Isolation, karakterisering og funktionelle Undersøgelse af Gingival Immune Cell Network

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi har etableret en teknik til isolering, fænotypiske karakterisering og funktionel analyse af immunceller fra murine gingiva.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dutzan, N., Abusleme, L., Konkel, J. E., Moutsopoulos, N. M. Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network. J. Vis. Exp. (108), e53736, doi:10.3791/53736 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Gingivale væv omgiver human og murin tandsæt og er konstant udsat for den komplekse biofilm af tanden 1. Immuncellen netværk politiarbejde gingival barriere er afgørende for at bevare vævsintegritet, sikrer homøostase med de lokale kommensale mikrober og, på samme tid, hvilket giver en effektiv immunitet mod patogen udfordring 2. For at opnå homeostase, er immunsystemet omhyggeligt skræddersyet til den gingival miljø skaber en højt specialiseret immun celle netværk, men lille detalje er kendt af de gingivale immun cellepopulationer og deres rolle i at opretholde væv immunitet 2.

Når immun homøostase er forstyrret på gingiva, enten gennem øget vært modtagelighed og / eller tilstedeværelse af dysbiotic mikrobielle samfund, en inflammatorisk tilstand, opstår parodontitis 3 4. Parodontitis er en almindelig inflammatorisk sygdom, der fører til tab af tand sTØTTE strukturer. I sine alvorlige former er det set hos ca. 10% af den almindelige befolkning 5. Dissekere de centrale faktorer involveret i parodontitis modtagelighed og progression har vist sig vanskeligt 6. Imidlertid har dyremodeller været yderst nyttige i at forstå mekanismerne i parodontitis initiering og progression 7. Modeller kan anvendes til at definere de centrale cellepopulationer og molekylære mediatorer, der er afgørende for at opretholde immunforsvaret homeostase og drive udviklingen af ​​parodontitis. En sådan indsigt vil forvandle vores forståelse af gingiva-specifik styring af immun homøostase og fremme vores nuværende forståelse af sygdommens patogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer beskrevet i denne protokol fulgt nødvendige retningslinjer og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, NIDCR / NIH.

1. Forbered i Advance

  1. Forbered komplette medier: RPMI suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% FBS.
  2. Forbered DNase medier: 50 ml RPMI medium suppleret med 7,5 ug DNase (Lav frisk, holde på is på alle tidspunkter).
  3. Forbered Collagenase-DNase medier: 5 ml DNase medier plus 3,2 mg / ml collagenase type IV (Lav frisk, holde på is på alle tidspunkter).
  4. Pre-cool FACS buffer: 0,5% FBS fortyndet i PBS.
  5. Pre-cool centrifuge til 4 ° C.
  6. Varm rysteinkubator til 37 ° C.

2. Isolering, Dissection, og Cell Isolation fra Gingival Blocks

  1. Aflive mus ved at udsætte dem til CO2 i et passende kammer, ifølge ARAC retningslinjer.
  2. <li> Åbn thorax og bughulen at afsløre hjerte og indre organer. At perfundere, lave et snit i vena cava inferior og perfundere 3 ml PBS via den venstre ventrikel ved anvendelse af en 3 ml sprøjte med en 27 G nål.
  3. Immobilisere krop og hoved af musen på en pude med mave opad.
  4. Skær hver commissure af læben mod halsen med en saks, adskillelse huden, der dækker underkæbe og halsregionen, udsætter de underliggende væv og muskler. Dissekere underlæben at afdække underkæben.
  5. Skåret mellem de nedre fortænder at adskille begge sider af underkæben og immobilisere hver side for at få adgang til mundhulen.
  6. Visualisere og dissekere ganen væk fra næsehulen.
  7. Dissekere områder under anvendelse af en 10 blad og omfatter maxillary og mandibulære molære områder med omgivende gingiva (Figur 1). Lave lodrette indsnit lige foran den første molære og posteriort for den tredje molar og en vandret indsnit vedgrænsen af ​​gingiva (hvid krave af væv omkring tænder).
  8. Placer maxillary og mandibulære blokke i en 50 ml konisk rør med 5 ml Collagenase / DNase (holde på is).
  9. Inkuber i en rysteinkubator ved 37 ° C i 1 time og under den sidste 5 minutters inkubation tilsættes 50 pi 0,5 M EDTA.
  10. Der tilsættes 5 ml kold DNase medier til 50 ml rør med væv og forsigtigt hvirvel for at blande.
  11. Overfør 4 blokke af væv på en petriskål og dækkes med 500 pi DNase medier. Fjern gingiva fra hver blok af væv, ved hjælp af en skalpel og peger bladet ind i gingival og interdentale områder.
  12. Overfør væv og medierne fra petriskålen samt de tidligere DNase medier, der anvendes under dissektion, til et nyt 50 ml rør gennem cellen si (70 um størrelse). Vask med DNase medier (3-5 ml) alle de anvendte instrumenter og filter.
  13. Brug af stemplet i en steril 3 ml sprøjte, mash vævet mod si,filtrering med kold DNase medier (30 til 35 ml).
  14. Vask cellesigte med koldt DNase medier.
  15. Der centrifugeres ved 4 ° C, 314 xg i 6 min.
  16. Supernatanten fjernes, re-suspendere i 1 ml komplet medium.
  17. Tæl celler (det forventede beløb bør ligge mellem 8 x 10 5-1,2 x 10 6 celler med en levedygtighed på> 80%) ved hjælp af en automatiseret celletæller.

3. Stimulering og FACS Farvning af Gingival Cells

  1. Stimulere enkelt cellesuspension med PMA (50 ng / ml) og ionomycin (2,5 ug / ml) i nærvær af 1 ul / ml Brefeldin A.
  2. Inkuber i 3,5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Spin ned og vaskes med PBS og centrifuger ved 4 ° C; 314 xg i 6 min.
  4. Farv cellerne under anvendelse en levedygtighed plet efter producentens anvisninger.
  5. Stain for ekstracellulære markører (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ eller antibodies af valg) ifølge producentens instruktioner.
  6. Vask cellerne med kold FACS-buffer og centrifugeres ved 4 ° C, 314 x g i 5 min.
  7. Forsigtigt vortexes at forstyrre cellepelleten.
  8. Fikseres cellerne med 2% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur.
  9. Vask cellerne med kold FACS-buffer, centrifuge ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter og farves for intracellulære cytokiner.
    1. Fyld FACS rør med en opløsning af kold 0,5% saponin fortyndet i FACS-buffer og centrifugeres ved 4 ° C, 314 x g i 5 min.
    2. Der tilsættes 300 pi 0,5% saponin løsning på FACS-rør, inkuberes i 15 minutter i mørke ved 4 ° C og centrifugeres ved 4 ° C, 314 x g i 5 min.
    3. Farv cellerne i intracellulære markører (IL-17A og IFNy eller cytokiner af valg) efter producentens anvisninger. Vask cellerne med 0,5% saponin opløsning og centrifugeres ved 4 ° C, 314 x g i 5 min.
    4. Vask igen med FACSpuffer og centrifugeres ved 4 ° C, 314 x g i 5 min.
    5. Re-suspendere cellerne i 300 pi FACS-buffer.
  10. Analyser resultaterne på et flowcytometer.

4. flowcytometrianalyse

  1. Visualisere celler, der skal analyseres på forward (FSC) og sidespredning (SCC) og gate at udelukke snavs.
  2. Vælg enkelte celler med forward scatter område (FSC-A) vs. højde (FSC-H) parametre.
  3. Gate-celler, som er live (som angivet ved levedygtighed farvning) og positive for den hæmatopoietiske markør CD45 + til yderligere analyse (figur 2A og 2C).
  4. Fortsæt analyse af specifikke markører, som vist i figur 2 og figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere anvendelse af protokollen, viser vi repræsentative resultater undersøge immun celle netværk i gingiva af mus med og uden parodontitis (WT vs LFA - / -, figur 2A - C). Repræsentative FACS plots viser levende CD45 + hæmatopoietiske celler i gingiva (figur 2A, 2C). Isolering og forarbejdning af immunceller med denne protokol giver tilstrækkelige celler til at udføre ex vivo-stimulering og karakterisering af cytokinsekretion mønstre. Her viser vi IL-17 og IFN-γ-farvning i alt CD45 + celler i stationær tilstand (WT) og i mus udviser parodontitis (grundet LFA mangel) (Figur 2B - D). Disse data viser potentialet af denne teknik til at fange cytokinprofiler under væv steady state (WT) og i forbindelse med lokal parodontitis (LFA - / -). I mice modtagelige for parodontitis vi yderligere kendetegnet gingival Immuncellesammensætning især af T-cellen og Innate lymfecelle (ILC) kamre (figur 3A - B). Vi var i stand til at definere produktionen af IL-17 og IFN-γ i TCRβ + CD4 + T-celle, TCRβ + CD8 + T-celle, TCRγδ + T-celle, NK og ILC kamre (figur 3C).

Figur 1
Figur 1:. Isolering af murine gingiva Illustration demonstrerer grænserne til dissektion i maxilla og det isolerede gingival segmentet, der skal anvendes til tandkødsvæv dissektion. (B) Segment af murine overkæben (molær område) med skitse for blok dissektion og isolerede blok. Hematoxylin og eosin farvning (H & E) af en maxillary molær segment med gingiva l væv skitseret er vist i lav (C) og større forstørrelse i (D). Originale forstørrelser angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Repræsentative FACS data for cytokinproduktion fra gingivale celler. (A - C) FACS plot, der viser gate for levende CD45 + celler i muse gingivale cellepræparater følgende ex vivo restimulering med PMA og ionomycin i WT og LFA - / -. (B - D) Repræsentative FACS plots viser IFN-γ og IL-17-farvning i alt CD45 + celler mus fra gingiva af mus med / uden parodontitis (grundet LFA-mangel).Iles / ftp_upload / 53.736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Cytokinproduktion af immun befolkninger i betændt gingiva (A) Repræsentant FACS plot viser farvning for TCRβ versus TCRγδ gated på CD45 + celler. Gating på TCRβ + celler, midterste plot viser CD4 versus TCRβ farvning (muliggør analyse af TCRβ + CD4 + T-celler, TCRβ + CD8 + T-celler og TCRγδ + T-celler). Gating på TCRβ - TCRγδ - celler, højre plot viser CD45 versus NK1.1 farvning (giver mulighed for analyse af NK-celler). (B) repræsentant FACS plot, der viser farvning for CD90.2 gatet på CD45 + afstamningsceller negative celler (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) som identificerer medfødte lymfoide celler. (C) Repræsentative FACS plots viser IFN-γ og IL-17-farvning i cellepopulationer identificeret. Gingiva præparater er fra 20 uger gamle LFA - / - mus, der udvikler parodontitis; data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende teknik med held giver et stort antal af immunceller (fra en enkelt mus) passer, ikke kun for fænotypisk karakterisering, men også for funktionelle studier ex vivo. En anden gruppe havde tidligere offentliggjort en protokol at isolere og karakterisere murine gingival immunceller og indført værdien af at anvende flerfarvet flowcytometri i studiet af parodontitis i dyremodeller 9. Efter betydelig fejlfinding nøglen modifikation i denne protokol var at omfatte dissektion af hele blokke af væv med henblik på at omfatte både gingival krave områder og interdentale gingiva (Figur 1). Med gingival dissektion alene, ofte med fuld tykkelse flapper er ikke opnået, og en del af gingiva springes især i de interdentale områder. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, er antallet af immunceller høstet væsentligt forøget. Denne teknik giver også mulighed for optimal isolering af gingivale væv fra både overkæben end underkæbe.

Kritiske trin til denne protokol omfatter en konservativ dissektion af gingivale områder og en effektiv sats på dissektion. Specifikt bør blokke af væv dissekeres til at omfatte kun minimal væv omkring tænderne (gingiva) og ikke bukkale væv. Blokke skal dissekeres hurtigt og væv og celler bør forblive på is for at sikre optimal celle levedygtighed.

Til formål med fejlfinding er det vigtigt at bemærke, at lavt udbytte af celler kan være relateret til utilstrækkelig inkubationstid med collagenase, uhensigtsmæssige koncentrationer af collagenase og / eller utilstrækkelig dissektion af gingiva fra vævet blokke. På dette notat, kan dissektion af gingiva hjælp forstørrelsesglas lupper (2X-6X) være nyttig. Lav levedygtighed celler kan relateres til langsommelighed i proceduren og medier, buffere og celler ikke resterende konstant på is.

Begrænsninger af denne protokol, er forbundet med den type væv dissected er størrelsen af ​​de gingivale væv, sammenlignet med andre anatomiske barriere sites undersøgt (ex. Hud eller mavetarmkanalen), hvor større væv er tilgængelige.

Ikke desto mindre har den teknik præsenteres her tilladt os at karakterisere de dominerende cellepopulationer i LFA - / - model, som spontant udviklede parodontitis. I LFA - / - mus vi identificeret en dominerende IL-17 cytokin signatur under udviklingen af paradentose 10. Brug flerfarvet flowcytometrisk analyse var vi i stand til at definere de cellulære kilder til IL-17 11. Ved denne sygdom indstilling IL-17 blev produceret af TCRγδ T-celler, CD4 + T-celler og medfødte lymfoide celler (ILC) lokalt inden for gingiva 10.

Med det store antal af celler isoleret med denne metode og evnen til at identificere selv små subpopulationer, vil det nu være muligt at udvikle en omfattende forstårning af de specialiserede immun celle netværk sikring gingival barriere integritet. Denne kritiske indsigt vil give os mulighed for at evaluere immunreaktioner i gingival miljø. Ved at anvende denne teknik kan vi nu gå videre til at isolere bestemte bestanddele af gingiva immun celle netværk ved flowcytometrisk celle sortering, så yderligere analyser og karakteriseringer, der skal iværksættes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Scissors Fine science tools 14058-11
Scalpel Handle #3 Fine science tools 10003-12
Scalpel Blades #10 Fine science tools 10010-00 Sterile
Splinter Forceps Integra Miltex 6-304
Needles with regular bevel  BD Medical 305109 27 G, 12.7 mm length
Monoject syringes Covidien 8881513934 Luer-lock tip, 3 ml
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-049 Without Calcium and Magnesium
RPMI 1640 Lonza 12-167F Without L-glutamine
DNase I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25-1G
Collagenase type IV Gibco (by Life technologies) 17104-019
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-products 100-106
Gentamicin 50 mg/ml Quality biological 120-098-661EA
Pen Strep Gibco (by Life technologies) 15140-122
L-Glutamine Gibco (by Life technologies) 25030-081
0.5 M EDTA pH 8.0 Quality biological 351-027-721EA
50 ml tubes Corning 352070 Polypropylene, sterile
70 μM Cell Strainers Corning 352350
Petri dishes Corning 351029 Sterile
5 ml FACS tubes Corning 352052 Sterile
BD GolgiPlug BD Biosciences 555029 Contains brefeldin A solution
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience 48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 eBioscience 47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC eBioscience 11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC eBioscience 12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 eBioscience 25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience 47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC eBioscience 11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC eBioscience 11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC eBioscience 11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC eBioscience 11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC eBioscience 11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC BD Pharmingen 553104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics