Le séquençage de l'usine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques

Chemistry

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Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

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Abstract

Ce protocole décrit les techniques particulières utilisées pour la caractérisation de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) du hétéroxylanes. Les parois cellulaires endosperme de blé de-amidonnés ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) 1 et séquentiellement l' extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et de KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) tel que décrit par Ratnayake et al. , (2014) 2. Deux approches différentes (voir le résumé dans la figure 1) sont adoptées. Dans la première, W AX-sol intactes sont traitées avec 2AB pour marquer le résidu initial de sucre dans la chaîne du squelette RE et ensuite traités avec une endoxylanase pour produire un mélange de 2AB marqué RE et la région interne oligosaccharides réducteurs, respectivement. Dans une deuxième approche, le Fr KOH-sol est hydrolyse avec endoxylanase d'abord générer un mélange d'oligosaccharides qui sont ensuite marquées avec 2AB. Les ((dé) marqués) oligosaccharides libérés par voie enzymatique à la foisW- et Frs KOH-sol sont ensuite méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, une RP-HPLC-ESI-QTOF-MS et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX sont également caractérisés par résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit également des informations sur la configuration anomérique. Ces techniques peuvent être appliquées à d'autres classes de polysaccharides à l'aide des endo-hydrolases appropriées.

Introduction

Hétéroxylanes sont une famille de polysaccharides qui sont des polysaccharides non cellulosiques prédominantes des parois primaires des graminées et les parois secondaires de tous les angiospermes 3-6. Les backbones xylane diffèrent dans leurs types et les modèles de substitution avec glycosyl (acide glucuronique (GlcA), arabinose (Araf)) et non-glycosyl (O-acétyle, l' acide férulique) des résidus en fonction de type de tissu, le stade de développement et les espèces 7.

Les murs du blé (Triticum aestivum L.) endosperme se composent principalement de arabinoxylanes (AXS) (70%) et (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanes (20%) avec des quantités mineures de cellulose et heteromannans (2% chacun) 8. Le squelette de xylane peut être diversement non substitué et essentiellement mono-substitué (principalement O-2 positions et, dans une moindre mesure, O-3 positions) et disubstitués (O 2 et O 3 positions) avec des α-L-Ara résidus f 9. L'extrémité réductrice (RE) des hétéroxylanes de dicotylédones (par exemple, Arabidopsis thaliana) 10 et gymnospermes (par exemple, Epicéa (Picea abies)) 11 contient une séquence tétrasaccharide glycosyle caractéristique; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A (1 → 4) -D-Xyl p. Pour comprendre la biosynthèse et de la fonction (biologique et industriel) hétéroxylane, il est important pour séquencer complètement le squelette de xylane pour comprendre les types et les modèles de substitution, ainsi que la séquence de l'extrémité réductrice (RE).

Des techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) de hétéroxylanes sont décrits dans ce manuscrit. Les techniques reposent sur fluorophore de marquage (avec 2 aminobenzamide (2AB)) de l'extrémité réductrice (RE) de la chaîne hétéroxylane avant l'enzymatique (endoxylanase) hydrolyse. Cette approche, en particulier pour le séquençage de RE, étaitd' abord rapporté par le laboratoire York 10,12-13 , mais est maintenant étendu pour inclure la région de séquençage interne et est une combinaison de techniques établies qui est également adaptable à tous les hétéroxylanes indépendamment de leur source d'isolement. Cette approche peut également être appliquée à d'autres classes de polysaccharides en utilisant (le cas échéant) les endo-hydrolases appropriées.

Dans la présente étude, endosperme de blé parois de-amidonné cellulaires ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) et séquentiellement extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) comme décrit dans Ratnayake et al. (2014) 2. Les oligosaccharides libérés à la fois W- et Frs KOH-sol sont alors méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-couplé à HPLC avec le une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX a également été caractérisée par résonance magnétique nucléaire (RMN).

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Protocol

1. L'étiquetage de la fin Réduire (RE) de sucre résidus de W-sol avec 2 AX-aminobenzamide (2AB)

  1. Incuber W-sol AX avec 2AB (0,2 M) en présence de 1 M de NaBH3CN (de cyanoborohydrure de sodium) (pH 5,5) pendant 2 heures à 65 ° C pour convertir les terminaisons réductrices des chaînes de polysaccharide du squelette de leurs dérivés fluorescents.
    ATTENTION: L'étape suivante doit être effectuée dans la hotte comme NaBH 3 CN libère le gaz de cyanure toxique quand il est en contact avec l' eau.
    1. Peser NaBH3CN (62,8 mg) et dissoudre dans de l' eau (1 ml) dans un tube de microcentrifugation (1,5 ml) pour préparer une solution 1 M de NaBH3CN. Dissoudre le réactif 2AB (27,2 mg) dans 1 M de solution de NaBH3CN (1 ml) par chauffage à 65   ° C et on ajuste le pH du mélange réactionnel (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) à un pH de 5,5 avec de l' acide acétique à 10%.
    2. Ajouter 200 ul de mélange réactionnel (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) à W-sol AX (1 mg) dans un tube de verre avec un bouchon et mélanger à l'aide d'un mélangeur à vortex. Incuber pendant 2 heures à 65   ° C dans une hotte. Refroidir la suspension à température ambiante et ajouter 4 vol. d'éthanol absolu.
    3. Placer la suspension dans un stockage à froid (4 ° C) O / N pour précipiter les polysaccharides.
    4. Centrifugeuse (1500 x g, 10 min, température ambiante) pour éliminer le surnageant. Laver le culot abondamment avec de l'éthanol absolu (4x), l'acétone (1x) et de méthanol (1x), centrifuger entre chaque lavage. Aspirateur sec à 40 ° CO / N.
      Remarque: lavage étendue supprime également 2AB résiduel.

2. Génération de Xylo-oligosaccharides de 2 AB labelisée W-sol AX

  1. Dissolve 2AB étiquetée W-sol AX (1 mg) dans 500 ul de tampon d'acétate de sodium (100 mM, pH 5) dans un microtube (1,5 ml). Ajouter 4 unités de endoxylanase (GH 11, [M1]) et incuber à 37   ° C pendant 16 heures.
  2. Détruisez l'activité enzymatique en chauffant les mixt de réactionure pendant 10 minutes dans un bain d'eau bouillante. Refroidir la suspension à la température ambiante et transfert à tube de verre avec un bouchon. Ajouter 4 vol. d'éthanol absolu et placer la suspension dans un stockage froid (4 ° C) O / N pour précipiter des polysaccharides non digérés.
  3. Centrifugeuse (1500 x g, 10 min, RT) pour séparer les polysaccharides non digérés (à granulés) et endoxylanase généré xylo-oligosaccharides (surnageant). Décanter le surnageant dans un tube de verre propre et le placer dans un bain d'eau chaude (40 ° C).
  4. S'évaporer l'éthanol sous un courant d'azote gazeux à un volume de point final (~ 500 ul). Congeler le surnageant à -80 ° C pendant 4 heures et sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides.

3. Génération de Xylo-oligosaccharides de KOH-sol AX et d'étiquetage de 2AB

  1. Traiter KOH-sol avec endoxylanase AX (GH 11, [M1]) pour générer xylo-oligosaccharides comme décrit ci-dessus (sections 2.1-2.4).
  2. Traiter endoxeylanase généré xylo-oligosaccharides à partir de KOH-sol avec AX mélange réactionnel 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) tel que décrit ci - dessus (sections 1.1.1-1.1.2).
  3. Décanter le surnageant dans un tube de verre propre et le placer dans un bain d'eau chaude (40 ° C). S'évaporer l'éthanol sous un courant d'azote gazeux à un volume de point final (~ 500 ul). Congeler le surnageant à -80 ° C pendant 4 heures et sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides.

4. MALDI-TOF-MS:

  1. Préparation de la solution-matrice MALDI
    1. Ajouter une petite boule de 2, l'acide 5-dihydroxbenzoic (DHB) à 50% d'acétonitrile (500 ml) contenant de l'acide formique à 0,1% dans un tube (solution MALDI-matrice). Mélanger à l'aide d'un vortex, si elle se dissout rapidement, ajouter une autre petite boule de DHB. Note: la concentration idéale de solution MALDI-matrice est de 10 ug / ul -1.
  2. Préparation de la plaque cible MALDI-
    1. Déposer le aqueonous oligosaccharides échantillons (natif) (5-10 ug) (W-sol et / ou KOH-sol) sur une plaque MALDI-cible. Ajouter la solution MALDI-matrice 0,3 ul en utilisant une pointe séparée et mélanger par pipetage de haut en bas. Laisser le mélange sécher à température ambiante.
      Remarque: les échantillons correctement séchées devraient consister en des cristaux en forme d'aiguilles longues pointant vers le centre de la tache. Si le dépôt est collante et / ou smeary l'échantillon peut être soit trop concentré ou sont constitués de sels, de tels dépôts ne sont pas susceptibles de produire de bons spectres et l'échantillon doivent être purifiés davantage.
    2. Introduire la plaque cible dans la source MS et fonctionner en (+ ive) le mode d'ions positifs. Régler la tension d'accélération à 19,0 kV à la source d'ions 1 et 16,3 kV à la source d'ions 2. Ajuster la puissance du laser à une valeur supérieure à 70%. Sélectionnez l'endroit de l'échantillon sur la plaque MALDI-cible et cliquez sur Démarrer pour commencer tirs laser.
      Note: Tous les domaines de la cible ne donneront pas les signaux. Un endroit particulier ne donnera un signal pour quelques coups de laser dues soit àl'appauvrissement du mélange ou de caractéristiques du cristal échantillon / matrice.
      1. Déplacer le laser à différentes zones de la cible lors de l'acquisition et de la moyenne d'environ 200 spectres aléatoires pour obtenir le signal à bruit satisfaisant.

5. ESI-QTOF-MS

  1. Analyser les oligosaccharides endoxylanase généré (natif) à l'aide de nano-HPLC couplée à une ionisation par électronébulisation (ESI) Temps quadripolaire de vol (QTOF) SM instrument avec une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18 (75 pm x 150 mm, 3,5 um perle Taille).
    1. Transférer le oligosaccharides aqueux mélange endoxylanase généré dans un flacon et le placer dans l'échantillonneur automatique HPLC. Programmer le gradient d'élution de 5-80% avec les phases mobiles 0,1% (v / v) d'acide formique dans de l'eau et 0,1% (v / v) d'acide formique dans de l'acétonitrile, respectivement, sur 60 min.
    2. Réglez le taux à 0,2 ul / min. Réglez le mode ions positifs dans la plage de balayagede 300-1,600 m / z et une vitesse de balayage de 0,5 scans / seconde en utilisant les conditions de source ESI comme suit: gaz de rideau 10, GS1 4, température de la source 100 ° C, l' ion tension de pulvérisation 2.300 V, et de-regroupement potentiel 50 V. Exécutez le programme LC chromatographique et oligosaccharides éluées. Le chromatogramme ionique total résultant (TIC) est enregistré automatiquement par le logiciel.
    3. Ouvrez le TIC enregistré et sélectionnez extrait chromatogramme. Tapez les masses attendues (par exemple, 271, 403, 535, 667, 799 et 931 m / z) à la ligne de commande. chromatogramme scan en cliquant sur Entrée. Traiter les analyses d'ions sélectionnées des données chromatographiques ESI-QTOF MS en utilisant un logiciel selon les instructions du fabricant 14.

6. ESI-MS n

  1. Insérer 1 à 2 pi de oligosaccharide per-O-méthylé (méthylé comme décrit par Pettolino et al. 1) échantillon dans 50% d' acétonitrile dans une pointe de nanospray à l' aide d' une seringue. Réduirela pointe nano-spray à l'aide d'un coupe-verre pour tenir dans le porte-nano-spray discret attaché à la MS.
  2. Réglez la masse en fonction de la plage attendue de masse (200-1,500 m / z) et du gaz de rideau à 10, la tension ionspray à 1,900 V et polarité positive.
  3. Appuyez sur le bouton pour ouvrir la fenêtre acquérir pertinente, entrez le nom du fichier de données pour obtenir un balayage ionique total (ESI-MS 1). Ensuite, appuyez sur la touche STOP.
  4. Modifier le type de balayage d'ions produit à fragmenter un pic d'intérêt. Indiquer la masse d'intérêt (par exemple, 885 m / z) à fragmenter et d' ajuster la gamme de masse (200-900 m / z). Appuyez sur le bouton d' acquérir et d' ajuster l'énergie de collision (et / ou vers le bas dans l'onglet composé) pour obtenir la fragmentation complète de l' ion parent (885 m / z) et d' acquérir un balayage fragment d'ions (ESI-MS 2).
  5. Indiquer la masse du fragment ionique d'intérêt (par exemple, 711 m / z) et régler la plage de masse (200-720 m / z). Appuyez sur le bouton acquérir uned ajuster l'énergie de collision pour obtenir la fragmentation complète de précurseur ion (711 m / z) et d' acquérir un balayage fragment d'ions (ESI-MS 3).

7. H 1 Spectroscopie RMN

  1. Dissoudre mélange endoxylanase généré des oligosaccharides (forme KOH-sol, native) (~ 500 ug) dans D 2 O (1,0 ml, 99,9%) dans un tube à essai en plastique (15 ml). Congeler la suspension à -80 ° C pendant 4 heures et sécher la suspension congelée dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides.
  2. Répéter deux fois 7,1 pour échanger complètement le H 2 S avec D2O
  3. Dissoudre oligosaccharides séchés dans D 2 O (0,6 ml, 99,9%) et d' ajouter 0,5 ul d'acétone (5% en D 2 O) comme standard interne. Transférer les oligosaccharides deutérés dans le tube à échantillon RMN.
  4. Tenir la RMN tube contenant l'échantillon par le haut et insérer le tube d'échantillon dans un spinner plastique. Placez le spinner dans la jauge de profondeur de l'échantillon. Push ou retirer le tube d'échantillonnage pour régler la profondeur de l'échantillon pour faire en sorte que la ligne médiane de l'échantillon en haut et en bas des jauges de profondeur sont égales.
  5. Retirer la jauge de profondeur et insérer l'échantillon dans l'échantillonneur automatique relié à un spectromètre de RMN à 600 MHz équipé d'un cryo-sonde.
  6. Login et logiciels libres de contrôle du spectromètre. Entrez le nom du fichier de l'échantillon. Ouvrez un ensemble de données existant, puis utiliser la commande "edc" pour l'enregistrer sous un nouveau nom. Tapez le numéro de position de l'échantillon dans l'échantillonneur automatique et appuyez sur "ENTRER".
    Remarque: En appuyant sur le bouton "ENTRER" va baisser le tube d'échantillon doucement à l'intérieur de l'aimant où il sera placé dans la partie supérieure de la sonde.
  7. Réglez la température de l'échantillon souhaité en tapant "edte" à la ligne de commande. Attendre que la température de l'échantillon atteigne la valeur désirée avant de procéder à l'étape suivante. Entrez "verrouiller" à la ligne de commande et sélectionnez solvant approprié (D 2 O). Attendez que le & #34; verrouiller un message fini "apparaît au bas de la fenêtre.
  8. Tapez "ATMM" à la ligne de commande et cliquez sur "optimiser" en haut de la barre de menu ATMM. Choisissez commencer pour le réglage et l' appariement de la sonde pour le canal sélectionné (1 H dans ce cas).
  9. Tapez "topshim" à la ligne de commande pour le processus de calage dans lequel des ajustements mineurs sont apportés au champ magnétique jusqu'à ce que le champ magnétique uniforme est réalisé autour du sample.Acquire le signal en tapant "zg" à la ligne de commande et entrez.
  10. Analyser les spectres en utilisant le logiciel 15 selon les instructions du fabricant avec 1 H déplacement chimique référencée à un niveau interne de l' acétone à 2.225 ppm.

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Representative Results

La digestion endoxylanase de 2AB marqué W-sol AX génère un mélange d'oligosaccharides RE 2AB marqué et une série d'oligosaccharides non marqué (sans étiquette 2AB) dérivées des régions internes de la chaîne de xylane (figure 1, à partir Ratnayake et al. 2). Une série de méthodes chromatographiques est ensuite utilisé pour fractionner le mélange complexe d'isomères. Enfin, les techniques MS sont utilisés pour identifier les structures isomères qui sont ensuite séquencées par MS n techniques. Nous présentons ici un représentant, plutôt que globale, par exemple de l'approche.

Les signaux dans le spectre des oligosaccharides dérivés de 2AB marqué natif W-sol AX (figure 2A) MALDI-TOF-MS comprennent une série très abondante pseudo-ion moléculaire à m / z 701, 833 et 965 représentant une série de non marquée neutre internerégion oligosaccharides avec 5-7 résidus d'pentosyle (P 5-7), respectivement. Une série de signaux à m / z 745, 877 et 1009, qui désigne une série d'oligosaccharide acide , non marqué, avec p 4-6 + 1 HexA (acide hexuronique), est également présent dans cette fraction (figure 2A). Ions pseudo-moléculaire à m / z 821 et 953 indiquent la présence de l'2AB marqué d' origine oligosaccharides RE P 5-6 + 2AB, respectivement.

L'analyse ESI-QTOF-MS pour les oligosaccharides natifs avec un fractionnement chromatographique en ligne d'oligosaccharides par RP C-18 HPLC est ensuite réalisée. La figure 2B et 2C montre les balayages d'ions sélectionnés, extraites de ESI-QTOF-MS ionique total chromatogramme (TIC), des oligosaccharides libérés par endoxylanase de W-sol Fr AX. Les signaux comprennent une série d'ions pseudo-moléculaire désigné comme [M + NH4] + à m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, 1356 et représentant une série d'oligosaccharides neutres région interne avec 5-10 résidus d'pentosyle (P 5-10), respectivement (figure 2B). Plusieurs structures isomères sont possibles pour un oligosaccharide d'une masse définie (voir ci - dessous ESI-MS n analyse). Par conséquent , les pics multiples pour chacun des balayages d'ions moléculaires sont possibles comme on l' observe sur la figure 2B. Des ions pseudo-moléculaires sont assignées comme [M + H] + à m / z 271, 403, 535, 667, 799 et 931 indiquent la présence d'une 2AB étiquetée RE série oligosaccharidique P 6/1 + 2AB, respectivement (figure 2C) . Les signaux sont détectés comme [M + H] + ions à m / z 613, 745, 877, 1009, 1141 et 1273 indiquent la présence d'un oligosaccharides acides avec P + 8/3 HexA 1, respectivement (figure 2C). Dans les monocotylédones commelenid, l'épine dorsale xylane peut également être substitué par des acides phénoliques,principalement l' acide férulique (ainsi que l' acide p -coumaric), qui a la même masse moléculaire que l' acide glucuronique et peut être détectée dans le document W-sol AX de blé parois cellulaires de l' endosperme. Cependant, une analyse plus approfondie de W- et KOH-sol en utilisant AX ESI-MS n (et compositionnelle analyse par GC-MS des dérivés TMS suivant méthanolyse, non représenté ici) confirmer les oligosaccharides acides avec P 3-8 + HexA 1 à endosperme de blé AX.

Les signaux assignés comme [M + H] + ions de ESI-Q-TOF spectre analyse complète de la région comprise entre 3,10 à 3,48 min (figure 2D) comprend la série de 2AB étiqueté oligosaccharides RE: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, et 1195 (P 1-8 + 2AB, respectivement). Une série d'ions pseudo-moléculaire dans l'ESI-Q-TOF spectre analyse complète de la région comprise entre 3,59 à 4,05 min (Figure 2F) représentent la région interne oligosaccharides acides observentd à la fois comme [M + Na] + ions: m / z 613, 745, 877, 1009 et 1141 (P + 3-7 HexA 1, respectivement) et [M + NH4] + ions: m / z 740, 872, 1004, 1136 et 1268 (P + 4-8 HexA 1, respectivement).

Afin de séquencer les oligosaccharides individuels, nous avons effectué ESI-MS n sur le per-O-méthylé oligosaccharides plutôt que sur les oligosaccharides natifs obtenus à partir de W-sol et KOH-sol AX car il est difficile d'attribuer sans équivoque les structures par séquençage oligosaccharides natifs . De plus, elle nécessite également une plus grande quantité de matière. Méthylation des oligosaccharides a été réalisée comme décrit par Pettolino et al. , 1. L'ESI-MS n enquêtes effectuées sur les RE neutre alditols oligosaccharides dérivés de KOH-sol AX et 2AB étiquetés neutre oligosaccharide RE dérivé de W AX-sol sont décrits below comme exemple pour aider à l'interprétation des spectres et des structures déduites. La même approche peut être appliquée à tous les oligosaccharides générés par l'hydrolyse enzymatique. Les ions fragments dans l'ESI-SM n spectres ont été identifiés comme des ions Y et B selon l' une Domon & Costello. 16 groupe hydroxyle Un méthylé (s) généré pendant la fragmentation en phase gazeuse de per-O-méthylée oligosaccharides MS n fournit une 14Da différence de masse "cicatrice" qui peut être utilisé pour identifier le motif de ramification et les séquences de glycosyle. 12-13 Chaque cicatrice générée par l'événement de la fragmentation est marqué par une ligne solide (figures 3 et 4). Comme plusieurs structures isomères sont possibles pour une masse définie, puis dans ces structures isomères, les ions Y et B sont marqués en rouge et noir, respectivement.

L'ESI-MS 2, ESI-MS 3 et ESI-MS 4 spectra per-O-méthylée RE neutre alditol oligo-glycosyle générée à partir de la fragmentation de l'ion m pseudo-moléculaire / z 885 (P 4 + Xyl ol) est représentée sur la figure 3. Les deux spectre ESI-MS inclut l'abondance Y ions à m / z 711, 551 et 391 engendrés par la perte d'une, deux ou trois résidus pentosyle, respectivement, de l'ion parent. M abondant / z 711 ions peut être généré soit par la perte d'un résidu Xyl extrémité terminale non réductrice ou par la perte d'une chaîne latérale de résidu terminal Ara. Y diagnostic m / z 391 ions dans le spectre résultant peut être généré à partir de la perte de trois non réducteurs résidus de Xyl d'extrémité de l'oligosaccharide RE qui a un Ara résidu de la chaîne latérale sur le résidu ol RE Xyl ou l'oligosaccharide RE qui a un Ara chaîne latérale de résidu sur le résidu à partir du résidu ol RE 2 ème Xyl Xyl. Bien qu'il existe une possibilité formelle que d'autres structures, telles queXyl 4 -Xyl ol, et (Ara) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ol donnerait lieu à cette fragment ionique ces structures sont exclus de l'étude que la spécificité de l'endo-xylanase utilisée pour cliver le polysaccharide ne soit dégrader ou ne pas cliver à la liaison glycosidique adjacente à un point de branchement, respectivement. Par contre , le Y diagnostic m / z 551 ions peuvent être générés à partir de la perte de deux non réducteurs résidus de Xyl d'extrémité de l'oligosaccharide RE qui a le résidu d'Ara de la chaîne latérale de chaque résidu ol RE Xyl ou l'oligosaccharide RE qui présente du côté Ara chaîne de résidus sur le résidu de l'avant-dernier Xyl. Ainsi, les quatre structures isomères possibles peuvent être proposées (Figure 3: I, II, III et IV). L'abondante Y ion m / z 377 (voir Figure 3: Ia et IIa) et B ion m / z 503 (voir Figure 3: Ia, Ib, IVa et IVb) généré par une nouvelle fragmentation du isomérique précurseur m/ z 711 ion sont également observées dans ce spectre. L'ESI-MS 3 spectre (Figure 3) enregistré par la fragmentation du isomérique précurseur m / z 711 ions comprend un pic majeur à m / z 537 (Y ion de P 2 + Xyl ol avec deux cicatrices, généré à partir du précurseur d' ions Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa et IVb) et m / z 391 (Y ion de P 1 + Xyl ol avec une cicatrice, produite à partir de l'ion précurseur IIb, IIIa, IIIb, IVa et IVb). Ces deux pics majeurs (m / z 537 et m / z 391) peuvent être générés par la perte d'une et deux non réducteurs des résidus Xyl terminaux, respectivement, à partir du précurseur isomérique m / z 711 ions générés par la fragmentation de la pseudo -molecular ion parent m / z 885 (P 4 + Xyl ol) pendant ESI-MS 2. Des pics d'abondance relativement plus faibles à m / z 377 (Y ion de P + 1 Xyl ol avec deux cicatrices, générée à partir de la precursor ion Ia et IIa) et 551 (Y ion de P 2 + Xyl ol avec une cicatrice, produite à partir de l'ion précurseur Ib et IIb) ont également été observées dans ce spectre.

ESI-MS 4 de la fragmentation du précurseur isomérique m / z 551 ions comprend un pic majeur à m / z 377 (Y ion de P 1 + ol Xyl avec deux cicatrices) et m / z 391 (Y ion de P 1 + Xyl ol avec une cicatrice) générée à partir de l'ion précurseur des structures I et II. Par conséquent , l' ensemble des preuves suggère que la séquence RE glycosylique se compose de la chaîne latérale de l' Ara attaché au résidu ol RE Xyl (diagnostic voie de fragmentation m / z : 885 → 711 → 551 → 391, la figure 3II), l' Ara chaîne latérale fixée à la fois RE Xyl ol et l'avant - dernier (1 résidu st Xyl de RE Xyl ol) résidu Xyl (voie de fragmentation de diagnostic m / z 885 → 711 → 537 → 391; Figure 3III), chaîne latérale Ara attaché à l'avant - dernier (1 er Xyl de RE Xyl ol) Résidu Xyl (voie de fragmentation de diagnostic m / z 885 → 711 → 537 → 377; Figure 3I) et la chaîne latérale Ara fixé sur le résidu de l'ol RE Xyl (Figure 3iV) 2 e Xyl.

La présence de ces ions confirme les structures isomériques proposées I, II, III et IV ainsi que la structure neutre oligosaccharide RE de: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p.

L'ESI-MS 2 spectre de 2AB per-O-méthylé étiqueté RE oligosaccharide généré à partir du fragmentation de la quasi-moléculaire [M + Na] + ion à m / z 871 (P + 4 2AB) est représentée sur la figure 4. Ce spectre comprend l'ion le plus abondant Y m / z 697 (P + 3 avec une 2AB cicatriciel), m / z 537 (P 2 + 2ab avec une cicatrice) et m / z 377 (P 1 + 2ab avec une cicatrice), engendré par la perte d'une, deux ou trois résidus pentosyle non réducteurs, respectivement. M / z 697 ions peut être généré soit par la perte d'un résidu terminal extrémité Xyl non réducteur ou par la perte d'un résidu terminal d'Ara tandis que le rapport m / z 537 ion ne peut être générée par la perte de deux résidus Xyl terminaux . La voie de la fragmentation de diagnostic (m / z 871 → 697 → 537 → 377) a suggéré que l'existence d' un linéaire non ramifié oligosaccharide (s) dorsale xylane au RE correspondant à la quasi-ion moléculaire m / z 871 (P 4 + 2AB ). Toutefois , le linéaire non ramifié xylosyle squelette (P 4 + 2AB) est susceptible le site endoxylanase spécifique pour une autre digestion. Par conséquent , deux ions m isomérique / z 697 peuvent exister. Par conséquent deux structures isomères possibles sont proposés (Figure 4: I et II). Dans ces structures isomères ions Y et B sont marqués en rouge et noir, respectivement. 3 Spectre ESI-MS enregistré à partir de la fragmentation du précurseur isomérique m / z 697 ions génère m / z : 523 ion (Y ions P 2 + 2ab avec deux cicatrices, la figure 4, les structures Ia, Ib, IIa et IIb), m / z : 363 ion (Y ion de P 1 + 2ab avec deux cicatrices, la figure 4, la structure IIa) et de l' ion Y m / z 377 (P 1 + 2ab avec une cicatrice, la figure 4, les structures la et Ib). L'ion fragment à m / z 377 ne peut résulter de la structure proposée I et l'ion fragment à m / z 363 ne peut provenir que de la structure II proposée. La présence simultanée de ces deux ions confirment les structures proposées I et II. Ainsi , la séquence RE glycosyle de la chaîne xylane de blé AX d'endosperme se composent d'une branche Ara attachée au résidu RE Xyl (fragmentation voie m / z 871 → 697 → 523 → 363) et / ou des résidus de Xyl avant - dernier (fragmentation voie m / z 871 → 697 → 523 → 377).

L'analyse par RMN de l'AXS

Les analyses basées sur MS ne fournissent pas d' informations sur soit la configuration anomérique (α / β de) ou la configuration D / L des sucres qui doivent être obtenus par d' autres approches, y compris enzymatique et physique (par exemple, RMN). Pour hétéroxylanes avec le tétrasaccharide caractéristique RE réduite (Xyl-Rha-GALA-Xyl ol), le spectre RMN contient des signaux anomères menant à l'identification et le séquençage de ce RE oligosaccharide. Nous décrivons l'utilisation de 600 MHz spectroscopie 1D 1 H-RMN comme une méthode à une seule étape à detErmine la séquence glycosyle complète de l'endosperme de blé AX RE oligosaccharide sur le Fr KOH-sol, y compris la configuration anomérique (α / β de) et la configuration D / L des sucres. Résonances ont été attribuées sur la base des assignations publiées de blé AX oligosaccharides 17-18 (figure 5, tableau 1). Le spectre de 1H-RMN de l'AX extrait de l' endosperme de blé est dominé par les déplacements anomère chimiques à 5,39, 5,27 et 5,22 ppm qui sont affectés au proton d'un terminal résidu α-L-Ara f, attaché à O-3 positions (T-α-L-Ara f → 3 S) des (1,4) -β-Xyl p résidus de squelette seuls ramifiés et les deux joints 3 et O 2 positions (T-α-L-Ara f → 3 D et T-α-L-Ara f → 2 D) de (1,4) -β-Xyl p résidus de squelette doublement ramifiés, respectivement (figure 5 et tableau 1).

f → 3 S + D) __gVirt_NP_NN_NNPS<__ signal H1 d'α-L-Ara f la chaîne latérale fixée à la position O-3 du p résidu β-D-Xyl seul ramifié ayant contigu doublement ramifié β-D-Xyl p. Le signal à 5,29 est affectée à la (T-α-L-Ara f → 3 D + D) , le signal H1 de l' α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position O-3 de la β-D-Xyl doublement ramifié , p résidu avec contigu doublement ramifié β-D-Xyl p. le signal à 5,24 est affectée à la (T-α-l-Ara f → 2 D + D) , le signal H1 de l' α-l-Ara chaîne latérale f fixée à la 2 O position du résidu p doublement ramifié β-D-Xyl avec contigu doublement ramifié β-D-Xyl p.

Figure 1

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figure 1. Résumé de l' approche expérimentale Un résumé de la stratégie employée dans la génération, la purification et le séquençage de l'extrémité réductrice (RE) et oligosaccharides région internes. du blé arabinoxylanes d'endosperme (AXS) est affichée. Ce chiffre a été reproduit avec la permission de Ratnayake et al. (2014) 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. MALDI-TOF MS (A) et ESI-QTOF MS (B - E) l' analyse des oligosaccharides natifs libérés par endoxylanase à partir 2AB marqué W-sol AX , comme indiqué sur la figure 1. MALDI-TOF MS spectre: (A) ( les signaux d'un re identifié comme [M + Na] + ions adduits); Balayages d'ions sélectionnés de l'ESI-QTOF MS chromatogrammes: B = P 10/05 oligosaccharides provenant de la région interne (Les signaux sont identifiés comme [M + NH4] + ions adduits), C = P 6/1 + 2AB dérivés de RE oligosaccharides (Les signaux sont identifiés comme [M + H] + ions adduits) & P 3-8 G provenant d' oligosaccharides acides (Les signaux sont identifiés comme [M + Na] + ions adduits), D = ESI-Q-TOF complet spectre de balayage: région entre 3,10 à 3,48 min, E = ESI-Q-TOF spectre scan complet: région entre 3,59 à 4,05 min (Les signaux sont identifiés comme étant à la fois [M + Na] + et [M + NH4] + ions adduits ); P = unité de pentosyle (soit Ara ou Xyl); G = résidu de uronosyl (GlcA); RE = oligosaccharides réducteurs d'extrémité; 2AB = 2 aminobenzamide; EIC: extrait chromatogramme d'ions. ad / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. L'ESI-MS 2, ESI-MS 3 et ESI-MS 4 spectres de per-O-méthylé RE neutre glycosyl alditol (P 4 + Xyl ol) - m / z 885. Les signaux sont affectés comme [M + Na] + adduits ion pseudo-moléculaire. Comme plusieurs structures isomères pour une masse définie sont alors possible dans les structures isomériques ions Y et B sont marqués en rouge et noir, respectivement. Chaque «cicatrice» généré par l'événement de la fragmentation est marquée comme une ligne solide. résidu X = xylosyle; Un résidu = arabinosyle. L'ESI-MS 3 spectres a été reproduit avec la permission de Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L'ESI-MS 2 et ESI-MS 3 spectres de per-O-méthylé 2AB étiqueté neutre oligosaccharide RE (P 4 + 2AB) - m / z 871. Les signaux sont attribués comme [M + Na] + pseudo les produits d'addition d'ions -molecular. Comme plusieurs structures isomères pour une masse définie sont possibles dans les structures isomères, les ions Y et B sont marqués en rouge et noir, respectivement. Chaque «cicatrice» généré par l'événement de la fragmentation est marquée comme une ligne solide. résidu X = xylosyle; Un résidu = arabinosyle. Ce chiffre a été reproduit avec la permission de Ratnayake et al. (2014) 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.

Figure 5
La figure 5. La région anomérique du spectre de 600 MHz 1D 1 H-RMN des oligosaccharides AX généré par traitement de l'endoxylanase KOH- Sol P. 1 H déplacement chimique référencée à un niveau interne de l' acétone à 2.225 ppm. T-α-L-Ara f → 3 S: Signal H1 α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position O-3 du p résidu β-D-Xyl seul ramifié; T-α-L-Ara f → 2 D: le signal H1 α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position 2-O du p résidu β-D-Xyl doublement ramifié; T-α-L-Ara f → 3 D: le signal H1 α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position O-3 du p résidu β-D-Xyl doublement ramifié; T-α-L-Ara f → 3 S + D: le signal H1 de α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position O-3 du p résidu β-D-Xyl seul ramifié ayant attenante doublement ramifié β-D- Xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: le signal H1 de α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position O-2 du p résidu β-D-Xyl doublement ramifié avec attenante doublement ramifié β-D p -Xyl; T-α-L-Ara f → 3 D + D: le signal H1 de α-L-Ara chaîne latérale f attaché à la position O-3 du p résidu β-D-Xyl doublement ramifié avec attenante doublement ramifié β-D p -Xyl; 2-α-L-Ara f → 3 S: signal H1 de 2-α-L-Ara résidu de chaîne latérale f attaché à la position O-3 de la p résidu β-D-Xyl seuls ramifiés; S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.

résidus de sucre H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-4 / C-4 H-5 eq / C-5 H-5 ax / C-5
T-α-L-Araf → 3 S 5.396 / 107,6 4.16 3,95 4.3 3.82 3,72
T-α-L-Araf 5.415 / 4.18 3,95
→ 3 S + D
T-α-L-Araf → 2 D 5.223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-Araf → 2 D + D 5.243 / 4.16 3.98
T-α-L-Araf → 3 D 5.272 / 108,9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-Araf → D + D 3 5.298 / 4.18 3.96
2-α-L-Araf → 3 S 5.548 / 106,4 4.27 4.06 4.3 3.82
a-Xylp (Réduction) 5.185 / 91,9 3.55 3,72
ß-Xylp (Réduction) 4.580 / 96,6 3.29 3,48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3,58
ß -4-Xylp + E 4.461 3.31 3.56 3,75 4.08 3,36
β-4-Xylp + D 4.448 3.31 3.56 3,75 4.08 3,36
la ß-3,4-Xylp 4.518 / 3,44 3.85
S + β-3,4-Xylp 4.514 / 3,47 3,75 3.86 4.14 3.43
D + β-3,4-Xylp 4.505
ß-3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-D + Xylp 4.482 3.45 3.74
ß-2,3,4-Xylp 4.638
S + β-2,3,4-Xylp 4.627 3,59 3.87 3,88
D + β-2,3,4-Xylp 4.616
ß-2,3,4-Xylp + E 4.593
β-2,3,4-Xylp + D 4.593
Les déplacements chimiques sont rapportés par rapport à l'acétone interne, ô 2,225.
S = Singly ramifié β-Xylp
S + D = Singly ramifié β-Xylp + Doublement ramifié β-Xylp
D = β-ramifié Doublement Xylp
D + D = Doublement ramifié β-Xylp + Doublement ramifié β-Xylp

Tableau 1. Signaux 1 H-RMN des xylo-oligosaccharides générés par le traitement endoxylanase de l'endosperme de blé KOH sol P.

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Discussion

La plupart des ossatures paroi cellulaire des polysaccharides de la phase de matrice ont apparemment au hasard substitué (à la fois glycosyle et des résidus non glycosylés) , qui sont très variables en fonction de l'espèce végétale, le stade de développement et le type de tissu 3. Comme polysaccharides sont des produits de gènes secondaires leur séquence est pas modèle dérivé et il n'y a donc pas d'approche analytique unique, comme il en existe pour les acides nucléiques et les protéines, pour leur séquençage. La disponibilité des enzymes hydrolytiques spécifiques liaison purifiées a fourni un outil puissant pour dégrader les polysaccharides à oligosaccharides qui peuvent ensuite être chromatographiquement fractionnés, et lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des techniques chimiques et physiques entièrement séquencé. Le défi est de puis ré-assembler ces mélanges complexes dans l'un du polysaccharide d'origine qui est toujours d'être traités avec succès.

Nous décrivons ici une approche (dont l'ordre d'application can est varié) qui repose sur l'intégration des enzymatique établie, chimiques et techniques physiques pour la caractérisation structurale des deux l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) du hétéroxylanes. Une technique complémentaire supplémentaire non décrit ici qui a révélé très utile pour caractériser oligosaccharides est l' APCE (analyse de polysaccharide par électrophorèse sur gel d'hydrate de carbone) développé par le groupe Dupree 19 et il pourrait facilement être intégré dans ce protocole si l'équipement est disponible. En outre, des variations sur la chromatographie LC peuvent également être utiles, telles que la chromatographie en tandem ligne d'interaction hydrophile (HILIC) suivie d'une chromatographie RP offrant la possibilité de séparer les deux non marqué / étiqueté oligosaccharides en une seule étape. Les techniques reposent sur le marquage (avec 2 aminobenzamide (2AB)) de l'extrémité réductrice (RE) de la chaîne hétéroxylane avant l'enzymatique (endoxylanase) hydrolyse. Deux approches différentes (voir résumé enFigure 1) sont adoptés. Dans la première, W AX-sol intactes sont traitées avec 2AB pour marquer le résidu initial de sucre dans la chaîne du squelette RE et ensuite traités avec une endoxylanase pour produire un mélange de 2AB marqué RE et la région interne oligosaccharides réducteurs, respectivement. Dans une deuxième approche, le Fr KOH-sol est hydrolyse avec endoxylanase d'abord générer un mélange d'oligosaccharides qui sont ensuite marquées avec 2AB. Dans ce dernier scénario , le RE initial de l'AX KOH-sol ne serait pas marquée avec 2AB , car il a été ramené à la glycosyl-alditols lors de l'extraction alcaline contenant l' agent réducteur, le borohydrure de sodium (NaBH 4). Par conséquent, les oligosaccharides 2AB marqués générés digestion post-xylanase, proviendra des oligosaccharides "internes" et l'oligosaccharide de RE originale contiendra un alditol RE sans étiquette de 2AB (voir Figure 1). Cette approche peut également être appliquée à d'autres classes de polysaccharides uchanter (le cas échéant) les endo-hydrolases appropriées.

L'approche MS est significativement améliorée par la méthylation des oligosaccharides générés après le traitement de endoxylanase puisque le groupe hydroxyle non méthylé (s) généré pendant la fragmentation en phase gazeuse d'oligosaccharides par-O-méthylé dans MS n fournit une 14Da différence de masse "cicatrice »qui peut être utilisé pour aider à l'identification du motif de ramification et la séquence de glycosyle. 06/05 l'identité des résidus d'pentosyle (et de tout résidu de sucre) ne peut être faite à partir des données MS seul , mais provient d'avoir une bonne connaissance de la composition de la molécule; où ce n'est pas disponible, les analyses de monosaccharide et d' assemblage pertinentes doivent être effectuées avant d'effectuer ces missions dans MS n. Par ailleurs , les signaux correspondant à la alditol RE oligosaccharide acide généré à partir du KOH-sol Fr (3 -MeGlcA Xyl-Xylitol: m / z 761) et le chséquence aracteristic glycosyle xylane RE dicotylédones (Xyl 2 -RHA-GALA-Xylitol: m / z 761), le cas échéant, ne sont pas en mesure d'être distingué comme les deux ont la même masse moléculaire sous forme native , mais peut être distinguée de leur MS fragmentation ( MS n) spectres qui est le mieux réalisée sur les oligosaccharides méthylés. Enfin, les techniques à base de MS sont incapables de fournir des informations sur soit la configuration anomérique (α / β) de la liaison glycosidique ou la configuration D / L de la sugars- cela doit être déterminé par d' autres méthodes, y compris enzymatique et physique (par exemple, RMN).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

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References

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