الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Arenaviruses هي عائلة يلفها فيروسات الحمض النووي الريبي واحدة الذين تقطعت بهم السبل، التي يتم الاحتفاظ بها في المقام الأول في القوارض في الطبيعة 1-3. في حين أن هذه الفيروسات عادة بإنشاء عديمة الأعراض والتهاب مستمر في الخزانات القوارض 1،2، فإنها يمكن أن تسبب المرض الشديد في البشر 3. وتشمل الأنواع المسببة للأمراض الهامة الفيروس العالمي الجديد جونين (JUNV) (4) وفيروس العالم القديم لاسا والتي هي وكلاء خاص بأسباب الأمراض الحمى النزفية الأرجنتينية في أمريكا الجنوبية وحمى لاسا في أفريقيا، على التوالي. الليمفاوي فيروس التهاب السحايا المشيمي (LCMV)، وفيروس prototypic الأسرة له توزيع في جميع أنحاء العالم، وهي مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الحالات المرضية بما في ذلك التهاب السحايا العقيم في الأفراد المناعة عيوب خلقية خطيرة في الجنين أو القتل العالية في كبت المناعة الأشخاص التالية أسماؤهم الصلبة الجهاز زرع 8،9. عدم وجود الولايات المتحدةوافق عليها إدارة الغذاء والدواء (FDA) اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات فعالة لمكافحة هذه الفيروسات يسلط الضوء على الحاجة الماسة إلى وضع استراتيجيات جديدة لاستهداف علاجيا هذه الجراثيم الناشئة / إعادة الناشئة.

يتكون الجينوم الفيروسة الرملية من جزأين واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي، وكبير (L) (~ 7.2 كيلوبايت) والصغيرة (S) (~ 3.6 كيلو بايت) شرائح 10. الجزء S بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري مغلف (GP) في حين أن شريحة L بترميز البلمرة الفيروسي (L) والبروتين مصفوفة (Z). يتم تعبئتها من L و S شرائح الحمض النووي الريبي الجينوم (vRNAs) في virions 10-12. الخطوة الأولى للعدوى الفيروسة الرملية هو مرفق من الجسيمات الفيروسية لاستضافة الخلايا من خلال التفاعل بين GP الفيروسي ومستقبلات الخلايا المضيفة المقابلة لها والتي، على JUNV، يتضمن ترانسفيرين مستقبل بشري 1 (hTfR1) 13،14. وعقب المرفق، يتم أخذ جزيئات JUNV داخل الخلية عبر بوساطة بالكلاذرين الإلتقام 15.الجسيمات ثم المرور إلى أواخر الاندوسوم حيث درجة الحموضة منخفضة من هذا الحيز مشغلات تفعيل GP 16،17. تنشيط مرة واحدة، وترميز GP إدراج الانصهار الببتيد في غشاء endosomal، وبدء الانصهار بين الأغشية الفيروسية وendosomal. النتائج الاندماج الناجحة في الإفراج عن vRNAs المعبأة الفيريون إلى السيتوبلازم، حيث أنها بمثابة نماذج للنسخ المتماثل الجيني والنسخ. عندما تتولد كميات كافية من البروتينات وvRNAs الهيكلية الفيروسية، والجسيمات الجديدة بالتجمع وبرعم من الخلية المصابة لاستكمال دورة الحياة 18.

لتسهيل اكتشاف استراتيجيات جديدة لاستهداف علاجيا وarenaviruses المسببة للأمراض، وركزت مجموعتنا على تحديد العوامل المضيفة التي تعتبر بالغة الأهمية لانتشار الفيروس، ولكن يمكن الاستغناء عنها للمضيف. في هذا السياق، وتحديد مرحلة دقيقة (ق) من دورة حياة الفيروس التي تسيطر عليها عوامل المضيف مثل هذه لا بد من توجيهتطوير الاستراتيجيات المضادة للفيروسات. هنا، نحن تصف (ف) فحص الكمي استنادا RT-PCR والتي يمكن استخدامها لقياس التعلق خلية الفيروسة الرملية لغرض تحديد ما إذا كانت بروتينات المضيف المحدد و / أو الجزيئات المضادة للفيروسات تؤثر هذه المرحلة الأولية من دخول الفيروس 19. وقد ظهرت أساليب بديلة لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلايا virions المسمى مع البيوتين 20، الأصباغ الفلورية 21، أو النظائر المشعة 22. عيوب هذه الطرق يمكن أن تشمل متطلبات كميات كبيرة من الفيروس المدخلات (مولتيبليكيتييس عالية من العدوى (وزارة الداخلية))، واستخدام النشاط الإشعاعي، و / أو التعامل معها خطوات إضافية لإعداد فيروس الإدخال (مثل التركيز و / أو وضع العلامات من الفيروسات) . على وجه الخصوص، واستخدام عالية وزارة الداخلية يجعل من الصعب التمييز الإنتاجي مقابل الأحداث التعلق غير منتجة 15،23. مقايسة على أساس QRT-PCR وصفها هنا يمكن الكشف عن أحداث المرفق باستخدام عدد قليل من 20 لوحة لوحدات مينغ (PFUs) من الفيروس، وهو ما يترجم إلى وزارة الداخلية من 0.0004 لوحة 48-جيدا. ولذلك، فإن حساسية قوية للمقايسة يتغلب متطلبات عالية وزارة الداخلية، فضلا عن أي خطوات وضع العلامات فيروس أو التركيز. وعلاوة على ذلك، يمكن للفحص أن يكون ط) تكييفها لقياس الفيريون الإلتقام وكذلك الإفراج عن جينوم الفيروس إلى السيتوبلازم بعد الانصهار والثاني) مصممة خصيصا للاستخدام مع الفيروسات الأخرى من خلال تطوير الكواشف QRT-PCR الفيروس محددة (للحصول على أمثلة، انظر 24-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ بروتوكول صفها من استخدام صارمة تقنية قبل PCR (انظر 28 لمحة عامة ممتازة حول كيفية انشاء مختبر قبل PCR وكيفية إجراء التجارب باستخدام تقنية جيدة قبل PCR). لا بد من أن جميع الكواشف والمعدات خالية من تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف QPCR والضوابط المناسبة في مكانها الصحيح لاكتشاف مثل هذا التلوث. ويظهر لمحة عامة عن البروتوكول في الشكل 1.

1. إعداد وسائل الإعلام وخلايا البذور في لوحات 48-جيدا

  1. إعداد 500 مل من اكتمال Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين ستربتومايسين، و 1٪ HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-الإيثان حامض السلفونيك) حل العازلة بإضافة 50 مل الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 5 مل كل من البنسلين، الستربتوميسين و100X HEPES حل العازلة 100X إلى زجاجة 500 مل من DMEM. يمكن تخزين هذا الكاشف في 476؛ مئوية لمدة أشهر.
  2. البذور 2.5 × 10 4 خلايا الفيرو E6 في بئر في لوحة زراعة الأنسجة 48-جيدا في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من اكتمال DMEM. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 ل10-18 ساعة.
    1. البذور لوحة في نهاية يوم العمل. اختبار كل عينة الفيروس في إما مكررة أو ثلاث نسخ الآبار.
      ملاحظة: في حين يوصف منصة 48 على أساس جيد لهذا الاختبار، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن توسيع نطاق الفحص وصولا لاستخدامها في 96- أو لوحات 384 جيدا.

2. تنفيذ مرفق فيروس الخلية

ملاحظة: الفيروس المستخدمة في هذا البروتوكول، JUNV سلالة صريح # 1 (C # 1)، وقد استخدمت بنجاح كلقاح حي مخفف للوقاية من مرض JUNV 29. وقد استمدت JUNV C # 1 من ضراوة XJ JUNV سلالة من خلال مرور التسلسلي سواء في المجراة في المختبر ويختلف من سلالة XJ الوالدين بنسبة 12 الأحماض الأمينية 30. Becausالبريد JUNV C # 1 هو مستوى السلامة الحيوية (بي إس إل) في التصنيف -2 الممرض، يجب أن يتم العمل الموصوف في هذا القسم من استخدام المناسبة BSL-2 الممارسات 31. ويشمل ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية (مثل حماية العين، ومعطف المختبر، والقفازات مزدوجة)، والسلامة البيولوجية مجلس الوزراء من الدرجة الثانية، والتأكد من أن جميع الموظفين قد تلقوا التدريب المؤسسي والموافقات المطلوبة للتعامل مع بأمان هذا الحي.

  1. تمييع JUNV C # 1 عينة (ق) لفحصها لPFUs المطلوبة أو تركيز وحدات تشكيل في الجليد الباردة الكامل DMEM وتخزينها على الجليد حتى جاهزة للإضافة إلى كل بئر.
    ملاحظة: كبديل لإجراء الدراسات ملزمة مع فيروس مخففة في الكامل DMEM، واستخدام وسيلة الحد الأدنى تحتوي على برنامج تلفزيوني مع تركيز انخفاض المصل (2٪) والعازلة المناسبة لتحديد ما إذا كان المصل قد يسبب تشويشا مع مرفق الفيروس. وذكرت والبروتوكولات مرفق مشابهة للبحث عن الفيروسات البديلة استخدام RPMI 1640 وسيط وبدون bicarboنيت تحتوي على 0.2٪ ألبومين المصل البقري، 10 ملي (2- (morpholino) حمض ethanesulfonic)، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.8 32. قد تكون هذه الوسائط ملزمة متفوقة على منع التغييرات الرقم الهيدروجيني التي يمكن أن تحدث عند إزالة وسائل الاعلام من -environment CO 2 الحاضنة.
    1. تطعيم الآبار مع PFUs تتراوح ما بين 200 إلى 2000 للحد من أحداث التعلق غير منتجة. كما هو مبين في الشكل 2، هذا الاختبار قادر على اكتشاف المرفق باستخدام عدد قليل من 20 PFU (أو ما يصل إلى 2 × 10 6 PFU).
    2. خلق مزيج الرئيسي من الفيروسات للتلقيح على الخلايا. سيتم تلقيح كل عينة الفيروس على الآبار مكررة في حجم 50 ميكرولتر لكل بئر. لذلك، إذا كان المطلوب إضافة 2000 PFUs من الفيروس لكل بئر، وتمييع 4800 PFUs إلى إجمالي حجم 120 ميكرولتر من الجليد الباردة استكمال DMEM.
      1. للسيطرة على خصوصية الفحص، استخدام زوج متطابق من الهامستر الصيني خطوط الخلايا المبيض إما لا تعبر عن TfR1 (TRVb) أو إكسبيجب ريس hTfR1 (TRVb-1) كما JUNV مرفق لهذه الخلايا إما أن تخفض أو لا، على التوالي 13،33. بدلا من ذلك، علاج الخلايا مع البروتيني مثل بروتين كاف لمنع التعلق الفيروسة الرملية 34 أو دخول 35. ويمكن أيضا اعتبار للذوبان hTfR1 أو ch128.1 الأجسام المضادة monocolonal، التي هي محددة لhTfR1، كما هي معروفة لمنع دخول JUNV إلى خلايا 13،36. بالإضافة إلى ذلك، المعالجة الخلايا مع المانوز الحرة 14 أو حضانة الجسيمات مع تحييد الأجسام المضادة-JUNV محددة 37 يمكن أن تمنع دخول الفيروس.
      2. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذه الكواشف والنهج الأخيرة، على الرغم من منع دخول JUNV، لم تتأكد لمنع المرفق، على الرغم من أن هذا هو التفسير المحتمل. ويمكن استخدام بروتوكول صفها هنا لتحديد رسميا ما إذا كانت هذه الطرق المختلفة مرفق تأثير الفيريون.
  2. إزالة لوحات من الحاضنة 37 درجة مئوية ووضع إما في 4 درجات مئوية الثلاجة أو على الجليد لمدة 15 دقيقة لكبح قدرة الخلايا مطلي لتنفيذ الإلتقام.
  3. بعد ذلك، نضح DMEM الكامل من كل بئر وغسل بسرعة كل بئر مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني (فوسفات مخزنة المالحة) ودرجة الحموضة 7.4. ثم إضافة 50 ميكرولتر من عينات الفيروس قبل المخفف (المعد في الخطوة 2.1) إلى الآبار المناسبة.
  4. التفاف لوحة في غلاف بلاستيكي ووضع على الفور إما العودة على الجليد أو في 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة 1 و 1.5 ساعة للسماح مرفق فيروس تحدث. الحفاظ على لوحة، وغسل العازلة، وعينات فيروس البرد في 4 درجات مئوية طوال هذه الخطوة.
  5. بعد الانتهاء من 4 درجات مئوية الحضانة، ونضح قيحة الفيروس وغسل كل بئر 3 مرات مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.

3. الفيروسي RNA استخراج

  1. تنقية RNA الفيروسي من JUNV C # 1 الجسيمات المعلقة على الطبقات الوحيدة باستخدام طقم التجارية (على سبيل المثال، RNeasy عدة البسيطة) أكوردينغ لبروتوكول الشركة المصنعة. على وجه التحديد، اتبع "تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا الحيوانية باستخدام بروتوكول التكنولوجيا تدور" في الصفحات 23-28 في دليل البسيطة RNeasy (الطبعة ال 4 أبريل 2006) مع التعديلات الواردة أدناه.
    1. ليز الخلايا كما هو مشروح في خطوة 1B وذلك بإضافة 350 ميكرولتر من RLT العازلة تحلل مباشرة إلى كل بئر. مزيج المخزن المؤقت عدة مرات لضمان تحلل الخلية. لاحظ أن الخلايا ليز بسهولة في هذا المخزن المؤقت وتحلل كامل يمكن التحقق منها عن طريق عرض الآبار تحت مجهر مقلوب.
    2. نقل ينتج عن ذلك من المحللة الخلية إلى العمود عدة (الخطوة 3A) واتبع باقي البروتوكول كما هو موضح. عند هذه النقطة، تم تحييد الفيروس عن طريق المخزن المؤقت تحلل ذلك يمكن أن يتم تنفيذ الخطوات المتبقية من بروتوكول خارج مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية شريطة عدم أنابيب عدة ليست ملوثة بفيروس المعدية.
    3. تتضمن الخطوة الاختيارية 9 من بروتوكول الشركة المصنعة، الذي هو المضافاتIONAL الطرد المركزي لعمود الدوران للقضاء على أي المرحل ممكن من الاحتياطي RPE.
    4. في الخطوة النهائية بروتوكول الشركة المصنعة (الخطوة 10)، أزل الحمض النووي الريبي تنقيته من عمود الدوران باستخدام 30 ميكرولتر من nuclease خالية ده 2 O. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية في هذه المرحلة أو استخدامها مباشرة في فحص QRT-PCR. لمنع تدهور عينات الحمض النووي الريبي الفيروسية تنقيتها من nucleases، استخدام الكواشف والمعدات nuclease خالية والحفاظ على عينات الحمض النووي الريبي إذابة على الجليد.
      ملاحظة: المخازن RLT وRW1 تحتوي على الملح غوانيدين ويجب أن لا تكون مختلطة مع مواد التبييض. يحتوي عازلة RW1 الإيثانول.

4. QRT-PCR قياس الجينوم الفيروسي

  1. لتحويل JUNV C # 1 شريحة S RNA إلى كدنا] لQPCR لاحق، تعرض RNA الفيروسي (ولدت في الخطوة 3.1.4) لRT في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر.
    1. لإعداد رد فعل RT، أولا إنشاء مزيج الرئيسي يحتوي على كل من الكواشف التالية في رد الفعل: 6.75 ميكرولتر من نوكليازخالية ده 2 O و 5 ميكرولتر من الأوراق المالية 2 ميكرومتر من RT التمهيدي S 2098- 2075- ل(5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3)، وهو مكمل للمنطقة NP الجزء S RNA الجيني، 5 ميكرولتر من العازلة 10X PCR الثاني، 11 ميكرولتر من 2 الحل 25 مم MgCl، 1.25 ميكرولتر (62.5 حدات) من RT انزيم، 1 ميكرولتر (0.4 وحدات) من المانع ريبونوكلياز، و 10 ميكرولتر من 500 ميكرومتر الأسهم من dNTPs.
      ملاحظة: أثناء النسخ المتماثل الفيروسة الرملية، يتم إنشاء 4 أنواع شريحة S RNA الفيروسي: الحمض النووي الريبي كامل طول الجينوم (vRNA)، كامل طول antigenomic RNA (vcRNA) (هذا هو تكملة العكسي من vRNA)، واثنين من mRNAs subgenomic ترميز الجينات NP وGP، على التوالي. التمهيدي RT المذكورة هنا غير محددة فقط لشريحة S vRNA، ولكن ليس vcRNA، NP مرنا، أو GP مرنا.
    2. المزيج بلطف مزيج الرئيسي RT ثم قسامة 40 ميكرولتر إلى الفردية 0.2 مل أنابيب PCR. إضافة 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى كل أنبوب. تشمل ط) أنبوب أي سيطرة قالب (على سبيل المثال. إضافة 10 ميكرولتر من ده nuclease خالية من 2 O 40 ميكرولتر من مزيج الرئيسي) والثاني) على أي سيطرة إنزيم RT (على سبيل المثال إضافة 10 ميكرولتر من المصابات يعرف عينة الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى 40 ميكرولتر من مزيج الرئيسي التي لم تتلق أي إنزيم RT) للكشف عن تلوث الكواشف RT مع تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف الفيروسي. تشمل الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا غير المصابة مع مزيج الرئيسي RT الكامل للسيطرة على خصوصية فحص في وجود الحمض النووي الريبي الخلوية.
    3. بالإضافة إلى ذلك، تشمل عينة الحمض النووي الريبي الفيروسية إيجابية معروفة للمزيج الرئيسي الكامل للتحقق من جودة الكواشف RT. لاحظ أن حجم رد الفعل RT يمكن خفضها الى 25 ميكرولتر إذا لزم الأمر.
  2. تعرض أنابيب RT لظروف الدراجات التالية: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 48 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لاحظ أن العينات يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة أو ترك بين عشية وضحاها في thermocycler بإضافة C خطوة 4 درجات.
  3. Perform QPCR في الحجم الكلي لل25 ميكرولتر.
    1. جعل مزيج الرئيسي QPCR عن طريق الجمع بين ما يلي: ميكرولتر 2.5 (السهم 9 ميكرومتر) من كل التمهيدي PCR إلى الأمام S1937 + ل1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') وعكس PCR التمهيدي S 2001- 1982- إلى (5 "-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3)، 2.5 ميكرولتر (السهم 2 ميكرومتر) من QPCR التحقيق S 1960+ ل1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3)، و 12.5 ميكرولتر من سيد 2X عالمية QPCR مزج. لاحظ أن التمهيدي إلى الأمام ذكرت هنا، والتي هي محددة لJUNV C # 1، يختلف من 1 الإقليم الشمالي من تسلسل التمهيدي ذكرت في الأصل 38، الذي يستهدف JUNV سلالة فتاكة روميرو.
    2. المزيج بلطف الحل ومن ثم إضافة 20 ميكرولتر من كل QPCR جيدا. إضافة 5 ميكرولتر من كل رد فعل RT إلى الآبار QPCR المناسبة. إجراء QPCR في ثلاث نسخ لكل عينة اختبار. لاحظ أن حجم رد الفعل PCR يمكن خفضها الى اقل من 12.5 ميكرولتر إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: البرنامج المرتبطالجهاز سوف QPCR توليد أرقام نسخة المطلقة JUNV C # 1 شريحة S RNA الجيني من خلال مقارنة قيمة كل عينة غير معروفة لسلسلة من التخفيفات القياسية البلازميد ترميز JUNV C # 1 NP الجين، وهو الهدف من التمهيدي QPCR والتحقيق تعيين. فحص QPCR يمكن أن توفر فقط الكميات للقيم التي تقع ضمن نطاق المنحنى القياسي. لهذا السبب، وتشمل الكميات التالية البلازميد (في الآبار ثلاث نسخ): 5، 50، 5 × 10 5 × 10 و 5 × 10 7 نسخ لكل بئر.
  4. تحميل لوحة QPCR في thermocycler وتشغيل ظروف التفاعل التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    1. جمع وتحليل البيانات لتحديد كمية الفيروسي RNA موجودة في كل عينة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. لإنشاء منحنى قياسي باستخدام عينة تنقيته حديثا البلازميد التي تحتوي على القطران QPCRالحصول على تسلسل، أولا تحديد عدد نسخ البلازميد في هذا الحل.
    1. حساب الوزن الجزيئي للالبلازميد. إذا كان يعرف تسلسل البلازميد بأكمله، وحساب هذا باستخدام الصيغة التالية: MW = ([A * 312.2] + [G * 328،2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). تذكر لتشمل عدد من النوكليوتيدات معينة وجدت في كل فرع من البلازميد المزدوج تقطعت بهم السبل.
    2. إذا كان يعرف حجم البلازميد ولكن تسلسل الدقيق هو لا، وحساب ميغاواط في ظل افتراض أن كل زوج قاعدة dsDNA له ميجاوات من 600.
      ملاحظة: pCAGGS-JUNV C # 1 NP البلازميد المستخدمة هنا ديها ميجاوات من 4.2 × 10 6.
    3. مرة واحدة وقد تم تحديد ميجاوات من البلازميد، وحساب كم نسخة لكل ميكرولتر موجودة في المحلول البلازميد.
    4. أولا حساب ميكروغرام إجمالي البلازميد في الحل، ثم تحويل هذا إلى الشامات البلازميد (على سبيل المثال إذا كانت مضمنة 69 ميكروغرام البلازميد في 300 ميكرولتر من الماء، ثم 6.9 × 10 -5 ز البلازميد * 1 الخلد / 4.2 × 10 6 ز البلازميد = 1.6 × 10 -11 الشامات البلازميد)، والتي يمكن تحويلها إلى نسخ عدد (على سبيل المثال 1.6 × 10 -11 الشامات البلازميد * 6.022 × 10 23 الجزيئات / الخلد = 9.8 × 10 12 الجزيئات (أو نسخ)).
    5. تقسيم مجموع نسخ البلازميد في حل البلازميد من حجم هذا الحل للحصول على نسخ لكل ميكرولتر (على سبيل المثال 9.8 × 10 12 نسخة / 300 ميكرولتر = 3.28 × 10 10 نسخ).
    6. تمييع هذا الحل مناسبا بحيث يمكن تحميل 5 مجلدات ميكرولتر على لوحة PCR لتقديم مجموعة من الأرقام نسخة اللازمة لإنشاء منحنى قياسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتدليل على حساسية والنطاق الديناميكي للمقايسة QPCR، تعرضت كميات معروفة من البلازميد ترميز الجين NP من JUNV C # 1 (المدى 5-5 × 10 7 نسخ) لQPCR كما هو موضح في المادة 4 من البروتوكول. فحص حساس ويمكن الكشف موثوق قليل تصل إلى 5 نسخ من الحمض النووي الهدف (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، والنطاق الديناميكي للمقايسة كبير و، كما هو مبين في الشكل 2، يمكن أن تغطي على الأقل 7 سجلات القالب. في حين لم تظهر، فقد اكتشفنا ما لا يقل عن 5 × 10 9 نسخ من الحمض النووي.

لتوضيح فائدة فحص لقياس JUNV C # 1 مرفق الجسيمات، وprebound كميات مختلفة من JUNV C # 1 لخلايا الفيرو E6 كما هو موضح في البروتوكول. بعد تجرف الجزيئات غير منضم، وهي lysed خلايا لتنقية RNA وتعرضوا للعينات الحمض النووي الريبي مما أدى إلى QRT-PCR. كما هو مبين في الشكل (3)، يمكن فحص الكشف عن الأحداث مرفق الفيروسية باستخدام عدد قليل من 20 أو ما يصل إلى 2 × 10 6 PFU، وهو ما يترجم إلى موييس من 0.0004 و 40، على التوالي.

كما هو مبين في الشكل (4)، فمن الممكن لتعديل بروتوكول لقياس ليس فقط مرفق الفيروسي، ولكن أيضا نسبة التضخيم من الجينوم الواردة في الجسيمات الفيروسية واردة مع مرور الوقت. هذا النهج تعديل يمكن أن تستخدم كبديل لتحديد ما إذا كان المزيد من عيوب في الخطوات المتبقية من دخول الفيروس (الإلتقام مثل الجسيمات و / أو الانصهار، والإفراج عن الجينوم الفيروسي في السيتوبلازم) يمكن أن يحدث. ومن المثير للاهتمام، تظهر كمية من الجينوم الفيروسي إلى الانخفاض خلال أول مرفق 6 ساعة التالية، مما يشير إلى أن جزءا من الجينوم الفيروسي الوارد هو المتدهورة. يمكن أن يحدث هذا الجسيمات التي لا تؤخذ في الخلية وتتحلل في extracell مساحة جزيئية أو ربما بسبب تدهور داخل الشبكة endolysosomal. توضح البيانات أظهرت أن 12 أو 18 ساعة بعد العدوى سيكون الأوقات المثلى للكشف عن تكرار الجينوم النشط.

الشكل 1
الشكل 1: تصوير من سير العمل البروتوكول الخطوات الأساسية للفحص المرفق فيروس الخلية هي 1) حضانة جزيئات الفيروس مع الخلايا عند 4 درجات مئوية للسماح للمرفق الفيروس الخلية تحدث تليها يغسل لإزالة الفيروس غير منضم، 2) تنقية من الحمض النووي الريبي الفيروسي من الخلايا، 3) النسخ العكسي (RT) لتحويل JUNV S شريحة RNA الجيني (vRNA) في كدنا]، و 4) QPCR لتعداد نسخ من JUNV S vRNA كمقياس للمرفق الفيروس الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

her.within الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: QPCR فحص للكشف عن JUNV S الجينوم قطاع حساس، ويمكن استخدامها على نطاق وديناميكية كبيرة تم اختبار JUNV S شريحة QPCR مجموعة التمهيدي مسبار لقدرته على قياس بدقة كميات معروفة (5، 16.6، 50، 5 × 10 5 × 10 5 أو 5 × 10 7 نسخة) من البلازميد مراقبة مستوى الحمض النووي ترميز تسلسل الهدف. يصور هي المؤامرات التضخيم (A) وخطوط منحنى تناسب القياسية (B). R معامل الارتباط من مجموعة التمهيدي التحقيق. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): JUNV خلايا مرفق فحص موثوق التدابيرتم prebound الجسيمات المرفق باستخدام عدد قليل من 20 PFU الخلايا فيرو E6 مع كميات معروفة من JUNV C # 1 (2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 أو 2 × 10 6 PFU) مقابل 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم إزالة الجزيئات غير منضم عن طريق الغسيل، كانت هي lysed خلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، وتعرضوا للعينات الحمض النووي الريبي مما أدى إلى QRT-PCR للكشف عن JUNV C # 1 شريحة S vRNA كمقياس للمرفق الجسيمات إلى خلايا فيرو E6. تمثل البيانات على رقم نسخة يعني لكل بئر من الآبار مكررة ± SEM.

الشكل (4)
الرقم 4: حركية JUNV C # 1 تكرارها الجينوم بعد الإصابة حضنت الخلايا فيرو E6 مع 2 × 10 3 PFU من JUNV C # 1 (وزارة الداخلية من 0.04) مقابل 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد عدة غسلات في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، وخلايا إما حصادها مباشرة (0 ساعة نقطة زمنية)أو تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة الأوقات المحددة من قبل المجموعة. في كل حالة، تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا وتعرض لQRT-PCR للكشف عن JUNV C # 1 شريحة S vRNA. وترد القيم نسخ يعني كما لكل بئر من الآبار مكررة ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول وصفنا واضح ومباشر، وقدم قوية ويلاحظ الاعتبارات الهامة التالية. أولا، يجب أن توظف صارمة قبل PCR تقنية (انظر 28 للاستعراض ممتاز). لا بد من أن جميع الكواشف والمعدات خالية من تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف QPCR والضوابط المناسبة في مكانها الصحيح لاكتشاف مثل هذا التلوث. ثانيا، للكشف عن الفيروس الخلية مرفق جزء من البروتوكول، والفيروسات، والخلايا، وسائل الإعلام يجب أن تبقى في 4 درجات مئوية لمنع الإلتقام من virions محددة السطح. ثالثا، يجب على كمية من الخلايا التي تم جمعها لاستخراج الحمض النووي الريبي لا تتجاوز قدرة الحمض النووي الريبي ملزمة للتصفية تنقية الحمض النووي الريبي. يجب حماية الرابعة، النقاء عينات الحمض النووي الريبي الفيروسية من تدهور بوساطة ريبونوكلياز من خلال استخدام الكواشف والمعدات nuclease خالية وابقائها على الجليد عند إذابة. خامسا، ومجموعة من منحنى القياسية المدرجة في فحص QPCR يجب أن تكون كبيرة بما فيه الكفايةللقبض على كل القيم لوحظ من العينات غير معروف. سادسا، ينبغي أن تدرج مكررات التقنية لكل من فيروس الخلية مرفق جزء من الفحص وكذلك QPCR من عينات الحمض النووي الريبي الفردية. السابعة، وضوابط (على سبيل المثال خطوط الخلايا التي تعبر عن hTfR1 أو لا) يمكن تضمينها للسيطرة على خصوصية الفحص. وأخيرا، يجب أن يكون جميع العاملين في التدريب على السلامة البيولوجية المناسبة والموافقة المؤسسية للتعامل مع JUNV المعدية C # 1 أو غيرها من arenaviruses المسببة للأمراض.

الجزء QPCR البروتوكول يدعو إلى التحقيق QPCR في المقام الأول لضمان خصوصية المنتجات التي يجري تضخيمها خلال كل مرحلة من مراحل تفاعل PCR. ويمكن تخفيض تكلفة الفحص، ومع ذلك، من خلال القضاء على هذا التحقيق QPCR لصالح الكيمياء QPCR آخر لا يتطلب التحقيق (مثل استخدام الصبغة غير متناظرة SYBR الخضراء أنا 25) و / أو عن طريق الحد من حجم QPCR خليط التفاعل استخدامها. إذا كان QPCR التطبيق المستقل مسباريستخدم روتش، سيكون من المهم التحقق من أن ظروف التفاعل صارمة بما يكفي لضمان خصوصية الاشعال QPCR. ومن المهم أيضا أن ندرك أن RNA الفيروسة الرملية، سواء المستخرجة من الخلايا أو virions، يمكن أن تستعد nonspecifically لتشكيل كدنا] خلال RT في ظل عدم وجود الفيروس محددة RT التمهيدي 12. لذلك، أرقام الكشف باستخدام التمهيدي RT vRNA محددة لا تعكس بدقة فقط الأنواع vRNA مستهدفة من قبل التمهيدي RT نسخ. إذا خصوصية لجينوم أو antigenome مطلوب، وقد أبلغنا وسيلة للتحايل على هذه الظاهرة فتيلة غير محددة من خلال استخدام بادئات RT البيروكسيديز والخرز streptavidin 12.

وقوة مهمة من هذا الاختبار هو حساسيته الشديدة. المقايسات مرفق الفيروسة الرملية خلية أخرى تضم بالإشعاع المسمى 22، البيروكسيديز 20 أو fluorescently المسمى-21 الجسيمات قد يتطلب موييس 0.2، 100، أو 1000، خاص بهلاي. في حين أن استخدام جسيمات النتائج المسمى بالإشعاع في حساسية جيدة، فإنه يتطلب استخدام النشاط الإشعاعي، مما يزيد من تعقيد اللوجستية والسلامة المخاوف المرتبطة بهذا الفحص بشكل خاص. طريقة تستند QPCR وصفها هنا يتطلب ما لا يزيد عن 20 PFU (وزارة الداخلية من ~ 0.0004 في لوحة 48-جيدا) ويمكن الكشف موثوق الحجز عليها مجموعة ديناميكية كبيرة من موييس (على سبيل المثال موييس ،0004-40 على الأقل) (الشكل 3 ). حساسية قوية من هذا الاختبار يجعل من الممكن استخدام منخفض موييس لقياس أكثر دقة من الأحداث ملزمة الإنتاجية عن طريق الفيروسات المعدية القياسية. حساسية عالية أيضا يقلل بشكل ملحوظ من كمية الفيروس اللازمة لفحص و، في القيام بذلك، يحد من التعامل مع الخطوات الإضافية التي قد تؤثر على نوعية virions تستخدم في الفحص (مثل البولي ايثيلين هطول القائم على غليكول من virions، واصفة virions مع fluorophores أو النظائر المشعة و / أو السكروز النطاقات من virioم). بالإضافة إلى ذلك، وفحص QPCR نفسها واضح وصريح لأداء وكذلك درجة عالية من الدقة واستنساخه.

فحص الخلايا مرفق وصف يمكن تعديلها لقياس مراحل إضافية من دخول الفيروس بما الإلتقام الجسيمات الفيروسية وكذلك الخطوة النهائية للاندماج الفيروس الذي هو الافراج عن الجينوم الفيروسي في السيتوبلازم. لقياس الجسيمات الإلتقام، سيتم اتباع نفس الخطوات البروتوكول المرفق من خلال الخطوة 2.5، والذي هو مرفق من الجزيئات إلى الخلايا في 4 درجات مئوية. عندئذ تكون درجة حرارة الخلايا للسماح للجسيمات فيروسية أن endocytosed، تليها العلاج مع البروتيني لتجريد أي virions بد من الخارج التي لم endocytosed كما هو موضح 22،24. المادتين 3 و 4 من هذا البروتوكول وبعد ذلك يتم اتباعها لاستخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي وquantitate نسخ من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي كمقياس للالإلتقام. لقياس الجينوم uncoating التالية الانصهار الأغشية الفيروسية وendosomal، سيتم prebound الخلايا معفيروس في 4 درجات مئوية، درجة حرارة (للسماح الإلتقام والانصهار) وتجريده من الجسيمات الخارجية، ومن ثم جمع لتحليلها. في نهج واحد، يمكن هي lysed الخلايا في وجود مخزن مؤقت متساوي التوتر للحفاظ على حويصلات داخل الخلايا، ومن ثم تقسيمها إلى 2 الكسور: واحد من شأنه أن تعامل مع مزيج من RNases (RNA الفيروسي غير المصقول هو عرضة للتحلل) والآخر الذي لن 39 . بدلا من ذلك، يمكن فصل الخلايا في عصاري خلوي أو endosomal الكسور 40. في كلتا الحالتين، سوف تستخدم QRT-PCR ل quantitate الجينوم الفيروسي في السيتوبلازم كمقياس للuncoating الجينوم الفيروسي. آخر، وفحص QRT-PCR يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مرفق فيروس، الإلتقام، أو الانصهار للبحث عن الفيروسات الأخرى بشرط أن تكون مصممة خصيصا لفيروس جديد لسعر الفائدة الكواشف RT-PCR (للحصول على أمثلة ترى 24-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر ماركوس ثالي، ناثان روي، كريستوفر زيغلر، إميلي بروس، وبنيامين الملك لإجراء مناقشات مفيدة والمعاهد الوطنية للصحة لدعم هذه الدراسات من خلال المنح T32 AI055402 (JK)، R21 AI088059 (جي بي)، وP20RR021905 (JB) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’
Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. Plenum Press. 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. John Wiley & Sons Ltd. (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. CRC Press. 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58, (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics