בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dutzan, N., Abusleme, L., Konkel, J. E., Moutsopoulos, N. M. Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network. J. Vis. Exp. (108), e53736, doi:10.3791/53736 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

רקמות חניכיימיים המקיפות את האדם השיניים בעכברים ונחשפות כל זמן אל ביופילם המורכב של שן 1. רשת תא חיסון שיטור מכשול החניכיים היא חיונית לשמירה על שלמות רקמות, הבטחת הומאוסטזיס עם חיידקי commensal מקומיים, בעת ובעונה אחת, מתן חסינות יעיל נגד אתגר פתוגניים 2. כדי להשיג הומאוסטזיס, מערכת החיסונית מותאם בקפידה לסביבת חניכיימיים יצירת רשת תא חיסון בעלי התמחות גבוהה, עדיין קצת בפירוט ידוע של אוכלוסיות תאי חיסון חניכיימיים ותפקידם בשמירת רקמה חסינה 2.

כאשר הומאוסטזיס חיסוני מופר על החניכיים, בין אם באמצעות רגישות מארחת מוגברת ו / או נוכחות של קהילות מיקרוביאלי dysbiotic, מצב דלקתי, חניכיימיים עולות 3 4. חניכיים היא מחלה דלקתית נפוצה, שמוביל לאובדן השן sמבני upporting. במקרים חמורים שלה הוא נתפס בתוך כ -10% מכלל אוכלוסיית 5. הביתור הגורמים המרכזיים המעורבים הרגישות חניכיים והתקדמות הוכיחה קשה 6. עם זאת, במודלים של בעלי החיים היו מאוד שימושיים בהבנת מנגנוני חניכת חניכיימיים והתקדמות 7. מודלים יכולים להיות מועסקים על מנת להגדיר את אוכלוסיות תאי מפתח ומתווכים מולקולריים כי הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס חיסון ופיתוח כונן של מיסב שן. תובנה כזו תהפוך הבנתנו שליטת חניכיימיים הספציפיות של הומאוסטזיס חיסונית לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של בהיווצרות מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה בעקבות הנחיות נדרשות ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי, NIDCR / NIH.

1. להכין מראש

  1. הכן התקשורת השלם: RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו FBS 10%.
  2. כן תקשורת DNase: 50 מיליליטר של תקשורת RPMI השלים עם 7.5 מיקרוגרם DNase (הפוך טרי, לשמור על הקרח בכל עת).
  3. הכן התקשורת Collagenase-DNase: 5 מ"ל של התקשורת DNase בתוספת 3.2 מ"ג / מ"ל ​​של IV סוג Collagenase (הפוך טריים, לשמור על הקרח בכל עת).
  4. טרום מגניב חיץ FACS: 0.5% FBS מדולל PBS.
  5. צנטריפוגות טרום מגניב עד 4 מעלות צלזיוס.
  6. חממה שייקר חם 37 ° C.

בידוד 2., Dissection, ובידוד התא מפני חניכיים בלוקים

  1. להרדים עכברים על ידי חשיפה אותם ל- CO 2 בתא מתאים, על פי הנחיות AraC.
  2. <li> פתח את חלל בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואיברים פנימיים. כדי perfuse, עושים חתך את הווריד הנבוב נחות perfuse 3 מ"ל של PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G.
  3. לשתק את הגוף ואת הראש של עכבר על הכרית עם בטן כלפי מעלה.
  4. חותכים כל שליבה של השפה לכיוון הצוואר במספריים, הפרדת העור שמכסה באזור הלסת התחתונה והצוואר, חשיפת רקמות השרירים הבסיסית. לנתח את השפה התחתונה לחשוף את הלסת התחתונה.
  5. חותך בין החותכות התחתונות להפריד משני צידי הלסת התחתונה ואת לשתק כל צד לגשת חלל הפה.
  6. דמיינו לנתח את החיך משם מחלל האף.
  7. לנתח אזורים באמצעות 10 להב וכוללים אזורי טוחנת בלסת העליונה mandibular עם הסובבים החניכיים (איור 1). ודא חתכים אנכיים רק קדמי טוחן ואת האחורי הראשונים הטוחן השלישי חתך אופקיהגבול של החניכיים (הצווארון הלבן של השיניים לרקמות).
  8. מניחים את לסתי וחוסם mandibular צינור חרוטי 50 מ"ל עם 5 מ"ל Collagenase / DNase (לשמור על הקרח).
  9. דגירה באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ובמהלך הדגירה 5 דקות של האחרון להוסיף 50 μl של 0.5 מ 'EDTA.
  10. הוסף 5 מ"ל של התקשורת DNase קר אל הצינור 50 מ"ל עם רקמות בעדינות מערבולת לערבב.
  11. מעבירים את 4 בלוקים של רקמות על צלחת פטרי ולכסות עם 500 μl של התקשורת DNase. סר חניכיימיים מכל גוש הרקמות, באמצעות סכין אזמל ומכוון את הלהב לתוך אזורי החניכיים ו-שיניים.
  12. מעבירים את הרקמות ואת התקשורת מצלחת פטרי כמו גם בתקשורת DNase שהופעלה במהלך לנתיחה, לצינור חדש 50 מ"ל דרך מסננת התא (70 מיקרומטר גודל). לשטוף עם התקשורת DNase (3-5 מ"ל) כל המכשירים המשמשים ולסנן.
  13. באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר סטרילי, ומועך את הרקמה נגד המסננת,סינון עם התקשורת DNase קר (30 עד 35 מ"ל).
  14. שטוף את מסננת התא עם תקשורת DNase קרה.
  15. צנטריפוגה ב 4 ° C, 314 XG במשך 6 דקות.
  16. בטל supernatant, מחדש להשעות ב 1 מ"ל של מדיה מלאה.
  17. ספירת תאים (סכום הצפוי צריך לנוע בין 8 x 10 5 כדי 1.2 x 10 6 תאים עם כדאיות של> 80%) באמצעות דלפק תא אוטומטי.

3. גירוי ו FACS צביעת תאים חניכיים

  1. לעורר את ההשעיה תא בודד עם PMA (50 ng / ml) ו ionomycin (2.5 מיקרוגרם / מ"ל) בנוכחות של 1 μl / מ"ל ​​של Brefeldin א
  2. דגירה של 3.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. ספין למטה לשטוף עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס; 314 XG במשך 6 דקות.
  4. כתם תאים באמצעות כתם כדאי בעקבות ההוראות יצרן.
  5. כתם על סמנים תאיים (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ או נמלהibodies בחירה) בעקבות הוראות יצרן.
  6. שוטפים את התאים עם חיץ צנטריפוגות קר FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
  7. בעדינות מערבולת לשבש את התא גלולה.
  8. תקן את התאים עם paraformaldehyde 2% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. שוטפים את התאים עם חיץ FACS קר, צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות ו כתם ציטוקינים תאיים.
    1. ממלאים את צינורות FACS עם תמיסה של saponin 0.5% קר מדולל חיץ צנטריפוגות FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    2. הוספת 300 μl של פתרון saponin 0.5% אל צינורות FACS, דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    3. כתם תאים עבור סמנים תאיים (IL-17A ו IFNγ או ציטוקינים בחירה) בעקבות הוראות יצרן. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות saponin 0.5% ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    4. שטפו שוב עם FACSחיץ צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    5. מחדש להשעות את התאים 300 μl של חיץ FACS.
  10. נתחו את התוצאות על cytometer הזרימה.

4. ניתוח cytometry זרימה

  1. דמיינו תאים להיות מנותח על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SCC) ושער להוציא פסולת.
  2. בחר תאים בודדים עם שטח פיזור קדימה (FSC-A) לעומת פרמטרים גובים (FSC-H).
  3. שער תאים כי הם חיים (כפי שצוין על ידי מכתים כדאי) וחיוביים עבור + CD45 סמן hematopoietic לניתוח נוסף (איור 2 א ו 2 ג).
  4. המשך ניתוח של סמנים ספציפיים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש יישום של פרוטוקול, אנו מציגים תוצאות נציג לבחינת הרשת התא החיסונית החניכיים של עכברים עם ובלי חניכיים (WT לעומת LFA - / -, איור 2 א - ג). מגרשי FACS נציג להראות תאי CD45 + hematopoietic חי החניכיים (איור 2 א, 2 ג). בידוד ועיבוד של תאי מערכת החיסון עם פרוטוקול זה מניב מספיק תאים כדי לבצע vivo לשעבר גירוי ואפיון דפוסי הפרשת ציטוקינים. כאן אנו מראים IL-17 ו מכתים IFN-γ בתאים הכולל CD45 + במדינה יציבה (WT) ובעכברים מפגין חניכיים (עקב מחסור LFA) (איור 2 ב - D). נתונים אלו חושפים את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי ללכוד פרופילים ציטוקינים במהלך מצב יציב רקמות (WT) והן בהקשר של פריודונטיטיס המקומי (LFA - / -). מיקרופוןהדואר רגיש חניכיימיים נוסיף שאפיין את רכב תא חיסון החניכיים במיוחד של תאי T ותא הלימפה מולדת (ILC) תאים (איור 3 א - ב). הצלחנו להגדיר את הייצור של IL-17 ו- IFN-γ בתוך תא TCRβ + CD4 + T, תאי TCRβ + CD8 + T, תאי TCRγδ + T, NK ותאי ILC (איור 3 ג).

איור 1
איור 1:. בידוד של החניכיים murine איור הממחיש את הדיירים של דיסקציה של maxilla ומגזר חניכיים מבודד לשמש לנתיחה רקמת החניכיים. מגזרי (B) של maxilla בעכברים (באזור הטוחן) עם מתווה לנתיחה לחסום ולחסום מבודדים. Hematoxylin ו כתם Eosin (H & E) של קטע טוחנת לסתי עם החניכיים רקמות l התוו מוצג הנמוך (C) גדלה גבוהה '). בהגדלה מקורית מצוינת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: נציג נתונים FACS עבור ייצור ציטוקינים מתאי חניכיים. (A - C) FACS עלילה מראה שער תאי CD45 + חיו בהכנות תא עכבר חניכיימיים הבאות vivo לשעבר מחדש גירוי עם PMA ו ionomycin ב WT ו LFA - / -. (B - D) מגרשים נציג FACS מראה IFN-γ ו- IL-17 מכתים עכבר הכולל CD45 + תאים החניכיים של עכברים עם / בלי חניכיים (בשל LFA-חסר).Iles / ftp_upload / 53,736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. ייצור ציטוקינים על ידי אוכלוסיות חיסוניות חניכיימיים מודלקות (א) עלילת הנציג FACS מציג מכתים עבור TCRβ לעומת TCRγδ מגודר על תאי CD45 +. Gating על TCRβ + תאים, העלילה באמצע תערוכות CD4 לעומת מכתים TCRβ (מאפשר ניתוח של תאים TCRβ + CD4 + T, תאים TCRβ + CD8 + T ו TCRγδ + T תאים). Gating על TCRβ - TCRγδ - תאים, העלילה ימין מראה CD45 לעומת מכתים NK1.1 (מאפשר ניתוח של תאי NK). (ב) עלילת הנציג FACS מציג מכתים עבור CD90.2 מגודרת על תאים שליליים CD45 + שושלת (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) אשר מזהה תאים הלימפה מולד. (ג) מגרשים נציג FACS מראה IFN-γ ו- IL-17 מכתים אוכלוסיות תאים המזוהים. ההכנות החניכיים הם בין 20 בן שבוע LFA - / - עכברים המתפתחים חניכיים; נתונים מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה הנוכחית בהצלחה מניבה מספר רב של תאי מערכת חיסון (מתוך עכבר אחת) מתאים, לא רק לאפיון פנוטיפי, אלא גם עבור מחקרים פונקציונליים vivo לשעבר. קבוצה נוספת פרסמה בעבר פרוטוקול לבודד ולאפיין תאים בעכברי חניכיימיים חיסוניים והציגה את שווי השימוש ססגוני cytometry זרימה בחקר חניכיימיים במודלים של בעלי חי 9. בעקבות תקלות ניכר שינוי המפתח בפרוטוקול זה היה לכלול דיסקציה של בלוקים שלמים של רקמות על מנת לכלול בשני התחומים צווארון חניכיים ו החניכיים interdental (איור 1). עם דיסקציה חניכיים לבד, לעתים קרובות דשי בעובי מלא אינן מושגות וחלק החניכיים הוא החמיץ במיוחד בתחומים interdental. בגישה זו, מספר רב של תאי חיסון שנקטף עולים במידה הניכרת. טכניקה זו מאפשרת גם לבידוד מיטבי של רקמות החניכיים הן מתוך maxillaלסת תחתונה ד.

צעדים קריטיים עבור פרוטוקול זה כוללים דיסקציה שמרנית תחומים חניכיים ושיעור יעיל של לנתיחה. באופן ספציפי, בלוקים של רקמה צריך להיות גזורים לכלול רקמות מינימאליות רק סביב שיניים (חניכיימיים) ורקמות buccal לא. בלוקים צריכים להיות גזורים במהירות רקמות ותאים צריכות להישאר על קרח כדי להבטיח כדאיויות תא אופטימליות.

לצורך פתרון בעיות חשוב לציין כי התשואה הנמוכה של תאים יכול להיות קשור זמן לקוי של הדגירה עם collagenase, ריכוזי הולם של collagenase ו / או דיסקציה לקוי של החניכיים מהבלוקים רקמות. ובנימה זו, דיסקציה של כירורגיים מגדלת באמצעות חניכיימיים (2X-6X) יכולה להיות מועילה. כדאיות נמוכה של תא יכולה להיות קשור איחור בהליך וכדי תקשורת, מאגרים ותאיים לא הנותרים ברציפות על קרח.

מגבלות של פרוטוקול זה, הטמון לסוג דיס רקמותsected הוא בגודל של רקמות חניכיימיים, בהשוואה לאתרים מחסום אנטומיים אחרים שנבדקה (לשעבר. עור או מערכת עיכול) שבו רקמות גדולות זמינות.

עם זאת, טכניקה מוצגת כאן אפשר לנו לאפיין את אוכלוסיות תאים הדומיננטיים LFA - / - מודל אשר ספונטני שפותח חניכיימיים. ב LFA - / - עכברים זיהו חתימה ציטוקינים דומיננטית IL-17 במהלך פיתוח של פריודונטיטיס 10. באמצעות ניתוח תזרים cytometric הססגוני הצלחנו להגדיר את המקורות הסלולר של IL-17 11. במחלה זו הגדרת IL-17 הופק על ידי תאי T TCRγδ, תאי CD4 + T ותאי הלימפה מולד (ILC) מקומי בתוך החניכיים 10.

עם מספר לא מבוטל של תאים מבודדים עם מתודולוגיה זו ואת היכולת לזהות אפילו תת-אוכלוסיות קטנות, זה עכשיו יהיה אפשרי לפתח מקיפה להביןing של רשת תא חיסון המיוחדת לשמירה שלמות מחסום חניכיימיים. ההבחנה חשובה הזאת תאפשר לנו להעריך תגובה חיסונית בסביבת החניכיים. על ידי העסקה בשיטה זו אנו מסוגלים כעת להמשיך לבודד מרכיבים ספציפיים של רשת תא החניכיים חיסוניות על ידי מיון תא התזרים cytometric, המאפשר ניתוחים נוספים ומאפיינים להתבצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Scissors Fine science tools 14058-11
Scalpel Handle #3 Fine science tools 10003-12
Scalpel Blades #10 Fine science tools 10010-00 Sterile
Splinter Forceps Integra Miltex 6-304
Needles with regular bevel  BD Medical 305109 27 G, 12.7 mm length
Monoject syringes Covidien 8881513934 Luer-lock tip, 3 ml
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-049 Without Calcium and Magnesium
RPMI 1640 Lonza 12-167F Without L-glutamine
DNase I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25-1G
Collagenase type IV Gibco (by Life technologies) 17104-019
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-products 100-106
Gentamicin 50 mg/ml Quality biological 120-098-661EA
Pen Strep Gibco (by Life technologies) 15140-122
L-Glutamine Gibco (by Life technologies) 25030-081
0.5 M EDTA pH 8.0 Quality biological 351-027-721EA
50 ml tubes Corning 352070 Polypropylene, sterile
70 μM Cell Strainers Corning 352350
Petri dishes Corning 351029 Sterile
5 ml FACS tubes Corning 352052 Sterile
BD GolgiPlug BD Biosciences 555029 Contains brefeldin A solution
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience 48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 eBioscience 47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC eBioscience 11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC eBioscience 12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 eBioscience 25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience 47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC eBioscience 11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC eBioscience 11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC eBioscience 11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC eBioscience 11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC eBioscience 11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC BD Pharmingen 553104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics