三维仿生技术:新型Biorubber创建自定义微观和宏观尺度架构的胶原凝胶

Bioengineering

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Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

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Abstract

组织支架起到组织再生过程中的关键作用。理想的脚手架必须满足几个条件,如适当有组成,有针对性的模量,以及明确的建筑特色。该概括体内组织的内在结构的生物材料可用于研究疾病,以及便于丢失和畸形软组织的再生是至关重要的。一种新型的生物制造技术的开发,结合​​了先进的成像,三维(3D)打印,和选择性酶活性的国家创造了新一代​​生物材料的研究和临床应用。开发材料,牛血清白蛋白橡胶,是注入一个维护特定几何特征的模具的反应。这种牺牲材料允许建筑特色的充分转移到天然支架材料。所述原型包括一个三维胶原蛋白支架的带4和3mm渠道再版ESENT支架构。本文强调的自然结构的产生使用这种生物制造技术。这个协议利用计算机辅助软件(CAD)来制造固体模具,这将是用BSA橡胶接着橡胶的酶消化注入反应,而使支架材料内的建筑特色。

Introduction

在组织工程领域,制作组织支架的能力是至关重要的。合适的组织支架具有三维结构,是由生物相容的材料制成,并在体内组织架构模拟物,以促进细胞和组织的生长和重建。该支架必须允许营养物质的运输和清除废物1-4。一种在生产这些支架的主要障碍是概括特定几何特征成生物相容的材料的能力。几个生物制造技术已经报道,以控制这些支架的几何特征,实施例是静电5-8,溶剂浇铸9,立体光刻10,和3D印刷11,等等。这些技术达不到在提供相对容易的可控内部和外部的建筑特色转移,是昂贵的,由它们的分辨率和印刷性能(限12长的时间。

在许多商业制造系统,内部空隙,通道和特征的创建是用砂或其他合适的可移动或牺牲材料来实现。的金属或塑料部件围绕砂模形成,并且一旦它被固化时,砂被去除。在大致相同的方式,下一代生物材料的所需要的生物沙等效。因此,波塞橡胶被开发作为用于生物沙的替代物。 BSA的橡胶是由具有戊二醛交联的牛血清白蛋白的一个新制定的材料。最终的目标是具体的建筑特色重建成可生物降解的胶原支架。维持二维保真度与原组织的模具牺牲biorubber的特性进行说明。

体内组织的弹性和感兴趣的组织的其他特性的相对容易且及时物质递送的特定几何启发可生物降解的材料。

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Protocol

1.确定物中的胶原蛋白批次的百分比

  1. 提取继先前公布的程序13的胶原蛋白。解冻的最低20ml的胶原蛋白。确定以操纵在形成的水凝胶,胶原浓度在批处理胶原固体的初始百分比。
    1. 切三块铝箔(约6×6厘米)中,并通过用25毫升烧杯的底部形状每一个作为锅。记录每个锅的重量。
    2. 胶原的少量添加到每个平移和记录铝锅和胶原的总重量。添加0.5 - 0.8克胶原每个铝盘。
      注意:在此步骤之后,有三个铝箔盘和每一个应当有胶原的量小。确保记录每个(总共3)空铝盘的重量和锅的加成胶原后的重量。
    3. 使用F计算胶原的重量在每一个锅ollowing公式:
      胶原蛋白的重量=潘和胶原蛋白的重量 - 潘重
    4. 放置持有在100℃下在烘箱中胶原24小时三个铝盘中。
    5. 24小时后,记录每个铝盘的重量和脱水的胶原蛋白。
    6. 计算使用下面的等式脱水胶原的重量:
      脱水的胶原蛋白的重量=平移和脱水的胶原蛋白的重量 - 潘重
    7. 计算的固体的百分比为三个样品,使用以下公式确定胶原固体浓度:
      公式(2)
    8. 计算使用胶原固体为三个样本的百分比批次的平均胶原固体含量。
      注意:将要使用的胶原是留下水合胶原蛋白。脱水的胶原蛋白没有将被使用。
    9. 确定胶原固体(我的百分比后该批nitial胶原浓度),继续使用剩余的水合胶原。使用经过校准的pH计的胶原批次的pH调节至3。
      1. 加入少量(每次2-5微升)12 N盐酸(HCl)的。保持冰在任何时候。不直接添加盐酸以胶原 - 酸添加到该管的一侧。加酸后,用锅铲酸推到胶原蛋白,迅速搅拌混合。
    10. 一旦它的pH值达到3,让胶原坐O / N在4℃。

2. BSA橡胶的制备

  1. 制备按照下面所列的步骤的牛血清白蛋白(BSA)溶液。
    1. 制备2倍磷酸盐缓冲盐水液(PBS)中。添加两个PBS片剂至100毫升的水,使0.02M的PBS溶液。
    2. 结合BSA的2倍的PBS来创建使用下列顺序的30%BSA溶液。
      1. 例如,为了使30%的BSA用30ml 2×PBS中,使用12.9克的BSA。添加2倍的PBS(例如,10ml)中的1/3到有搅拌棒的烧瓶中。添加BSA(,6.45克BSA)在烧瓶1/2和使用刮刀,润湿干溶质。
      2. 重复加入PBS中,然后BSA的这个过程,直到所有的溶质和溶剂在烧瓶中。用锅铲湿所有的溶质。它看起来像一些液体和团块的混合物。让它坐大约30分钟。
      3. 然后,打开一个小周期的搅拌器,并确保周围有搅拌棒无团块。它应该采取90分钟得到解决方案的所有或者也可以在4℃下搅拌O / N。溶质全部溶解后,放置在20毫升注射器的溶液,并用0.20微米的注射器过滤器盖上。按下柱塞通过过滤器排出液体,并收集在一个新的管中的灭菌溶液。保存在4℃。
    3. 准备3%戊二醛soluti通过稀释无菌过滤2X PBS 25%戊二醛溶液。例如,10毫升3%戊二醛溶液,使用2个ml等于25%的戊二醛和8毫升2×PBS中。保存在4℃。

3.治疗模具

注:本文中所描述的原型采用的是定制的不锈钢Ÿ防霉片。模具包含一个流入和分别为4和3mm两个流出通道。首先,清洁模具,喷洒与不饱和猪油和消毒他们。按照以下描述的步骤制备的模具。

  1. 使用超声波仪,在35千赫的频率干净的不锈钢模具。放置模具在超声波仪,用水和冰淹没它们。保持模具冷在任何时候都超声波仪运行时。运行超声波仪90分钟2​​期。
    1. 每一个时期后,用针,以确保没有在鲁尔无重大锁定不锈钢或bRASS连接器。用肥皂和水清洗模具双方的整个表面。验证是否有在渠道上没有障碍。
  2. 放置模具,螺丝,和鲁尔锁定连接​​器在高压釜中袋和高压灭菌它。
  3. 填补重视与市售猪油(混合脂肪酸脱模剂)的空气喷雾器一半的瓶子。更换一个普通盖瓶帽。将其放置在高压釜中袋和高压灭菌它。
    注意:猪油用于促进该材料,就可以注射以后反应(BSA橡胶)的释放。不要把喷雾器瓶盖在autoclave-它会损坏内部密封。
  4. 热身猪油45秒,直到它的明确和液体微波炉。螺杆空气喷涂机盖猪油瓶。盖连接的喷雾器。附加喷雾器在实验台上的气源。打开空气阀,并打开喷雾器的喷嘴,直到它开始润湿表面的纸巾。
  5. 喷猪油垂直于模具表面,直到表面被完全覆盖。每一块被喷后,将它们放置在培养皿和密封。放置模具在4℃下2小时。
  6. 继续进行由表面向UV光暴露30分钟以消毒该模具。将它们放回在4°C,直到他们准备好要反应注射。

4. BSA橡胶反应注射

注:所有的材料和解决方案应保持低温,直到准备使用,以防止BSA橡胶过早凝固在接下来的步骤。

  1. 准备分配器交付BSA橡胶以下步骤模具。
    1. 消毒所有混合组分(二O形环,注射器帽,双注射器,混合尖端,和4:1分配器)通过暴露于UV光在聚合酶链反应(PCR)罩30分钟。
      注意:PCR罩被使用,因为Ť他的过程涉及固定剂。这些化学物质不能在细胞/组织培养橱中使用,由于曝光和毒性的细胞的风险。包含UV光的任何其它罩将是合适的。
    2. 放置在溶液保持器的尖端帽。
    3. BSA的比为1:在一个4进行混合和注射戊二醛。 30%BSA加入双注射器腔,将提供的解决方案的最高金额(这将需要大约4毫升填写)。确保留有足够的空间,以O形圈放置,以防止相邻的腔室的溢流和污染。
    4. 加入3%戊二醛溶液到另一个房间(这将需要约1毫升填写)。请务必留出足够的空间放置O形环,以防止相邻室四溢和污染。
    5. 放置在分配器中的双注射器。垂直倾斜组件使得注射器帽是在顶部。更换混合头帽。
    6. 钪REW两个不锈钢模具拼在一起。
    7. 将装配高压釜袋里面。
    8. 以除去任何空气在分配器,将其保持在直立位置,并迅速挤压手柄一次,以释放与戊二醛混合波塞少量。然后迅速装上不锈钢Ÿ模具的鲁尔锁连接器连接到注射器尖端。
    9. 持用左手和右侧的BSA的戊二醛混合物分配器不锈钢ý模具。通过按排出到高压釜袋的侧面,以确保内部的空隙填充有溶液交替覆盖各流出通道的左侧和右侧排气。然后,水平放置的模具和再次注入。
    10. 从分离饮水机和地点该模具在25毫米的培养皿。
    11. 放置封口膜周围的培养皿,以防止橡胶的脱水。
    12. 放置在4℃冰箱O / N模具。

注意:胶原应在所有时间的过程中被保持在冰上。

  1. 修改使用胶原固体的百分比胶原浓度。
    1. 通过调整用冷水初始浓度胶原蛋白使10毫升1.75%的胶原蛋白。
    2. 使用校准pH计,调节用12N盐酸将pH至3。不直接添加盐酸到胶原的酸添加到该管的一侧。加酸后,用锅铲酸推入的胶原蛋白,迅速搅拌混合。
    3. 权衡4克胶原在一个单独的锥形管中。
    4. 离心胶原在4℃和9,343×g离心20-30分钟以除去空气。
    5. 紫外线消毒细胞培养罩30分钟,并添加14微升粘连到4毫升胶原。这将导致10微克/微升的最终层粘连蛋白的浓度。注:层粘连蛋白将提供关于Structural完整性,附着力,并促进各种细胞应答。
    6. 打开PCR紫外灯上20-30分钟用消毒罩之前。
    7. 放置路厄锁盖,附加到20ml的注射器,在乙醇中2小时。然后,使其干燥,并放置在UV光。
    8. 伽玛辐照胶原蛋白8.6分钟达到1200 cGy的。
      注意:时间将取决于铯源的衰减。调整以达到相同的剂量的时间。

对BSA橡胶6.Casting胶原蛋白

  1. 以聚合胶原,使用8:1:1的比例(胶原:HEPES:MEM)中。下面的过程是基于一个初始4克酸化胶原(来自步骤5.1.8)的。
    1. 使在水中的0.2N的HEPES溶液,并通过加入1-5 1M氢氧化氢氧化钠(NaOH)溶液少量(1-5微升)将pH调节至9。使用校准pH计,监测每次加入后的溶液的pH值。保存在4℃或科EP冰上。
    2. 打开组织培养罩的UV光20-30分钟进行消毒罩。
    3. 蒸压钳,铲,手术刀和消毒。
    4. 拌1.5的0.2N的HEPES(pH为9)和1.5的10倍的MEM毫升利用组织培养罩毫升。请一定要保持它在冰上旋涡其5秒后才能使用。存放在4℃或保持在冰上。
    5. 消毒的PCR罩,开启UV光30分钟。
    6. 放置在-20℃的12孔平板和一个20毫升注射器10分钟,或直至准备继续。注意:将所有材料冷待用。温度的增加导致过早胶原原纤维。
    7. 喷雾所有管和孔板那将是在用70%乙醇罩,并让他们干灭菌。置于冰上20毫升注射器冷却以备后用。
    8. 在PCR罩,打开不锈钢模具释放BSA橡胶和使用手术刀,切开BSA R的排气通道ubber模具。
    9. 下的PCR罩中,打开无菌胶原管和加入1毫升的HEPES-MEM溶液(确保提取的HEPES-MEM溶液,这是很好的混合,并且没有固体沉淀之前)。
    10. 使用无菌刮刀,调匀胶原蛋白和缓冲溶液。
    11. 关闭并涡旋它迅速,以确保充分混合的水凝胶。
    12. 转移到冷20毫升注射器。
    13. 用一只手握住的BSA橡胶阱的内部,并使用其他分配一半胶原凝胶溶液到井的底部。
    14. 使用无菌镊子,确保橡胶流入和流出的两端接触的侧面很好。
    15. 倒入橡胶的顶部胶原溶液直至完全覆盖。
    16. 确保BSA橡胶胶原内暂停,不存在任何气泡,尤其是靠近橡胶的端部。
    17. 将机盖和包装封口膜周围的阱的周边。
    18. 把在培养箱中1小时,在37℃。保持对PCR紫外光。
  2. 胶原聚合后,紫外线交联通过以下过程中的水凝胶。
    注意:胶原的交联将使用其中可以控制能量的量的UV交联剂装置来完成。
    1. 打开UV交联剂和使用的能源与环境μJ630000 /厘米2照射空室。
    2. 从培养箱中取出凝胶。
    3. 喷雾手用乙醇,而且,在室内,迅速取下盖越好。
    4. 关闭室和紫外线通过选择能量设置和照射630000μJ/ cm 2的交联水凝胶。
    5. 交联循环后,关掉紫外线灯的PCR罩
    6. 喷雾手用乙醇和打开密室,迅速将盖放回孔板。移动孔板到PCR罩。
    7. 使用无菌刮刀,轻轻拧松并从井中取出凝胶。翻转引擎盖下的凝胶以交联水凝胶的底部。重复步骤6.2.3和6.2.4。

7. BSA橡胶酶切

  1. 为了具有中空胶原支架,除去BSA橡胶中的方式,不影响嵌在水凝胶的尺寸。该过程描述如下。
    1. 打开紫外光20-30分钟来灭菌组织培养罩。
    2. 使0.25%的胰蛋白酶溶液的pH值7.8。例如,15毫升水,在50毫升锥形管中添加0.0376克胰蛋白酶。通过加入1M NaCl的少量(2-5微升)调节pH值至7.8。放置在20毫升注射器的溶液,并用0.20微米的注射器过滤器盖上。按下柱塞通过过滤器排出液体,并收集在一个新的管中的无菌溶液。
    3. 放水浴,将温度设定为30C。
    4. 30分钟后,关掉紫外线灯。喷洒在将在罩中使用的所有管和材料乙醇。
    5. 在不同的锥形管引擎盖下发生转移的胶原凝胶。
    6. 周围添加3-5毫升(刚好足以覆盖凝胶)的0.25%胰蛋白酶溶液,pH值为7.8至每个管。
    7. 密封用封口膜和涡轻管约1分钟。
    8. 发生在30℃的水浴中15-24小时。而在水浴,轻轻频繁涡凝胶直到BSA的橡胶已被消化或从水凝胶中移除。
      注意:为了确定是否波塞橡胶已被去除,或者将橡胶漂浮在胰蛋白酶溶液或有破旧件。必须有水凝胶内没有视觉暗区。
  2. 为了确保所有的BSA的橡胶和胰蛋白酶已经从水凝胶取出,如下所述冲洗。
    1. 打开PCR呼ð紫外线20-30分钟。
    2. 准备Mosconas解决方案。在水结合氯化钾(KCl,28.6毫摩尔),( 碳酸氢钠 ,11.9毫摩尔),葡萄糖(9.4毫摩尔)和(的NaH 2 PO 4,0.08毫摩尔)。调节pH值至7.4,用1M的NaOH或12M的HCl溶液。放置在20毫升注射器的溶液和使用0.20微米的注射器过滤器进行消毒的溶液中。
    3. 喷雾用乙醇一切之前将它们放置在引擎盖上,并允许乙醇干燥。
    4. 打开管并转移5-10无菌Mosconas溶液中到一个新的50ml锥形管中。
    5. 转移胶原水凝胶包含酶溶液的锥形管中。确保该水凝胶完全覆盖该溶液中。留在冰箱摇床管在4℃下30分钟。
    6. 吸出Mosconas解决方案,并重复步骤7.2.5两次。
    7. 保存在4℃。

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Representative Results

的结果表明,该生物制造技术是在产生三维支架,可以模仿体内组织中所看到的空间排列高效。建筑特色是用于组织工程应用的重要参数,打在组织体内细胞相互作用和功能的关键作用。

BSA的橡胶的一致​​性和混合能力是在生产的BSA橡胶是均匀的,并能保持其预定形状的重要参数。蛋白质的溶解度是通过分子间的影响,如对蛋白质 - 蛋白质相互作用,并且与溶剂,其诱导对整体蛋白行为的变化的相互作用确定。的BSA溶液的电导率进行测定,这是溶液的盐浓度的指示。 表1列出了 combinatiBSA的组件,溶剂和戊二醛测试。正如预期的,即具有最高的导电性的样品(2倍的PBS溶剂)促进了BSA的溶解度。

用于确定该牺牲材料的发展的适当条件的另一参数是反应速率。 BSA的反应时间戊二醛浓度的增加降低,如预期。固定剂与肽的N-末端氨基的氨基酸的α氨基基团,和半胱氨酸的巯基反应。戊二醛与BSA通过赖氨酸的氨基主要反应形成的分子间共价键1A)14。孵育期后,将样品显示从浅黄色到深黄棕色的颜色变化,在强度与增加戊二醛浓度图1B) 的20%,30%,越来越ð在水中的2%戊二醛的40%的BSA没有形成的橡胶。的40%BSA溶液,由于其高粘度和高反应性固定剂,导致沿橡胶不同强度。这种行为可以通过戊二醛中均匀穿透蛋白链的难度造成的。溶剂极大地影响该蛋白质的溶解度,以及其与固定剂反应。 2倍PBS的解决方案很容易混合的。与水的BSA溶液是难以混合。 BSA的溶解度是由溶剂表2)的导电性很大的影响,从而导致在该蛋白质的构象变化。最有前途的样品是在30%的BSA在1×PBS中和2x PBS中的3%戊二醛。

以确保橡胶能够持续载荷力,进行压缩试验。测定的BSA橡胶的四个样品的机械性能:30%BSA的3%戊二醛中2倍的PBS,在1×PBS中,在2×PBS中的20%BSA的3%戊二醛和20%BSA的2%戊二醛在1×PBS中的30%BSA的3%戊二醛。正弦波表明被传输到应力和应变曲线补充图3)的负荷和位移曲线补充图2)之间的非常小的相变。基于该应力和应变曲线,前三个样品中的装载和卸载2A-2C)之间表现出滞后现象。这三个样品表现为包含弹性和粘性特性时被施加的力的粘弹性材料。的20%的BSA 2%戊二醛显示永久变形图2D)的迹象。在1X PBS和2倍的PBS中的30%BSA的3%戊二醛表现出类似的行为( 图2E酮装卸循环)。弹性模量,从这些四个样品2F)的直线部分确定。磷酸盐的浓度在(p值= 0.03)测试的范围溶剂显著增加了弹性模量。在1×PBS中的20%BSA的2%戊二醛容易变形,示出了较低的弹性模量。

来评价橡胶的酶促消化,置于与在特定时间点上的酶接触时,反应速度经计算基于所述BSA橡胶的消失。酶消化过程被视为一个间歇式反应器。治疗前和被冷冻干燥是为了获得消化的动力学后留下的橡胶原料橡胶浓度之间的比较。 图3示出了反应的用于相对于各样品,以戊二醛与BSA,溶剂的浓度的速率,并的停留时间。交联剂浓度和实体的解离的反应速率之间观察到明显的趋势被。在每个时间点进行统计分析。对于日Ë15小时的时间点,戊二醛浓度显著影响导致的0.02 p值补充表4)的反应速率。该时间点之后,无论是戊二醛和BSA浓度显著影响率补充表5-7)。影响最大的因素是总体戊二醛浓度,以更显著的p值表示。在戊二醛浓度的增加橡胶实体的消化的反应速率下降。

使用BCA测定法图4)测定蛋白的胰蛋白酶溶解的量。观察到共同的趋势:固定剂的低浓度,更蛋白质是从BSA橡胶消化。胰蛋白酶与橡胶样品相互作用通过裂解的BSA和由戊二醛形成的新创建的共价键,从而整体结构上溶解时间。它似乎与1×PBS中有在较早的时间点更溶解的蛋白相比,2倍的PBS中。随着时间的推移,有一个在15小时中溶液的增加的蛋白质,其中继续增加,直至48小时,然后将其降低。这可能是由于胰蛋白酶不断裂解蛋白质,并因此产生较小的肽和氨基酸。它也可以归因于该测定的局限性,这只能读取由三个或更多个氨基酸的肽。统计分析表明,BSA和戊二醛浓度显著影响了蛋白质从BSA橡胶(P <0.05)的释放。在BSA浓度的增加引起在上清液增加的蛋白质,而增加在戊二醛引起溶解的蛋白质的减少。

测量此牺牲材料的解离,将橡胶放置在CONTA之前称重(湿基)CT与胰蛋白酶。使用在补充图1中所示的值的酶溶液与BSA的橡胶反应,从而溶解的蛋白质,测定该橡胶放置在酶消化溶液的干燥重量的当量。处理后剩余的橡胶冻干的O / N和称重。 图5示出了溶剂影响了橡胶的解离。在BSA和戊二醛的相同浓度下,在2倍的PBS溶剂橡胶相比为1倍PBS中保留更多的材料制成。

三固体模片制成:回路模具补充图4A),稳定件( 补编图4B),和Y模图6A,左侧)。不锈钢Ÿ防霉片是使用Microlution机图6A,右)创建的。将该注塑模反应注射用30%BSA和3%glutaralde海德在2×PBS中图6B,左)。橡胶被允许在4℃反应O / N。橡胶用胶原图6B,中心)铸造,然后内切酶消化图6B,右)。初步数据表明,在pH 7.8和30℃的15小时的温度下,波塞橡胶可以与胶原蛋白支架的影响最小消化。 15小时后,将橡胶被酶和松散,以至于它离开而不影响胶原蛋白的几何特征的信道减弱。三维胶原蛋白支架创建具有特定的几何特性。 图6B(右侧)示出了胶原凝胶内的BSA的橡胶的酶消化后4毫米直径的通道。信道,用卡尺测量,以确保原尺寸维持。事实上,在胶原凝胶的新的信道是4毫米。 BSA的橡胶模具可以容纳尺寸小至300微米,这是我们测试ING稳定性模具图7)。这些支架是为剩余的戊二醛测试,我们发现Mosconas洗涤后无残留。

图1
图1. BSA橡胶(A)BSA橡胶反应。戊二醛通过创造共价键的交联BSA。 (B)BSA橡胶。不同浓度的BSA的,戊二醛的浓度和溶剂型铸造了24孔板,并在4℃下反应O / N。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. BSA橡胶的应力-应变曲线。BSA RU的应力-应变曲线 bbers。 (A)的2倍PBS 30%BSA 3%戊二醛; (B)在1×PBS中的30%BSA的3%戊二醛; (C)在2×PBS中的20%BSA的3%戊二醛; (D)的20%的BSA 2%在1×PBS中的戊二醛(3个循环)。曲线交流表明有一些hysteris,但返回到其原来的形状的橡胶。样品D示出了具有非常低的弹性模量,可以轻松地在装卸过程永久变形的橡胶。样品A和B表现出非常相似的行为如在图表上的E(代表每个样品的一个周期)一种装卸周期看到。弹性是由固定剂的浓度和(F)中使用的溶剂的影响。样品显示在模量显著增加与增加的盐(** P <0.05)。较高的固定剂浓度引起了BSA的橡胶的弹性的显著增加(* P <0.05)。ARGET =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.反应波塞橡胶的崩解的速率,作为固定剂的增加,反 ​​应速率为在1×PBS中(A)中,2×PBS中(B) (C)的所有样本减小。在2X PBS 40%BSA 2%戊二醛显示反应率最高的国家之一。这是由于在制造的BSA蛋白质同质遇到的困难。 (蓝:20%BSA,紫:30%BSA和红:40%BSA)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.蛋白质quantifi酶消化后的阳离子。作为固定剂的增加,从橡胶溶解蛋白质为在1×PBS中(A)中,2×PBS中(B) (C)的所有样本减小。 (蓝:20%BSA,紫:30%BSA和红:40%BSA)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.橡胶消化。我们确定橡胶通过比较起始和结束干基产品消化的量。我们获得了6%的戊二醛样品消解量最少,并在1X PBS最在30%BSA 2%戊二醛。 请点击此处查看该图的放大版本。

ove_content“FO:保together.within页=”1“> 图6
图6.支原型。(A)分支血管的表示。在左侧显示处于Mastercam的创建的固体,将其转化至G的代码,并使用Microlution 363-S右侧所见制成。不锈钢模具件代表一种具有两个3mm的流出通道4毫米的流入通道。 (B)3D胶原支架。显示在左边是使用上面示出的模具所作的BSA的橡胶。的中心示出了嵌在胶原凝胶的橡胶。显示在右边是胶原蛋白支架后,橡胶酶切内留下的通道。 请点击此处查看该图的放大版本。

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg“/>
图7. BSA通道。为300μm的BSA通道从稳定性件模具中取出。有绕通道脱模剂的薄层。额外的区域在显微镜下清楚地区分和可方便取出。 请点击此处查看该图的放大版本。

BSA(%) 戊二醛(%)
20 2
20 3
20 6
三十 2
三十 3
三十 6
40 2
40 3
6

使用三种不同的溶剂比为1: 表1 的BSA橡胶参数 BSA和固定剂被在4混合。

样品 电导率(毫秒/厘米) pH值
BSA(%) 溶剂
三十 2X PBS 11.43 7.06
三十 1X PBS 6.35 7.05
三十 DI 2.39 6.76
20 2X PBS 13.00 6.92
20 1X PBS 8.67 7.09
20 DI 2.08

表2.电导率和BSA的样品pH值。 BSA的溶液的电导率和pH值在不同的溶剂的存在下进行测定。在传导性的增加2倍和1倍的PBS之间示出。

6
BSA(%) 戊二醛(%) 溶剂 意见
20 2 1X PBS 软,易变形材料
20 3 1X PBS 软但比2%戊二醛更坚固
20 6 1X PBS 生硬,有点脆
三十 2 1X PBS 一致性好
三十 3 1X PBS 一致性好
三十 6 1X PBS
40 2 1X PBS 创建凝胶/橡胶一致性很不一致
40 3 1X PBS 一致性沿样品变化
40 6 1个PB小号
20 2 2X PBS 软,易变形材料,但比1X PBS样品更坚固
20 3 2X PBS 软,但高于2%的围追堵截
20 6 2X PBS 一致性好
三十 2 2X PBS 一致性好,比1X PBS更studry
三十 3 2X PBS 一致性好,比1X PBS更studry
三十 2X PBS 良好的混合性,但脆
40 2 2X PBS 一致性沿样品变化
40 3 2X PBS 一致性沿样品变化
40 6 2X PBS 一致性沿着样品而变化,它是脆
20 2 没有形成凝胶/橡胶材料
20 3 形成凝胶,但似乎于T围追堵截他的1X PBS和2倍PBS,不一致
20 6 形成凝胶,但似乎比1X PBS和2倍PBS硬,不一致
三十 2 没有形成凝胶/橡胶材料
三十 3 形成凝胶,但似乎比1X PBS和2倍PBS硬,不一致
三十 6 形成凝胶,但似乎比1X PBS和2倍PBS硬,不一致
40 2 没有形成凝胶/橡胶马泰人
40 3 一致性沿样品不同 - 在上面围追堵截
40 6 一致性沿样品不同 - 在上面围追堵截

表3. BSA橡胶。BSA的橡胶反应Ø后/ N,样品的8毫米的穿刺打孔拍摄。本表包含一致性和样品的外观的某些视觉观察。

参考图1
补充图1的固体百分比。固体从每个橡胶的百分比测定(干重/湿重)。溶剂没有影响percenta固体GE(P> 0.05)。 请点击此处下载此文件。

补充图2
补充图2. 30%BSA 3%的戊二醛PBS 2倍的正弦波。样品的压缩载荷和位移显示为经过时间的函数。 请点击此处下载此文件。

补充图3
补充图3的30%的BSA 3%戊二醛2倍的PBS正弦波该应力和样品的应变计算并绘制为经过时间的功能。有一个小的相移,INDI橡胶的粘弹行为cative。 请点击此处下载此文件。

补充图4
补充图4. Mastercam的固体。(A)循环 (B)的稳定性件。设计这些采用Mastercam后,G代码,进口和使用Microlution机或使用Makerbot 3D复制解放军一块不锈钢或黄铜片。 请点击此处下载此文件。

范围 马克斯
-17 3
排量(毫米) -1.5 0.3
1级 2级 频率(Hz) 周期
正弦 -15 -3 1 5000
数据采集
扫描时间 1.008
扫描点 360
扫描数</ TD>
后续扫描 扫描之间的1.008秒

补充表1.压缩测试参数。使用正弦波,四个类型的橡胶被确定的载荷和位移之间的关系。 请点击此处下载此文件。

方差分析结果
DF SS 女士 F 意义˚F
回归 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
残留 20 1.40E + 01 6.99E-01
23 9.99E + 02
回归分析
系数 标准错误 t统计值 P值
截距 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA(%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
戊二醛(%) 3.17E-01 </ TD> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
溶剂 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

补充表2.物中的BSA橡胶的百分比的统计分析。的BSA和戊二醛显著影响的固体的百分比。溶剂不影响固体的百分数。 请点击此处下载此文件。

方差分析结果
DF SS 女士 F 意义˚F
回归 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
残留 7 6.07E + 04 8.67E + 03
10 3.67E + 05
回归分析
系数 标准错误 t统计值 P值
截距 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
BSA(%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
溶剂 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
戊二醛(%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

补充表3.与PBS的浓度的弹性模量的统计分析。在PBS中浓度显著影响的弹性模量。在溶剂中盐的增长导致了价格弹性模量的增加。 请点击此处下载此文件。

方差分析结果
DF SS 女士 F 意义˚F
回归 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
残留 60 3.34E-14 5.57E-16
63 3.96E-14
回归分析
系数 标准错误 t统计值 P值
截距 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA(%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
戊二醛(%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
溶剂 -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

补充表4.反应速度后酶切15小时。戊二醛浓度显著影响橡胶在更高浓度的戊二醛减少的消化反应速度的统计分析。 请点击此处下载此文件。

P值
方差分析结果
DF SS 女士 F 意义˚F
回归 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
残留 62 4.20E-15 6.78E-17
65 1.16E-14
回归分析
系数 标准错误 t统计值
截距 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA(%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
戊二醛(%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
溶剂 -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

补充表5后酶消化24小时的反应速度的统计分析。的BSA和戊二醛浓度显著影响橡胶的消化的反应速率。在较高的戊二醛浓度,还有在T下降他的反应速度。在较高浓度的BSA,有一个增加反应速度。 请点击此处下载此文件。

方差分析结果
DF SS 女士 F 意义˚F
回归 3 3.10E-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64E-11
残留 64 2.42E-15 3.78E-17
67 5.52E-15
回归分析
系数 标准错误 t统计值 P值
截距 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA(%) 2.13E-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
戊二醛(%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
溶剂 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

补充表6.后酶消化48小时的反应速率,BSA和戊二醛浓度的统计分析显著影响了橡胶的消化的反应速率。在较高浓度的戊二醛,存在反应速度下降。 请点击此处下载此文件。

方差分析结果
DF SS 女士 F 意义˚F
回归 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
残留 61 1.46E-15 2.39E-17
64 3.64E-15
回归分析
系数 标准错误 t统计值 P值
截距 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA(%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
戊二醛(%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
所以lvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

补充表7后酶消化72小时的反应速度的统计分析。的BSA和戊二醛浓度显著影响橡胶的消化的反应速率。在较高的戊二醛浓度,存在于反应速率的降低。在较高浓度的BSA,有一个增加反应速度。 请点击此处下载此文件。

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Discussion

生物制造是在生物学和工程学原理合并产生模仿自然组织复杂的材料高度多学科领域。为了达到这个目的,有必要开发使用从体内组织收集到的信息,并将其转换成一个在体外的支架技术。以这种方式,平台可改造成非常类似于体内组织的建筑,功能,和机械性能。最佳的支架材料应具有一定的性质,例如是生物相容的,模仿的感兴趣的组织的机械性能,能够受控降解的,能够支持细胞活力,并能够允许组织重塑2,3。

制造技术的众多已发展到产生可行的,立体的结构。这些技术可分为两大类:常规的ð推进。现有技术包括使用合成的和天然的传统材料,以使多孔结构。一些实例是溶剂浇铸,冷冻干燥,和熔融成型。这些技术的缺点包括在结构内的孔隙率的控制差(孔径和孔互连性)和难度使得支架内的内部通道。先进的技术包括光固化,成型,3D打印,静电和等等1。这些技术有缺点,例如,缺乏长程微通道,材料选择,以提供最佳的机械强度,同时能够通过小直径喷嘴,优化依赖于材料分配的,需要大量的后处理可能是有毒的,并且限制在体外构建体内部结构的设计。在3D打印的一个主要缺点是足够的细胞生物材料载体的可用性的同时,还具有保持规定的建筑机构12所需的机械性能。这里介绍的技术结合常规和先进的制造技术。两全其美是从计算机辅助制造到创造,或进口,与酶不稳定橡胶的发展所需要的架构的融合而得。不锈钢模具用铣床创建的,但它们的制作方法并不限于这种技术。使用3D打印机例如,Makerbot),相同的模具从聚乳酸(PLA)制造。负模具用的CAD程序,它提供了创建特征的一种简单而可靠的传输到任何物质固体模具设计建筑指令研磨。这种技术是显著在于它不仅允许外部组织组合物的控制,而且还高度复杂的内部结构。工作这里提出主要集中于BSA的橡胶,其可以混合均匀,在合理的时间量被容易消化的表征,是在其结构中的改变抗性,并且是能够模仿分钟的功能,同时在铸造过程中保持其稳定性。这种技术的局限性进行了测试和牺牲材料的分辨率可维持的尺寸小到300微米的直径。 然而 ,图7表明该信道是由脱模剂的薄层围绕。使用显微镜,这种额外的地区是明确区分,并可以拆下来有需要的尺寸。这种生物制造技术允许的各种各样的,范围从宏观到微观尺度内部结构的复制。

血清白蛋白是在循环系统中最丰富的蛋白质。由于蛋白质是聚电解质,溶解度通过静电相互作用来确定15-17,它已经显示,在低盐浓度,有一种盐析蛋白质中促进其溶解性18上的效果。戊二醛是导致在白蛋白的性质的改变的交联剂。 图1中看到的颜色变化归因于醛亚胺键19-21的形成。戊二醛与BSA通过赖氨酸的氨基主要反应形成的分子间共价键14。数据表明,盐的增加而提高了橡胶的弹性(从1×PBS中2倍PBS)中。较高浓度的戊二醛生产更严厉的凝胶是先前设置相比,低浓度的。然而,它们更难以分配,均匀混合,并且它们形成脆的凝胶。交付的BSA橡胶适量到模具中,组件的每一个部分必须保持冷,因为更高的温度下加速的戊二醛与BSA反应。理想的橡胶(30%BSA在2倍PBS或1x PBS 3%戊二醛),表现为能够承受负荷而不会永久变形粘弹性材料。处理和周围的BSA的橡胶结构铸造材料时,这变得非常重要。

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶水解的蛋白质。胰蛋白酶是具有较高的切割特异性一种广泛使用的酶。它主要裂解肽链在氨基酸赖氨酸的羧基侧和精氨酸22。 BSA是在低浓度下易溶于水,而胰蛋白酶容易消化的BSA的橡胶留下胶原完好和相对不变。该材料不会与细胞的任何接触。该构建体测试了游离戊二醛的存在和没有这种固定剂的痕迹。这显示了BSA的橡胶作为生物制造牺牲材料的功效。在这个协议中,胶原被用作支架材料,但任何加时赛可以用她的材料,是抗胰蛋白酶的消化。

今后的工作将集中于由播种内皮和成纤维细胞的支架重构的水凝胶中的血管的组件。面临的挑战之一是在整个该模拟天然三维分布通道的内部创建的细胞的均匀分布。为了解决这个问题,一个策略是正在开发,允许密封或通道的堵塞和细胞悬浮液的注射。测试的材料是普朗尼克F127,它是热可逆凝胶,液体在4℃和固体在30℃以上23,24。普朗尼克高浓度的成功创造了必要的时间印章。细胞悬液是该支架的通道内之后,直到细胞粘附在三维结构的所有侧面的实体被旋转为一个特定的时间量。内部通道将有保持足够的媒体细胞的存活。普卢兰尼克保持其凝胶形式,并且在水性环境中容易溶解。一旦细胞附着,水凝胶将与媒体被淹没,并且可以在静止的或流动的条件下,进行培养取决于研究的目的。这一方法将进一步评估,而且将成为了遵循本出版物。本文描述的生物制造技术目前正在用于开发人类肾动脉的支架复制品。同样的方法可以与其他类型的组织,如心脏来完成,该技术的适用性扩展到了广泛的临床应用。

在这里开发的生物制造技术在体外支架,能够快速,可靠地概括内在几何特征的一代向前迈进了一步。天然材料,如胶原蛋白,被选中是因为它提供了最佳的化学和物理线索细胞合成材料上。这些呐王兴仁材料可用于治疗的研究,开发,畸形和疾病组织的体外模型 ,以及用于替换受损组织。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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