithele dendrieten verlengd van CD103 + dendritische cellen (DC) ook van kleine deeltjes uit het darmlumen 25; Er zijn echter nog geen rapporten die aantonen dat CD103 + DCs nemen deeltjes groter dan bacteriën. Aldus intact probiotische gist, van gemiddelde grootte tussen 3-6 pm in diameter, hoogstwaarschijnlijk door M-cellen worden genomen en overgedragen aan de plekken van Peyer. Hier beschreven is een protocol voor het verzamelen en screening van plaques van Peyer van levensvatbare recombinante gist, alhoewel deze procedure ook gemakkelijk kan worden aangepast voor de evaluatie opname van probiotische bacteriën.

Kortom, de beoordeling recombinante probiotische gist voor de levering van derapeutic eiwitten naar de darm vereist vaardigheid in laboratoriumtechnieken verspreid over de moleculaire biologie van dieren handling en immunologie. hier gepresenteerde zijn protocollen voor 1) het genereren en screenen van auxotrofe giststammen die gemakkelijk kan negatief zonder antibiotica worden geselecteerd, 2) alternatieve protocollen om gist te transformeren en in staat de expressie van heteroloog eiwit, 3) demonstraties van de juiste behandeling van dieren technieken en orale sondevoeding voor intragastrische levering van recombinante gist, en 4) protocollen voor Peyer's patch dissectie en screenen op levensvatbare recombinante gist en functioneel heterologe eiwitten. Samen zullen deze protocollen zorgen voor het genereren en testen van een probiotische giststam kan leveren heteroloog therapeutisch eiwit aan het maagdarmkanaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. UV Mutagenese aan auxotrofe giststammen genereren

  1. Genereer survival curves om de benodigde dosis UV-straling te bepalen
    1. Bereid YPD (gistextract pepton dextrose) media en andere reagentia in Tabel 1 opgesomde volgens standaardprocedures 26 en beënt enkele kolonies in 5-10 ml YPD-medium. Incubeer kweken op een roller trommel bij 30 ° CO / N tot verzadiging minstens 8 uur.
    2. Bepaal de celconcentratie van O / N culturen met een spectrofotometer cellen door verdunning 1:10 in water in een plastic cuvet. Verdun cellen tot een concentratie van 10 7 cellen / ml in 20 ml steriel gedestilleerd water.
    3. Giet cellen verdund in een steriele plastic petrischaal en met verwijderde deksel, plaatst de plaat 14 cm onder een UV-lamp.
    4. Blootstellen cellen seriële uJ 5000 en 10.000 uJ doses UV bestraling, het extraheren 500 gl cellen na elke toename zodat cellenbemonsterd na blootstelling aan 0 uJ, 5000 uJ, uJ 10.000, 15.000 uJ, uJ 20.000, 25.000 uJ, uJ 30.000, 40.000 uJ en 50.000 uJ van UV bestraling. Transfer gewonnen cel monsters steriel 1,5 ml buizen en serieel verdund om 1:10 stappen in steriel water.
    5. Pellet cellen in elke verdunning door centrifugatie in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 min. Aspireren supernatant en resuspendeer in 100 ul volume steriel water geschikt is voor uitplaten gistcellen. Pipetteer de volledige omvang van de geresuspendeerde cellen op platen met YPD vaste media en het gebruik van een steriele spreader gelijkmatig cellen verdelen over elke plaat.
    6. Wikkel plaatranden in Parafilm om uitdroging van de media en de afdekplaten voorkomen in aluminiumfolie om foto-reactivering en reparatie van UV-geïnduceerde mutaties te voorkomen. Incubeer de platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen om de groei van de levensvatbare gist kolonies (figuur 1).
    7. Tel de number van de kolonies, eventueel met de hulp van een pen om af te bakenen geteld kolonies, een draagbare elektronische teller pen, of een teller staan ​​met vergroting. Plot als percentage van de totale cellen uitgeplaat bij elk uJ dosis UV-bestraling een overlevingscurve voor bestraalde gist (Figuur 2) opwekken.
      OPMERKING: haploïdegiststammen kan worden verwacht dat lagere doses UV bestraling opzichte van diploïde stammen nodig om hetzelfde percentage overleving bereikt. Een stam van gist die functionele DNA herstel enzymen, zoals Rad1 S. cerevisiae mutant, kan worden gebruikt als een positieve controle voor de aanwezigheid van UV bestraling bij zeer lage doses geven.
    8. Bepaal de dosis UV mutagenese worden gebruikt voor het screenen onder verwijzing naar de overlevingscurve in 1.1.7 vastgesteld. De x-waarde van het punt langs de overlevingscurve waarbij y gelijk 50 is de UV straling dosis waarbij 50% gist overleeft. Screening mutanten in dit lage percentage overleving kan eenhogere opbrengst aan succes gemuteerde stammen, met name voor diploïde gist. De dosis van 50% overleving voor WT S. boulardii, zoals getoond in figuur 2, is ongeveer 18.000 uJ.
      Opmerking Hoewel zulke hoge UV doses verhogen de kans op mutaties in genen anders dan de auxotrofe marker gen van belang cellulaire routes, moet dit nadeel afgewogen tegen de noodzaak om mutaties in beide kopieën van de auxotrofe merker gen induceren. Op haploïde stammen die op één genkopie worden gemuteerd, screening op een hoger percentage overleving, bijvoorbeeld bij 90%, vermindert het risico van aanvullende mutaties en toch zorgt voor voldoende vorming van auxotrofe mutanten.
  2. UV mutagenese en screening op auxotrofe giststammen
    1. Bereid gist zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.1.3.
    2. Expose gist de dosis UV-straling die overeenkomt met 50% overleving, zoals bepaald in 1.1.8. Voor WT S. boulardii, deze dosis was vastbesloten ongeveer 18.000 uJ (figuur 2) zijn.
    3. Verzamel 1 ml hoeveelheden UV bestraalde gist en pellet door centrifugeren in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 min. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in 100 pi steriel water.
      1. Selectie van mutanten
        1. Bij gebruik van selectie zoals bij ura3 - auxotrofe mutanten, plaat bestraald gist op media die 5-fluororotinezuur (5-FOA) om te selecteren op cellen die een functioneel Ura3 enzym.
          OPMERKING: gist die functionele kopieën van Ura3 zal 5-FOA converteren naar het toxine 5-fluorouracil, wat leidt tot celdood en zorgen voor gemakkelijke selectie van ura3 - kolonies die een functionele Ura3 27 ontbreken. Analoge selectie benaderingen mogelijk voor de LYS2 en LYS5, TRP1 en MET2 en MET15 markers met behulp van media die α-aminoadipinezuur 28; 5-fluorantranilzuur 29; en methylkwik 30,31, respectievelijk.
        2. Pipetteer 100 ul geresuspendeerde cellen op minimaal medium dat 5-FOA en een steriele strooier gelijkmatig bekleden van de plaat. Wikkel platen in Parafilm en incubeer kop bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen om de groei van de levensvatbare gist kolonies.
        3. Bevestigen ura3 - fenotype van elke kolonie die op 5-FOA platen door opnieuw uitstrijken op YPD, uracil - en 5-FOA platen (figuur 3). Gebruik de punt van een steriele tandenstoker om een deel van een enkele kolonie verzamelen en zachtjes sleep de cellen over verse YPD, uracil - en 5-FOA-platen. Opnieuw incubeer verpakt platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
          OPMERKING: Levensvatbare kolonies verschijnen als verhoogd, ruwweg ronde gezwellen terwijl niet levensvatbare cellen wordt alleen als een ondoorzichtige vlek zonder verhoogde gezwellen (figuur 3).
      2. screening mutanten
        1. Wanneer het genereren van een auxotrofe mutant waarvoor selectiemethoden niet beschikbaar zijn, bereiden seriële verdunningen van 1:10 UV bestraalde gistcellen in steriel water en de pipet verdunningen op YPD medium, met een steriele spreader gelijkmatig bekleden van de plaat.
        2. Wikkel platen in Parafilm en incubeer kop bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen. Bepaal welke verdunning termijn voor groei van individuele kolonies die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van elkaar, meestal niet meer dan ongeveer 100 kolonies per plaat.
        3. UV herhaalde mutagenese gist monsters zoals beschreven in 1.2.1-1.2.3 en plaat cellen op die bepaalde verdunning. Pipetteer de verdunde gist YPD medium op een steriele spreider om de cellen te verdelen, en incubeer verpakte platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
        4. Scherm voor auxotrofen door replica plating op selectieve media ontbreekt het metaboliet van belang. In de eerste plaats zorgen voor een steriele fluwelen kussen op een bord standen keren de plaat met UV bestraald kolonies op de fluwelen, het markeren van de plaat oriëntatie.
        5. Vervolgens keren een frisse plaat ontbreekt de metaboliet van belang op de fluwelen en lichtjes aandrukken om cellen te brengen van de fluwelen aan de plaat. Bewaar de originele plaat staan ​​bij 4 ° C. Wikkel en incubeer de nieuwe plaat op zijn kop bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
        6. Als alternatief voor replica plating, scherm mutanten door het opnieuw uitstrijken van kolonies op YPD selectieve media. Gebruik de punt van een steriele tandenstoker om een ​​deel van een enkele kolonie verzamelen en zachtjes sleep de cellen over een verse YPD plaat en een plaat zonder de metaboliet van belang. Opnieuw incubeer verpakt platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
          OPMERKING: Zorg moet worden genomen om enkele kolonies en streak uit kolonies meerdere keren selecteren om een ​​homogene populatie van ware auxotrofe cellen bevestigen.
    4. Verder bevestigt het fenotype van bestraalde cellen door inoculating enkele kolonies in 5-10 ml van zowel YPD en media die niet over de juiste metaboliet (bijvoorbeeld in uracil - media voor een URA3 - mutant). Incubeer op een roller trommel bij 30 ° CO / N om de groei van cellen in YPD medium maar niet bevestigd in de afwezigheid van de metaboliet.
      Opmerking Hoewel groeipatronen op vaste media duidelijk auxotrofe gist status moet geven, is het mogelijk dat sommige gist spanningen verdragen en vormen kleine, langzaam groeiende kolonies op vaste media, maar toch dezelfde omstandigheden in vloeibaar medium (ongepubliceerde waarnemingen) tolereren. Enting in vloeibare kweken moet dus worden uitgevoerd om grondig te bevestigen groeipatronen van UV bestraald mutanten.
    5. Voor opbergen van bevestigde auxotrofe mutanten termijn bereiden glycerol voorraden door inoculeren cellen in 10 ml YPD en incuberen op een roller trommel O / N bij 30 ° C. Pellet cellen door centrifugeren gedurende 3 min bij 2500 xg en zuig media. Resuspendeer cellen in 50%steriel gefiltreerd glycerol, overbrengen naar een cryoflesje en bewaar bij -80 ° C.
      LET OP: UV gemutageniseerd gist mogelijk mutaties bevatten anders dan in de auxotrofe marker van belang meerdere genen. Alvorens verder gebruik van geverifieerde auxotrofe mutanten moeten deze stammen verder geanalyseerd door middel van genetische sequentie en evaluatie van de weerstand tegen pH galzuur spanningen en andere kenmerken probiotische stammen relevant, zoals elders 2 beschreven. Daarnaast is het gebruik van pcr homologie of CRISPR / Cas9 targeting selectiever muteren auxotrofe merkers dienen als alternatief voor UV mutagenese 4 worden beschouwd - 6.

2. Gist Transformatie

  1. LiOAc Transformatie van gist
    1. Inoculeer enkelvoudige gistkolonies in 5-10 ml YPD medium en incubeer op een roller trommel bij 30 ° CO / N.
    2. Om log-fase groei induceren en efficiëntie van plasmide opname verhogen, determine celconcentratie met een spectrofotometer een 1:10 verdunning van cellen in steriel water te meten in een plastic cuvet. Verdun O / N kweken tot een OD 600 van 0,16-0,2 (ongeveer 2 x 10 6-2,5 x 10 6 cellen / ml) in 50 ml vers warm YPD en incubeer cellen op een orbitale schudinrichting ingesteld op platform 200 rpm totdat de kweek er ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml, gewoonlijk ongeveer 4 uur.
      OPMERKING: Transformatie efficiëntie kan worden gemeten als een functie van het aantal met succes getransformeerde gist kolonievormende eenheden (CFU) per ug plasmide DNA. Verhoogde efficiëntie resultaten meer getransformeerde kolonies per ug plasmide DNA. Subcultuur gistcellen en collectie tijdens log-fase groei is een factor die transformatie-efficiëntie 12 toeneemt.
    3. Pellet cellen door centrifugeren bij 2500 xg gedurende 3 min.
    4. Zuig het supernatant en overdracht cellen een 1,5 ml microcentrifugebuis door resuspenderen de Pellet in 1 ml steriel water.
    5. Pellet cellen door centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 1 minuut in een microcentrifuge, zuig de supernatant en was cellen door resuspenderen in 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) buffer.
    6. Herhaal centrifugeren en hersuspenderen cellen in TE / LiOAc buffer tot een concentratie van 2 x 10 9 cellen / ml.
    7. Bereid transformatie mengsels met elk van de volgende: 50 gl van bereide gist in TE / LiOAc buffer, 5 pl drager-DNA (10 ug / ul) en 1 pi plasmide-DNA (1 ug). Microgram plasmide-DNA kan worden getitreerd toenemende hoeveelheden DNA al dan niet leiden tot een verhoogde transformatie-efficiëntie 32
      OPMERKING: Voor een mutante giststam die één auxotrofe marker kan slechts één plasmide coderend voor de markering worden omgezet per monster. Verder gebruik van een plasmide dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit zoals GFP, zal zorgen voor een efficiënte bepaling van juiste vouwing en expressie van heterologe protein de giststam na transformatie.
    8. Om elke bereiding, voeg 300 ul van PEG / LiOAc / TE en vortex grondig. Incubatie van intacte cellen met PEG is essentieel voor een efficiënte transformatie 13.
    9. Incubeer preparaten bij 30 ° C gedurende 30 minuten onder roeren door het plaatsen microcentrifugebuizen in een bekerglas geplaatst op een orbitale schudinrichting bij platform 200 rpm.
    10. Voeg 35 ul DMSO aan elk reactiemengsel en heat shock cellen gedurende 15 min in een 42 ° C waterbad. Hoewel er tegenstrijdige verslagen van de extra voordeel van DMSO 33 is hitteschok van intacte gistcellen aangetoond transformatie-efficiëntie 12 sterk toenemen.
    11. Was de cellen door pelleteren via centrifugeren als in 2.1.5, opzuigen of pipetteren uit de bovenstaande vloeistof, en resuspenderen in 1 ml steriel water. Voorzichtig pipet op en neer te breken van de cel pellet.
      NB: Het is belangrijk om grondig te verwijderen van de bovenstaande vloeistof, omdat de media gebruikd in het genereren van competente cellen kunnen gistgroei en kolonievorming remmen.
    12. Herhaal cel pelleteren zoals in 2.1.5, zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 pi steriel water. Pipetteer de volledige volume op een selectieve plaat en gebruik een steriele spreader gelijkmatig de vacht van de plaat met getransformeerde gist.
    13. Wikkel randen van beklede platen in Parafilm om uitdroging van media voorkomen en incubeer kop bij 30 ° C gedurende 2 dagen om de groei van getransformeerde gistcellen. Succesvolle, efficiënte transformatie en auxotrofe selectie van Saccharomyces cerevisiae levert een groot aantal kolonies per transformatie preparaat hoewel veel lagere opbrengst van andere stammen (figuur 4) kan zijn.
    14. WINKEL gist platen voor de korte termijn (gewoonlijk 1-3 weken) ondersteboven en bedekt bij 4 ° C. Bereid glycerol voorraden van getransformeerde gist zoals beschreven in 1.2.5 voor de lange termijn opslag.
      LET OP: Verdere studies testen getransformeerd CFU nodig om plasmidestabiliteit bepalen en juiste expressie van heteroloog eiwit te evalueren. Grondige beschrijving van plasmidestabiliteit 34, gebruik van immunoblotting gedenatureerde eiwitten gewonnen uit celmonsters 17 detecteren, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) te detecteren goed gevouwen driedimensionale eiwitten 16 en het gebruik van GFP in gist studies 35 elders beschikbaar. Figuur 6 toont een representatief beeld van succesvolle GFP expressie in getransformeerde S. cerevisiae opzichte van getransformeerde cellen. Gebruik van een dergelijk fluorescerend eiwit is een middel efficiënt bepalen van succesvolle heterologe eiwitproductie.
  2. Elektroporatie van gist
    1. Inoculeer enkelvoudige gistkolonies in 5-10 ml YPD medium en incubeer op een roller trommel bij 30 ° CO / N.
    2. Bepaal celconcentratie met een spectrofotometer een 1:10 verdunning van cellen in steriel water te meten. diluit O / N culturen in 100 ml verse warme YPD media om een OD 600 equivalent van ongeveer 0,3. Incubeer subculturen bij 30 ° C op een orbitale platform shaker ingesteld op 200 rpm tot het bereiken van een OD 600 van ongeveer 1,6, gewoonlijk 4-5 uur. Elk 100 ml subcultuur genoeg cellen twee transformatiereacties geconditioneerd genereren.
    3. Pellet cellen door centrifugeren bij 2500 xg gedurende 3 min. Zuig het supernatant en was de cellen door resuspenderen in 50 ml ijskoud steriel water. Herhaal het wassen door pelleteren cellen, aspireren supernatant en resuspenderen in vers 50 ml ijskoud steriel water.
    4. Pellet de cellen opnieuw af en resuspendeer in 50 ml ijskoude elektroporatie buffer (1 M sorbitol, 1 mM CaCl2).
    5. Herhaal draaien als in 2.2.3, aspireren supernatant en resuspendeer cellen in 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Incubeer celsuspensie op een roller trommel bij 30 ° C gedurende 30 minuten. Voorincubatie van cellen in LiOAc en DTT synergetisch verhoogt deefficiëntie van elektroporatie 36.
    6. Pellet de cellen als in 2.2.3, verwijder supernatant, en was door resuspenderen in 50 ml ijskoude elektroporatie buffer. Herhaal centrifugeren en hersuspenderen cellen in ijskoude elektroporatie buffer tot een eindvolume van 1 ml.
    7. Voor te bereiden op het ijs: airconditioning gistcellen, steriele elektroporatie cuvetten en plasmide DNA. Onmiddellijk na uiteindelijke hersuspenderen van de cellen in 1 ml elektroporatie buffer voorziene Combineer 400 pi voorziene gistcellen met ongeveer 1 pg plasmide DNA en voeg aan een ijskoude 0,2 urn elektroporatie cuvet. Toepassing van grotere hoeveelheden DNA kan iets toenemen transformatie-efficiëntie 11. Incubeer reactie op ijs gedurende 5 minuten, dan electroporate met electroporator ingesteld op 2,5 kV en 25 uF.
      Opmerking: Zoals beschreven in 2.1.7, kan een mutante giststam die één auxotrofe marker worden getransformeerd met één plasmide codeert voor de gemuteerde marker per monster. Ook het gebruikeen plasmide dat een gemakkelijk detecteerbaar eiwit zoals GFP codeert maakt een efficiënte bepaling van juiste vouwing en de expressie van heteroloog eiwit na transformatie.
    8. Transfer geëlektroporeerde cellen in 8 ml van een 1: 1 mengsel van YPD: 1 M sorbitol en laat cellen incuberen op een roller trommel bij 30 ° C gedurende 60 minuten.
    9. Pellet cellen zoals in 2.2.3 en resuspendeer in 100 ul 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Plaat volledige volume op selectief medium dat 1 M sorbitol, wikkel randen van platen in Parafilm en incubeer platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-5 dagen om de groei van getransformeerde gistcellen.
      Opmerking: Het is belangrijk om te testen getransformeerde gist juiste expressie van heteroloog eiwit te evalueren, zoals in 2.1.14 en 2.2.7.

3. orale sondevoeding van Muizen met Transformed Gist

  1. Voer alle dierlijke zorg en behandeling procedures volgens de Gids voor de zorg en het gebruik van het Laboratorium Anij dieren en Institutional Animal Care en goedkeuring gebruik Comite.
  2. Bereid O / N gistkweken door het enten enkele kolonies van getransformeerde auxotrofe gist in 5-10 ml selectief medium. Incubeer kweken O / N voor ten minste 8 uur op een roller trommel bij 30 ° C tot verzadiging.
    OPMERKING: Gebruik van plasmide coderend proef eiwitten zoals GFP zal voor gemak van eiwitexpressie gavaged testen in gist, zoals beschreven in 4.7.
  3. Voor maximale inductie van eiwitexpressie en log-fase groei induceren bereiden subculturen van de O / N culturen door verdunnen tot een OD 600 equivalent van ongeveer 0,16-0,2 in 50 ml geschikte media zoals beschreven in 2.1.2.
  4. Het gehalte aan subkweek cellen zoals in 1.1.2 en aangepast voor 10 9 cellen / ml. Bereid een 100 ul dosis voor elke muis, met een paar honderd ul extra volume per groep om de nauwkeurigheid te verbeteren en het gemak van het monster laden.
  5. Pellet cellen door centrifugeren bij 2500 x g3 min of in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 min. Aspireren supernatant en resuspendeer cellen door toevoeging van een gelijk volume steriel water en voorzichtig en neer te pipetteren.
  6. Stelt een passende gauge maagsonde naald (22 G 15-20 g muizen) op een 1 ml steriele spuit en load gist monster, en zorg ervoor dat eventuele luchtbellen en stel zuiger om een ​​100 ul increment te elimineren. Plaats een extra spuit met steriel water om sondevoeding controle muizen en controleer op eventuele aanwezigheid van vervuilende gist.
  7. Pick-up van de muis te gavaged met behulp van de niet-dominante hand, met de wijsvinger en duim stevig grijpen de huid rond de hals (figuur 6A). Steek de staart onder de pink beweging van het onderlichaam te voorkomen. Zorg ervoor dat de grip is goed beveiligd en verbiedt de muis te bewegen haar hoofd om schade aan de interne weefsels tijdens de maagsonde te voorkomen.
    LET OP: Schat hoe ver de maagsonde naald moet worden ingebracht door het vasthouden van de naald tegen de muis zodanig datde lamp zelfs met de processus xiphoideus van het sternum. Deze lengte van de naald inbrengen meestal een toelaatbaar de sondenaald lamp naar de maag voeren.
  8. Met behulp van de dominante hand, voorzichtig steek de maagsonde naald in de muis slokdarm door hengelen de naald langs het dak van de mond en de achterkant van de keel, licht houden om links van het midden. Wacht tot de muis om de lamp van de naald te slikken en laat de naald iets verder af te dalen naar het punt geschat 3.7 (figuur 6B). Wanneer één weerstand voelt het inbrengen van de maagsonde naald of de muis op elk moment begint te hijgen, verwijdert de naald opnieuw proberen om de slokdarm te vinden.
  9. Na de muis de lamp van de maagsonde naald heeft ingeslikt, zachtjes druk de zuiger tot 100 pi (10 8 CFU) van gist toe te dienen rechtstreeks in de maag van de muis.
    Opmerking Hoewel muizen kunnen geen van de gavaged oplossing braken na toediening 18,19 21,37. Correct plaatsen van de maagsonde naald, alsmede het aanpassen van het volume en de viscositeit van de oplossing, kan helpen om reflux te beperken en nauwkeurige dosering.
  10. Haal de maagsonde naald uit de maag en de slokdarm van de muis en de terugkeer van de muis naar de kooi. Controleer of de muis ademt en beweegt normaliter na gavage zodat de sondenaald goed gedurende de procedure en dat er geen oplossing werd afgezogen werd ingebracht.

4. Oogst van muizen Peyer's Patches en isolatie van levensvatbare gist Colonies

  1. Op het juiste moment post punt maagsonde, meestal 4 uur, opoffering muizen met behulp van IACUC goedgekeurde methoden. Controleer bij gebrek aan respons na een teen knijpen, en gebruik een secundaire maatregel als cervicale dislocatie om de muis te offeren. Extra tijdstippen kunnen ook worden getest, talrijke studies die de efficiëntie en het tijdstip tot geblekennemen over het epitheel is deeltje afhankelijk 38,39.
  2. Leg de muis met de buik volledig blootgesteld en steriliseer de buikstreek door te besproeien met 70% EtOH. Maak een dwarse incisie door de vacht en de huid met een schaar, zorg dat u geen interne weefsels niet beschadigt. Handmatig wrikken de incisie te openen naar aanleiding van het buikvlies, de dunne serosale voering die de buikorganen bloot te leggen. Til het buikvlies en maak een dwarse incisie naar de darmen bloot te leggen.
  3. stompe tang voorzichtig te plagen de dunne darm van het mesenterische slagaders, vet en andere weefsels. Maak de dunne darm van de maag, het kwadrant linksboven van de muis buik, de blindedarm, de grote zak van darmweefsel aan het begin van de dikke darm.
  4. Isoleer de Peyer's Patches door naar 1-3 mm min of meer ronde stukken ondoorzichtig weefsel langs de dunne darm (Figuur 7). Met behulp van gebogen dissectie GCBsors wegsnijden de koepel van patch van Peyer, waardoor marges zodat geen van de aangrenzende lamina propria verzameld.
    LET OP: De meeste muizen hebben tussen de 4-8 goed zichtbaar Peyer's patches. Uitvoeren van de procedure in een gebied met directe overhead verlichting zal het gemak waarmee Peyer's patches kunnen worden gevisualiseerd verhogen.
  5. Collect ontleed Peyer's vlekken in volledige Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM).
    LET OP: Het is cruciaal om een ​​steriele techniek te gebruiken en omvatten antibiotica in de collectie media om gastro-intestinale bacteriële besmetting van gist platen te voorkomen.
  6. Strain Peyer's vlekken door een 40 um cel zeef aan collectie media te elimineren. Wash plaques van Peyer met verse volledige IMDM over een 50 ml buis en het gebruik van een zuiger van een 1 ml spuit om voorzichtig breken van de Peyer's patches. Gespannen pellet cellen door centrifugeren bij 1800 rpm gedurende 7 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer cellen ineen eindvolume van ongeveer 100 ui.
  7. Solliciteer gespannen cellen op selectief gist media en het gebruik van een plaat spreader gelijkmatig cellen te verdelen. Wikkel plaatranden in Parafilm en incubeer platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2 dagen om de groei van elke levensvatbare gist teruggewonnen uit de plekken van Peyer's muizen.
    OPMERKING: Verder onderzoek na herstel gist van Peyer 'pleisters zijn nodig om te bevestigen dat de stammen kunnen goed gevouwen heteroloog eiwit leveren deze immuun weefsels. Zoals beschreven in 2.1.14 kunnen dergelijke werkwijzen omvatten immunoblotting, ELISA of fluorescentiemicroscopie fluorescerende eiwitten zoals GFP 2,40 detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genereren van een overlevingscurve na UV bestraling vereist plating verdunde gistcellen zodat afzonderlijke kolonievormende eenheden (CFU) kunnen vormen. Elk 500 pl monster verzameld zoals hierboven beschreven bevat ongeveer 5 x 10 6 cellen; Echter, meer dan 100 kolonies per plaat zijn moeilijk om nauwkeurig te onderscheiden. Plating onverdund monster en seriële verdunningen van 1:10 bestraalde cellen dus zorgt ervoor dat CFU kunnen worden geteld op elke UV dosering, zoals aangetoond in figuur 1. De CFU tellen, vermenigvuldigd met de verdunningsfactor wordt vervolgens gedeeld door het totale aantal originele bestraalde cellen per 500 pl monster teneinde percentage overleving bepalen bij elke dosis. Figuur 2 toont het berekende percentage diploïde wildtype S. boulardii cellen in staat zijn om te overleven 0 uJ, 5000 uJ, 10.000 uJ, 15.000 uJ, 20.000 uJ, 22.500 uJ, 25.000uJ, 35.000 uJ, en 50.000 uJ. Deze gegevens stellen een duidelijke curve die kan worden gebruikt om de dosis die overeenkomt met 50% overleving vinden.

Na selectie van UV dosis en bestraling van gistcellen, is het essentieel om het scherm mutante kolonies gebrek aan een functionele auxotrofe merker gen te bevestigen. Toepassing van een selectiemethode zoals beschreven in 1.2.3.1 en figuur 3, verhoogt de efficiëntie van fenotype bevestiging. Getoond wordt een voorbeeld van URA3 selectie die gebruik maken van de omzetting van 5-FOA is om het toxine 5-FU door intacte Ura3. Analoge benaderingen zijn beschikbaar voor LYS2 en LYS5, TRP1 en MET2 en MET15 en de efficiëntie van de selectie te verhogen voor deze mutaties. Voorzichtigheid is geboden om individuele kolonies tijdens screening selecteren. De consistente groei van mutante kolonies op YPD en 5-FOA, maar niet uracil -, platen indicates auxotrofe fenotype.

Figuur 4 toont transformatie-efficiëntie voor wild-type S. boulardii (Sb) ten opzichte van een veel gebruikte laboratorium S. cerevisiae stam (Sc) zowel met de LiOAc (LiOAc) en elektroporatie (Electro) technieken. Hoewel LiOAc transformatie zeer efficiënt voor S. cerevisiae, transformatie-efficiëntie voor S. boulardii sterk verbeterd middels elektroporatie. Figuur 5 toont het gebruik van fluorescentiemicroscopie als voorbeeld voor de analyse van goede eiwitexpressie uit getransformeerde gist. Helderveld (A) en fluorescentie (B) beelden worden getoond S. cerevisiae URA3 getransformeerd met een plasmide coderend voor GFP, die functionele expressie van heteroloog eiwit uit de getransformeerde gist. Cellen kunnen worden geïmmobiliseerd betere beeldvorming met dekglaasjes bedekt met concanavaline A (laag 5 ul van een 2mg / ml voorraad oplossing in water op elke 22 x 22 micrometer dekglaasje en de lucht drogen).

Figuur 6A toont een C57BL / 6 muis gehouden net voor orale sondevoeding. De hand grijpt de rug en nek van de muis vast zodanig dat de muis niet de kop in een richting te bewegen. Deze greep kan de maagsonde naald nauwkeurig te worden geplaatst en met een verminderd risico van weefselschade. Figuur 6B toont de maagsonde naald gehouden na de muis slikt de maagsonde naald. Na de incubatieperiode, de dunne darm van de geofferde muizen zorgvuldig worden afgezien geplaagd van de omringende weefsels, zoals weergegeven in figuur 7. Deze manipulatie maakt gemakkelijke identificatie van de plaques van Peyer en schone dissectie van de pleisters zonder verzamelen van een van de omringende Lamina Propria. Tot slot, Figuur 8 toont typische herstel van levensvatbare gist CFU van plaques van Peyer. oplossingen Gist Media en Plates transformatie reagentia Polyethyleenglycol (PEG) 50%: YPD: TE / LiOAc: 250 g PEG 3350 20 g pepton 50 ml 10x TE 500 ml steriel water 20 g dextrose 50 ml 10x (1M) LiOAc filter steriliseren 10 g gistextract 400 ml steriel water 1 liter water filter steriliseren autoclaaf TE 10x: YPD platen: PEG / TE / LiOAc: 100 mM Tris 20 g pepton 400 ml 50% PEG 10 mM EDTA 20 g dextrose 50 ml 10x TE pH 7,5 en filter steriliseren 20 g agar 50 ml 10x (1M) LiOAc 10 g gistextract 1 liter water autoclaaf 20% glucose: Uracil - selectieve media Carrier DNA (SS DNA): 200 g dextrose 2 g aminozuur mengsel zonder uracil Bewaar bij -20 ° C en voordat warmte te gebruiken gedurende 1-2 minuten bij 100 ° C tot strengen te smelten en te bewaren op ijs 1 liter water 6,7 g gist-stikstofbase zonder aminozuren filter steriliseren 1 liter water <tr> Steriliseren in autoclaaf of steriel filtering Voeg 20% ​​glucose 1:10 voor gebruik 50% glycerol: Uracil - platen: Elektroporatie buffer: 500 ml glycerol In een 250 ml kolf: 1 M Sorbitol 500 ml water 2 g aminozuur mengsel zonder uracil 1 mM CaCl 2 autoclaaf 6,7 g gist-stikstofbase zonder aminozuren Vul met gedestilleerd water 150 ml water Autoclaaf en bewaar bij 4 ° C In een 2 L kolf: 20 g agar 750 ml water Autoclaaf flacons apart en meng samen met 100 ml 20% glucose compleet IMDM 5-FOA + platen: LiOAc / DTT 500 ml Iscove's gemodificeerd Dulbecco's Media Autoclaaf in een 2 L kolf: 0,1 M LiOAc 5 ml penicilline streptomycine glutamine 100x 20 g agar 10 mM DTT 500 pl 2-mercaptoethanol 750 ml water 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum Mengen: 2,5 ml 100 mM natriumpyruvaat 6,7 g gist-stikstofbase zonder aminozuren 2 g aminozuur mengsel zonder uracil 150 ml warm water Wanneer ze afgekoeld zijn, toe te voegen: 0,05 g uracil poeder 1 g 5-FOA Roer en filter steriliseren Voeg toe aan een autoclaaf agar-oplossing Mengen met 100 ml 20% glucose

Tabel 1. Lijst Reagentia. Beschreven worden de reagentia nodig voor het maken van elk van de oplossingen, gist media en platen, en transformatie buffers gebruikt voor de protocollen in dit manuscript.

Figuur 1
Figuur 1. Gist kolonies gekweekt op YPD medium. Voorbeeld YPD plaat toont levensvatbare kolonievormende eenheden (CFU) probiotic gist na UV straling. De cellen werden serieel zodanig verdund dat individuele CFU kunnen worden onderscheiden en geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Survival curve voor diploïde probiotische gist. Aantal levensvatbare S. boulardii CFU als percentage van de totale geplateerde cellen uitgezet per uJ dosis UV bestraling (getrokken lijn). De verticale rode lijn geeft de uJ UV-dosis die overeenkomt met 50% overleving van deze giststam. Een Rad1 S. cerevisiae mutant, die geen schade van UV-mutagenese kan herstellen, wordt getoond als een controle (stippellijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. </ A>

figuur 3
Figuur 3. Bevestiging van ura3 - fenotype van UV-bestraalde cellen op YPD, uracil - en 5-FOA platen Cellen van individuele UV mutante kolonies werden met de punt van een steriele tandenstoker verzameld en zachtjes strepen in YPD, uracil -. En 5 -FOA platen. De cellen werden voor het eerst strepen in twee loodrechte kruisende lijnen, daarna werd een nieuwe tandenstoker gebruikt door de tweede lijn te passeren en verder verspreiden van cellen tot individuele cellen te scheiden. Een echte ura3 - mutante (mut) groeit op YPD medium en in aanwezigheid van 5-FOA, maar niet in afwezigheid van uracil. Controle ura3 - S. cerevisiae (URA3 -) en URA3 + sup> S. boulardii (URA3 +) worden getoond voor vergelijking en voor een goede voorbereiding van de gist media te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. transformatie-efficiëntie van Saccharomyces stammen. Wildtype S. boulardii (Sb) en een laboratorium S. cerevisiae stam (Sc) werden getransformeerd met de beschreven LiOAc (LiOAc) en elektroporatie (Electro) protocollen. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde CFU per pg plasmide codeert voor een kanamycine resistentie merker verkregen. Balken geven het gemiddelde van duplo experimenten met foutbalken beeltenis van de standaardafwijking van het gemiddelde.es / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Functionele eiwitexpressie door Getransformeerde gist. S. cerevisiae getransformeerd met lege plasmide (A) en plasmide coderend voor GFP (B) werden geanalyseerd met een fluorescentiemicroscoop. Fluorescentie in de gistcellen getransformeerd met GFP plasmide geeft succesvolle productie van functionele GFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Een goede afhandeling van een C57BL / 6 muis voor orale sondevoeding. De muis is gehouden tightly in de niet-dominante hand van de staart verscholen onder de pink zodat geen beweging mogelijk (A). De maagsonde naald wordt ingebracht in de keelholte langs het gehemelte. De muis is toegestaan ​​om de lamp van de maagsonde naald te slikken, waardoor de oplossing om vervolgens de maag als de zuiger wordt ingedrukt (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Voorbereiding en dissectie van plaques van Peyer. De dunne darm wordt getoond weg ontleed van de andere inwendige organen en weefsels, met pijlen om een paar van de plaques van Peyer. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.

Figuur 8
Figuur 8. Gist Herstel van Peyer's Patches. Een voorbeeld van een levensvatbare CFU gevonden na dissectie, homogenisering en plating van de totale Peyer's patch cellen van een muis gavaged met S. boulardii. Cellen werden uitgeplaat op YPD gist media en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen. Typische opbrengst van CFU teruggewonnen per muis is minder dan 10. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samen vormen de protocollen beschrijven hierin de essentiële stappen die nodig zijn voor het ontwikkelen en testen van auxotrofe probiotische giststammen voor afgifte van heteroloog therapeutisch eiwit aan de darm. Deze manipulatie en het testen van recombinant probiotische gist vereist technieken en middelen waarmee een individu laboratorium kan op dit moment niet bekend zijn. Dus, hoewel talrijke eerdere studies de hierboven beschreven protocollen voor meerdere gist en muis stammen, deze methoden hebben niet om de kennis van de auteurs gepresenteerd in een gedetailleerd, verenigd vorm. Verder verschaft de onderhavige manuscript op de voorgrond komt aanpassing huidige gestandaardiseerde protocollen voor genetische manipulatie van probiotische gist, die minder goed gekarakteriseerd dan gangbare laboratoriumstammen giststammen. Vele stappen voor zowel mutagenese (besproken in deel 1) en transformatie (deel 2) moeten worden geoptimaliseerd voor de manipulatie van dergelijke diploïde, probiotische gist isolates. Dit manuscript bespreekt ook potentiële valkuilen in verband met de behandeling van dieren (deel 3) en dissectie van de Peyer's patch immuun weefsels van de dunne darm (deel 4).

Zoals vele industriële en klinisch relevant giststammen niet meteen aanpasbaar voor grootschalige genetische manipulatie, is het eerst noodzakelijk om stammen te genereren zoals auxotrofe mutanten die kunnen worden gekweekt en geselecteerd zonder dure antibiotica. UV mutagenese is een dergelijke benadering maakt een snelle niet-specifieke mutatie van auxotrofe genen 7,41. Overlevingscurven kunnen eenvoudig worden gegenereerd (Figuren 1 en 2) om de juiste dosis te bepalen voor het screenen van mutanten. Deze benadering draagt ​​het risico van het induceren van mutaties die naast zit groeisnelheid of andere eigenschappen van de giststam kan beïnvloeden. Gerichte knockouts plaats daarvan kan worden gegenereerd met behulp van PCR constructen of CRISPR / Cas9 systeem. Daaropvolgende screening of selectie(Figuur 3) mutanten kunnen worden vastgesteld auxotrofe gist. Gebruik van selectie door uitplating op 5-FOA media, bijvoorbeeld, zorgt voor een snelle eliminatie van elke gist nog met een functionele URA3 auxotrofe gen. Als het mogelijk is, kan deze selectie aanpak te verkiezen boven een scherm, dat analyse van alle kolonies gegenereerde vereist zijn. Bij beide selectie of screening echter is het essentieel om herhaalde strepen afzonderlijke gistkolonies voeren op selectieve media auxotrofe toestand bevestigen.

Transformatie van de gegenereerde mutanten kan worden bereikt door verschillende protocollen. Hoewel LiOAc transformatie effectief is in de transformatie van verschillende giststammen, met name voor de meest gebruikte laboratorium S. cerevisiae stammen kunnen alternatieve protocollen zoals elektroporatie transformeren gist andere isolaten efficiënter (figuur 4). Elke nieuwe stam moeten worden getest using meerdere protocollen om de optimale omstandigheden voor transformatie bepalen. Variërende incubatietijden en concentratie van DNA, bijvoorbeeld, kunnen de algehele transformatie-efficiëntie beïnvloeden en moeten worden getest en geoptimaliseerd voor elke stam 33.

Orale gavage maakt de gecontroleerde afgifte van doseringen van deze recombinante gist direct naar murine maagdarmkanaal, wie het immuunsysteem weefsels kunnen vervolgens worden getest op gist en heteroloog eiwit. Goede orale gavage techniek (figuur 6) is kritisch voor dieren ongemak minimaliseren en experimentele precisie. Bovendien is de Peyer's patches zijn belangrijke sites opname van recombinant gist uit de darm te beoordelen. Deze clusters van immuunweefsel zijn belangrijke sites antigeen bemonstering en inductie van mucosale immuunresponsen. Grote antigenen, waaronder gist 3-6 micrometer in diameter, hoogstwaarschijnlijk door de M cellen van de plaques van Peyer worden genomen om de GA stekenstrointestinal epitheel en communiceren met immuuncellen. Voorzichtigheid is geboden bij het ​​ontleden van de Peyer's Patches zodat alleen cellen vanuit de pleister in plaats van het darmlumen of lamina propria verzameld (Figuur 7). Verdere stappen moeten worden genomen na dissectie juiste expressie en functie van heteroloog eiwit beoordelen de teruggewonnen gist (Figuur 8). Bereiding van totaal eiwit uit gist en lysaten immunoblotting is een standaardmethode om eiwitexpressie te beoordelen; echter deze benadering geen informatie over eiwitvouwing en functie. Om de eiwitfunctie te beoordelen, kan gist worden getransformeerd met een plasmide coderend voor GFP en onder een fluorescentiemicroscoop na herstel van plaques van Peyer geanalyseerd op functionele GFP-expressie (Figuur 5) te beoordelen.

Kortom, dit manuscript bevat een uniforme set van gedetailleerde experimentele protocollen spanning stappen weerm het genereren van auxotrofe mutanten tot het herstel van probiotische gist van de muis darm. Door het opstellen van protocollen die traditioneel niet binnen één vakgebied vallen, zullen deze omschrijvingen verdere studies testen van immunologische reacties op probiotische gist ontworpen als orale drug delivery vectoren te vergemakkelijken. De auteurs hopen dat deze studie zal de discussie aan te moedigen en te bevorderen optimalisatie van experimentele methoden voor elke giststam getest, de weg vrijmaakt voor de meest efficiënte aanpak van de ontwikkeling van nieuwe, probiotische-gebaseerde recombinant therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen financiering via het Children's Center voor Immunologie en vaccins en een NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) toegekend aan Tracey J. Lamb. De auteurs danken ook Natalya P. Degtyareva voor de gulle bijdrage van Rad1 S. cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73, (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9, (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41, (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32, (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5, (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23, (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153, (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1, (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30, (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8, (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49, (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34, (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38, (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197, (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118, (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14, (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67, (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13, (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1, (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71, (1), 312-319 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics