Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas

Bioengineering

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Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

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Abstract

Introduction

Hemostasis requiere la actividad combinada y regulada de células, proteínas, iones y tejidos en un contexto espacio-temporal restringida 1. actividad no controlada puede conducir a hemorragia o trombosis y la morbilidad o la mortalidad en un espectro de trastornos relacionados con la coagulación de la sangre. Un experimento de la cámara de flujo de microfluidos es una técnica difícil que imita hemostasis in vitro. Este enfoque permite la investigación de la compleja interacción de procesos que intervienen en la hemostasia con el protagonismo de las plaquetas sanguíneas.

Después de una lesión vascular, las plaquetas se adhieren a las proteínas de la matriz subendotelial expuesta (glico) para prevenir la pérdida de sangre. Después de la adhesión, las plaquetas se activan y el agregado en respuesta a auto- y señalización paracrina que finalmente conduce a la formación de una red de plaquetas, fibrina y estabilizada por lo que resulta en una firma, la herida trombo 2 de sellado. A diferencia de la mayoría de las otras pruebas de la función plaquetaria, expetos con cámaras de flujo tienen en cuenta el parámetro físico del flujo sanguíneo y por lo tanto la influencia de la reología en las células y biomoléculas 3,4 participantes.

experimentos en cámara de flujo han proporcionado multitud de datos de la señal en la hemostasia y la trombosis mediante la variación de los parámetros clave que influyen hemostático (sub) procesos, incluyendo los perfiles de matriz adhesiva, reología y de flujo, composición celular, presencia de toxinas o drogas, fuerza iónica y muchos más. En las últimas dos décadas, experimentos con la cámara de flujo bajo rendimiento que requieren grandes volúmenes de muestra (10-100 ml) se han desarrollado para cámaras de microfluidos menudo consisten en pequeñas cámaras de placas paralelas y que incluyen la tecnología moderna para la perfusión de sangre total en condiciones controladas muro de corte 5. Microscaling ha aumentado significativamente el rendimiento de ensayo sobre todo porque la instalación del hardware ha simplificado y se requiere menos volumen (sangre), lo que hace el experimento más accesible y VersatiLe. Por ejemplo, la sangre de los animales pequeños de laboratorio ahora puede ser utilizado sin la necesidad de sacrificar los animales. De este modo muestras de sangre de ratones modificados genéticamente han ayudado en la identificación de moléculas clave promover o inhibir la hemostasis y en nuevos conocimientos básicos 6.

Laboratorios de investigación especializados a menudo todavía utilizan cámaras de flujo a la medida, por ejemplo de polidimetilsiloxano (PDMS) 7 que polimeriza en moldes litografiado que puede ser blueprinted por software. La cámara resultante es barato, desechable y se puede desmontar fácilmente para el análisis post hoc. Por otra parte, básicamente cualquier diseño de embarcaciones, incluyendo las bifurcaciones o giros bruscos se puede construir en el comando. Esta ventaja es también su lado negativo porque su normalización ya era el principal problema con experimentos en cámara de flujo, y PDMS encargo cámaras no han ayudado esto. En la parte superior de este tema en particular, recubrimiento (condiciones), sondas fluorescentes, anticoagulante, tempratura y el tiempo entre el muestreo y análisis están mal estandarizados 8. La estandarización de estas variables es un reto, pero no obstante necesario para permitir la comparación de resultados entre laboratorios. Este tema es el tema principal de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia en subcomité científico y Normalización en Biorheology 9,10.

Los concentrados de plaquetas (PC) se transfunden en pacientes que sufren de diversas enfermedades que causan trombocitopenia y / o sangrado. Pero plaquetas en PC son conocidos para desensibilizar, especialmente en función del tiempo de almacenamiento 11, un proceso de deterioro relacionado con el envejecimiento y comúnmente conocida como lesión de almacenamiento de plaquetas. A veces se afirma que tales plaquetas restaurar en circulación una vez transfundida 12, pero la evidencia de esto es escasa. Además, la funcionalidad de las plaquetas que forman un PC no se prueba de forma rutinaria debido a que la relación entre tales ensayos yla eficacia terapéutica o profiláctica está claro 13. cámaras de flujo de microfluidos ofrecen un medio para investigar la función plaquetaria en PC para optimizar la cadena de manipulaciones entre la recogida y entrega. Es una poderosa herramienta de investigación para las comparaciones directas (pares) de PC como hemos previamente publicados 14,15 y se describe aquí.

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Protocol

Este protocolo sigue las directrices éticas institucionales para la investigación en muestras humanas y el consentimiento informado se obtuvo de todos los donantes involucrados. La aprobación de los experimentos descritos aquí se obtuvo de la junta de revisión institucional del Hospital de la Universidad de Amberes.

Nota: Las indicaciones de temperatura son siempre la temperatura ambiente, a menos que se especifique.

1. Configuración de la cámara de flujo Preparación

  1. Los carriles se preparan, intubación y prendedores
    1. Vortex la suspensión de colágeno vigorosamente y se diluye 1/20 en la solución de glucosa isotónica suministrado por el proveedor para una concentración final de 50 mg / ml.
      NOTA: Nosotros usamos colágeno de tendón equino, hecha principalmente de tipo I fibrillas. El equino colágeno tipo I se refiere a menudo como "Horm" colágeno y es el estándar de oro para este tipo de ensayo 9, tanto por razones históricas, así como biológicos. humano de tipo colágeno III también se puede utilizar, pero THe fibrillas capa menos bien y la respuesta de las plaquetas no es tan fuerte. Otras superficies de revestimiento también se pueden utilizar, por ejemplo factor de von Willebrand (VWF), el fibrinógeno, la fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 o combinaciones de éstos 16.
    2. Tome un nuevo biochip desechable desde el recipiente del proveedor. Las dimensiones de los biochips utilizados aquí son 0.4W x 0,1H x 20L en mm 3.
    3. Pipetear 0,8 l en el carril (s) del biochip de microfluidos en un extremo del chip y la marca como de salida. Asegúrese de que el carril está vacío 5/6 ° con el colágeno que contiene la solución de revestimiento preparada en el apartado 1.1.1. Asegúrese de que no hay burbujas de aire.
      Nota: Los canales están revestidos parcialmente para evitar la acumulación de fibras de colágeno en la entrada del canal (véase la discusión).
    4. Se incuba a 4 ° C durante 4 horas o durante la noche en un recipiente humidificado y cerrada.
    5. Bloquear los canales revestidos pipeteando tampón de bloqueo (1,0% (w v) de suero / albúmina bovina unad 0,1% (w / v) de glucosa en mM solución salina 10 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tamponada (HBS; 0.9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) en el otro extremo y la marca como entrada. Asegúrese de que el carril está completamente lleno con el tampón de bloqueo evitando las burbujas de aire.
    6. Cortar un tubo a igual longitud (12 cm). Utilice uno por carril y conectar cada tubo con un alfiler. Por ejemplo, un experimento que compara dos condiciones, por duplicado requerirá cuatro tramos de tubería y cuatro pasadores para ser preparados.
    7. Enjuague el tubo con agua destilada utilizando una jeringa y una aguja de 26 G o los conectores que se acompañan.
    8. Saturar el tubo con tampón de bloqueo. Almacenar en un recipiente cerrado y humidificado durante un mínimo de 1 hora.
  2. Preparación de la bomba y el colector
    1. Enjuagar la bomba y el colector con agua destilada, eliminar las burbujas de aire.
    2. Aspirar el tampón de bloqueo fuera del carril (s) biochip usando la punta 10 l fija en la salida. Limpiar la superficie deel biochip con un polvo de precisión sin pelusa y alcohol desnaturalizado para eliminar huellas y polvo.
    3. Fijar el biochip en una platina del microscopio automatizado. Si se utiliza más de un carril de forma simultánea en una sola carrera, conectar el divisor múltiple de ocho carriles a la salida de biochips.
      Nota: El divisor de colector de ocho carriles es una pieza de hardware (Figura S1) conectado a la bomba y el biochip. Se permite el funcionamiento de todos los carriles (ocho) disponibles en un biochip o una combinación de carriles que pueden ser definidas por el operador en el software adjunto.
    4. Utilice las clavijas en el tubo para fijarlos en la entrada del biochip. Coloque el otro extremo del tubo (sin pin) en un tubo de ensayo cónico de 1,5 ml lleno con HBS. Enjuague todos los tubos y sus carriles conectados con 1 ml de HBS usando la bomba, a fin de eliminar resto tampón de bloqueo y mal adheridas colágeno.

2. Preparación de muestras de sangre

  1. Recogida y separación desangre total fresca de un voluntario sano. 17
    1. Recoger los primeros ml de sangre en un tubo al vacío que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y utilizar exclusivamente esta muestra para recuento sanguíneo completo (CBC) con un analizador hematológico automatizado.
    2. Recoger un volumen de sangre en un anticoagulante adecuado utilizando tubos de vacío. anticoagulantes estándar para experimentos en cámara de flujo son heparina o hirudina cuando formación de fibrina no es parte del protocolo de estudio y citrato de sodio cuando es.
      Nota: La heparina se utiliza como anticoagulante para todos los experimentos descritos en los resultados.
      Nota: La cantidad de sangre depende del número de experimentos a realizar. Aproximadamente 1 tubo (7 ml) durante 3 carriles.
    3. Colocar los tubos en un rotador a la espera de la reconstitución de la sangre.
      Nota: El ensayo debe ser completado dentro de 3 horas de la flebotomía.
    4. Centrifugar durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico en plaquetas (PRP). No utilice la ruptura centrífuga para evitar la perturbación de la pastilla sin apretar.
      1. Cuando se recogió más de un tubo, en común la sangre en un único tubo de centrifugación cónico.
        Nota: La centrifugación se puede hacer más lenta o menos largo, en función del rendimiento de PRP y la "contaminación" diferencial celular preferida.
    5. Retire y deseche el PRP y la capa leucocitaria produciendo glóbulos rojos empaquetados con pocas plaquetas.
      Nota: El número de plaquetas en la fracción de glóbulos rojos es de 13 ± 5 x 10 3 por l (media ± SD, n = 12) en promedio en nuestras manos.
  2. La reconstitución de sangre
    1. grupo sanguíneo AB deshielo (Rhesus D negativo) de plasma a 37 ° C durante 5 min y 20 seg por 4 ml.
    2. Determinar el hematocrito de los glóbulos rojos concentrados preparados en 2.1.5 utilizando un analizador de hematología automatizado.
    3. Determinar la concentración de plaquetas en el banco de sangre preparado de plaquetas concentrado that se utilizó para reconstituir la fracción de glóbulos rojos por encima.
    4. Calcular el volumen de glóbulos rojos empaquetados y concentrado de plaquetas que producirán el 40% de hematocrito y 250 x 10 $ ³ $ plaquetas / l en una muestra de 1 ml.
      Nota: Otros títulos de destino de las células se pueden fijar arbitrariamente, dependiendo del protocolo de estudio.
    5. Transferencia de glóbulos rojos empaquetados y plasma en un tubo fresco usando una punta de pipeta recortado y agregar el concentrado de plaquetas hasta que se alcanza un volumen de muestra de 1 ml.
      Nota: En función de las variables estudiadas, la fracción de plasma debe ser igual en todas las muestras reconstituidas porque plasma tiene una influencia significativa en la tasa de formación de trombos. Por ejemplo, ciclos de congelación-descongelación o plasma tomado de diferentes donantes o en diferentes anticoagulantes puede influir en el resultado.
    6. Mezclar la sangre reconstituida suavemente por inversión y realizar un hemograma completo.
    7. Preparar una muestra de control "en blanco" en el que se sustituye el volumen de la fracción de plaquetaspor el mismo volumen de 0,9% (m / v) de cloruro sódico en agua para determinar la concentración de plaquetas endógenas (es decir, las plaquetas de banco no sanguíneos) en la sangre reconstituida usando un CBC.
  3. etiquetado
    1. Pipetear 1 ml reconstituidos sangre en un tubo de ensayo que contiene 1 l 5 mM de calceína AM (5 M de concentración final).
      Nota: Otros colorantes cubetas se pueden utilizar 14.
    2. Mezclar suavemente por inversión.
    3. Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de su uso.

3. Ensayo de perfusión

  1. Enfoque el objetivo sobre las fibras de colágeno adheridas en la parte inferior de los carriles. Lo ideal es utilizar la configuración de contraste diferencial de interferencia (DIC) de contraste de fase o de esta estrategia de enfoque. Seleccione 'Z actual Conjunto para las regiones de azulejos seleccionados' en el software experimento para corregir digitalmente los Z-posiciones seleccionadas.
  2. Seleccionar una región de interés (ROI) en el carril (xy) en el software de experimento de la microscope que será grabado durante el experimento.
    Nota: El rendimiento de la inversión puede ser cualquier superficie escogida arbitrariamente dentro de un carril de perfusión. Es aconsejable no para analizar la formación de trombos cerca de la entrada y salida de un carril para que para evitar efectos secundarios del perfil de flujo variable en esa región, a pesar de que esto es relativamente pequeño. El área de superficie ROI debe contener un número significativo de plaquetas o trombos para permitir la nivelación de la señal. En este protocolo la ROI es un agregado cosido digital de tres imágenes del mismo tamaño de lado a lado que resulta en 0,62 mm 2 en el medio de los 2 cm de largo carril.
  3. Mezclar suavemente las muestras por inversión y la posición de éstas junto al biochip en el escenario automatizado.
  4. Coloque el tubo que está conectado con la entrada del biochip en los tubos de ensayo que contienen las muestras de sangre reconstituidas.
  5. Poner en marcha la bomba a 50 dinas / cm 2 (u otras tensiones tangenciales como se desee) para los canales vinculados a tubos de ensayoque contiene las muestras de sangre reconstituidos utilizando el software de la bomba.
    Nota: Otros esfuerzos de corte pueden ser utilizados.
  6. grabar imágenes cada 15 segundos durante 5 minutos en tiempo real usando el software de adquisición y el experimento del microscopio.
    Nota: Otra serie de tiempo se puede utilizar dependiendo de la configuración experimental.
    Nota: Generalmente usamos un aumento de 100X (10X y 10X objetivo lentes), pero mayor (o menor) de ampliación se puede utilizar fácilmente como una alternativa.

4. Enjuague

  1. Lavar todos los tubos unido a la salida y conectado al colector de multicanal o de la bomba con agua destilada, seguido de hipoclorito de sodio (lejía) 0,5% (v / v) y, finalmente, NaOH 0,1 M en agua. Desechar el tubo fijado a la entrada del biochip como residuos peligrosos.

Análisis 5. Datos

  1. Determinar la cinética de crecimiento de trombos con el software de análisis de imágenes. Los siguientes comandos son específicos para ZEN2012. Análisis abrir el complemento de imagen para determinar la cobertura de la superficie de las plaquetas.
  2. Establecer el umbral de fluorescencia en la pestaña Analizar interactiva para definir la intensidad de los píxeles que se correlaciona con una señal positiva, es decir, un plaquetas adheridas o plaquetas adheridas.
  3. Utilice Crear tablas para generar automáticamente una hoja de cálculo que contendrá las superficies separadas (en m 2) de esos "objetos" que contienen píxeles con una señal entre los umbrales seleccionados. Esto se realiza para cada punto de tiempo.
    Nota: Una vez que los umbrales de fluorescencia han sido elegido, el software de análisis detecta automáticamente "objetos" en el campo de visión de que cumplan los criterios. Estos objetos son trombos, pequeños agregados de plaquetas o plaquetas individuales y cubren un número de píxeles. Cada objeto aparece en la hoja de cálculo por separado.
  4. Guarde estas hojas de cálculo en formato XML y abrirlos en una hoja de cálculopara los cálculos posteriores.
  5. Total de las zonas de la superficie de los objetos seleccionados por la suma y dividir el resultado por el área total del campo de medición (m 2). Esto dará lugar a la cobertura de la superficie relativa (%). Hacerlo para cada punto de tiempo.
  6. Trazar estas coberturas de superficie en función del tiempo de perfusión y calcular la pendiente por regresión lineal, obteniéndose la cinética de crecimiento de trombos de esa condición particular.

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Representative Results

Para demostrar la variación intra-ensayo, tres idénticas muestras de sangre entera reconstituidas fueron perfundidos simultáneamente sobre superficies revestidas de colágeno (Figura 1). Esto dio lugar a un coeficiente de variación de 8,7%. Esta estadística sugiere intra-ensayo aceptable y la variación intralaboratorio que permite una comparación fiable entre muestras relacionadas.

La entrada de la cámara de flujo comercial que describimos aquí es perpendicular a la cámara de medición y esto puede causar un poco turbulento en lugar de flujo laminar en ese punto. Especialmente en los experimentos sin anticoagulación esto puede causar la obstrucción debido a la mayor tiempo de contacto entre la sangre y el agonista inmovilizado. La entrada obstruido puede confundir la lectura aguas abajo en la cámara. Por lo tanto, la configuración se ha optimizado mediante el recubrimiento parcialmente la cámara de flujo (Figura 2) que sale de laentradas desprovistas de agonista de plaquetas, evitando así la activación prematura de la hemostasia primaria y secundaria. Recubrimiento parcial de las superficies adhesivas está, además, utilizado con éxito por otros grupos de investigación en el campo 16. Además, este truco práctica directa es de gran valor para el estudio de la zona de "transición" donde la sangre que fluye sobre la superficie no reactiva (sin recubrimiento) continúa sobre la parte reactiva (recubierto).

La transfusión se simuló mediante la reconstitución de la sangre con el componente deficiente. Para este propósito, anticoagulada de sangre entera de un donante sano se hizo trombocitopénica por centrifugación y PC plaquetas diferenciales se añadieron para aumentar el recuento de plaquetas. Una cuestión importante aquí fue lo que el recuento de plaquetas para apuntar? En la mayoría de los casos, las transfusiones de la vida real no dan lugar a la normalización de los recuentos de plaquetas en el paciente trombocitopénica. Más bien un valor por encima de un cierto umbral está dirigido a,aunque el valor objetivo exacto es mal definidos 19. Para comprender la influencia de la variación de los recuentos de plaquetas en microfluidos resultados cámaras de flujo en el contexto de la reconstitución de la sangre, varios reconstituciones se realizaron con concentraciones decrecientes de plaquetas (Figura 3). Como se esperaba, el recuento de plaquetas inferiores resultó en una menor adherencia en función del tiempo de perfusión. Por lo tanto, dentro de un determinado estudio, el recuento de plaquetas deben ser estandarizados para permitir la comparación entre las condiciones de la muestra 20. El mero hecho de que hay menos adherencia cuando los recuentos de plaquetas son bajos sin embargo no implica que el ensayo no se puede utilizar para medir la deposición de plaquetas en las muestras con trombocitopenia debido a la configuración de microscopía y de la cámara se pueden adaptar para aumentar la sensibilidad. Por último, en la mayoría de los casos, la muestra utilizada para la reconstitución trombocitopénica contiene plaquetas autólogas resto que se asemeja a la situación en la mayoría de los pacientes de transfusión 19 exigente. Es currtemente claro si y cuál es el papel de las plaquetas autólogas es en el contexto de la transfusión con plaquetas alogénicas pero es una cuestión interesante para la investigación futura.

Después de la recogida de sangre de donantes voluntarios sanos, la sangre entera se enfría a menudo y se mantiene a temperatura ambiente constante antes de la preparación de componentes. Las plaquetas son sin embargo sensible a los cambios de temperatura. La Figura 4 muestra el efecto de la temperatura disminuyó después de la recogida de sangre y durante la perfusión. Los trombos se encontraron para construir más lentamente cuando la sangre se enfrió a temperatura ambiente (Figura 4A) en comparación con una muestra idéntica (emparejado) se mantuvo a 37 ° C durante todo el estudio (Figura 4B).

En la circulación, las plaquetas se unen a sitios de lesión de los vasos en condiciones de tensión de cizallamiento elevado. Diferentes velocidades de cizallamiento en cámaras de flujo de microfluidos coated con VWF / fibrinógeno dio lugar a diferencias de total adhesión de plaquetas en el punto final (Figura 5A) y para la cinética de crecimiento de trombos (Figura 5B).

Por último, para demostrar cómo las cámaras de flujo de microfluidos pueden ser utilizados para investigar PC utilizado para la transfusión, se investigó la cinética de crecimiento de trombos en la función de almacenamiento de PC. Todas las variables en la preparación de muestras y el montaje experimental se estandarizaron a lo largo del periodo de estudio. Por lo tanto, el único parámetro variable era PC almacenamiento tiempo. La Figura 6 indica la disminución de crecimiento de trombos en función del tiempo de almacenamiento que demuestra el efecto de la lesión de almacenamiento de plaquetas en la hemostasia en vitro.

Figura 1
Figura 1:. Variación intra-ensayo en experimentos con la cámara de flujo de microfluidos flo de microfluidos experimentos con la cámara W se realizaron sobre colágeno inmovilizado a 50 dinas / cm². Los tres idénticas muestras de sangre entera reconstituidas fueron perfundidos en paralelo y al mismo tiempo. Los resultados se muestran como rango (bigotes) para la cobertura de la superficie en función del tiempo de perfusión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Canal parcialmente recubiertos Las fibras de colágeno (A) visualizadas por microscopía de contraste de fase se encuentra sólo en la región recubierta. (B) una instantánea después de 5 min de perfusión con una muestra de sangre completa de calceína AM con etiqueta reconstituyó bombeado a 50 dinas / cm 2 se muestra. Ambas imágenes fueron tomadas con una ampliación de 100X. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: cinética de crecimiento del trombo dependen de los recuentos de plaquetas en sangre reconstituida (A) La sangre fue reconstituida a partir de una plaqueta banco de sangre concentrado produciendo diferentes concentraciones de plaquetas:. 245 x 10³ / l (●), 42 x 10³ / l (■) y 12 x 10³ / l (▲). experimentos en cámara de flujo de microfluidos con canales recubiertos de colágeno se realizaron simultáneamente para las tres muestras a una tensión de cizallamiento de 50 dinas / cm $ ² $. (B) Las pendientes calculadas por regresión lineal de los datos en bruto en el panel A se representan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ontenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4:. La temperatura y cámaras de flujo de microfluidos Whole sangre recogida en tubos vacutainer de heparina se conservó durante 15 min en un baño de agua a temperatura ambiente (A) o a 37 ° C (B). Perfusión de microfluidos en colágeno inmovilizado en un esfuerzo cortante de 50 dinas / cm 2 se llevó a cabo. Instantáneas en el punto final (5 min de perfusión) se representan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Papel de la tensión de cizallamiento en la adhesión de plaquetas a inmovilizada VWF / fibrinógeno (A). Cuatro idénticos, calceína AM marcada, reconstituye la sangre enteraLas muestras se sometieron a perfusión a través de una superficie recubierta de VWF / fibrinógeno con la variable de tensión de corte: 4,5 dinas / cm² (●), 50 dinas / cm² (■), 90 dinas / cm² (▲) y 225 dinas / cm² (♦). Después de 3 minutos de perfusión, una instantánea fue tomada de los cuatro canales. Coberturas (B) de superficie en función del tiempo de las muestras descritas en (A) se muestran ilustran las diferencias en la cinética de crecimiento del trombo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6:. La formación de trombos de concentrados de plaquetas en función del tiempo de almacenamiento Todos los experimentos cámara de flujo de microfluidos se realizaron en condiciones estandarizadas en las superficies recubiertas de colágeno a una velocidad de cizallamiento de 50 dinas / cm 2. La sangre era reconstituido con muestras de plaquetas del mismo concentrado probado por duplicado en el día tres (●), siete (■) y diez (▲) después de la donación. Coberturas de superficie en función del tiempo de perfusión se representan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

S Figura 1

Figura S1:. Configuración del hardware cámara de flujo de microfluidos (A) A Vena 8 fluoro + biochip se monta en la etapa automatizada del microscopio y se conecta mediante un tubo flexible a una bomba de jeringa con el colector para dividir la función de bombeo en ocho canales separados. (B) de la sangre reconstituida fluye a través del tubo desechable en el lado derecho en los canales seleccionados de la biochip (entrada). El tubo desechable se fija en la entrada a través de un stainlacero ess pin desechable suministrado con la configuración. El flujo sanguíneo en (B) es de derecha a izquierda y se recoge en tubos largos y flexibles. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Experimentos en cámara de flujo de microfluidos son una excelente herramienta para investigar la función de las plaquetas en la sangre que fluye y se utilizan para evaluar la hemostasia in vitro en diversos contextos experimentales. A pesar de su falta de estandarización entre laboratorios 9, se demuestra que dentro de nuestro laboratorio de la variación experimental es aceptable. Esto permite comparar de forma fiable muestras pareadas () dentro de un determinado estudio. Este fue validado usando el fenómeno bien documentado de la lesión de almacenamiento de plaquetas, que es una consecuencia perjudicial de almacenamiento de plaquetas en condiciones de banco de sangre 11. Por otra parte, hemos publicado recientemente el impacto de las tres tecnologías de inactivación de patógenos disponibles en función de las plaquetas de la PC en cámaras de flujo de microfluidos después de la reconstitución de 14,15 sangre.

Las plaquetas responden de manera diferente cuando los parámetros biofísicos y químicas son variadas 20. Por lo tanto, la tensión de cizallamiento, el número de células y la composi celularción, la temperatura, la capa, anticoagulante y muchos más factores pueden ser modificados dentro de este protocolo dependiendo de la pregunta de investigación. Este protocolo utiliza sólo herramientas de hardware y software disponibles en el mercado, permitiendo a otros laboratorios para llevar a cabo un ensayo similar. Para fines de investigación básica que esto puede ser una desventaja, especialmente debido a que el hardware disponible es menos versátil que las configuraciones personalizadas. El ensayo en sí mismo es robusto pero reproducibilidad sufre de la variación biológica y temporal. Por lo tanto, las muestras de ensayo deben estar vinculados tanto como sea posible y estudiar tamaños debe ser suficientemente grande. Las muestras también deben estar vinculados en el tiempo, porque la sangre reconstituida sólo puede ser almacenada por un corto tiempo.

A pesar de que las cámaras de flujo de microfluidos para estudios de función plaquetaria han impulsado el campo de la investigación, se debe tener cuidado al overinterpret la dependencia de plaquetas sobre la reología sanguínea. En primer lugar, la forma rectangular de la cámara de flujo no es fisiológica, but lo mejor que tenemos para permitir óptico de enfoque en el crecimiento de trombos. En segundo lugar, los vasos sanguíneos no están hechas de plástico y la influencia de la elasticidad de los vasos sanguíneos de la función plaquetaria, por lo tanto no pueden ser estudiados en este protocolo. En tercer lugar, el corazón hace que el flujo pulsátil, mientras que las bombas de jeringa son más lineal (aunque también ligeramente pulsátil). Por último, el tipo fibrilar I colágeno es el material estándar utilizado para los estudios de plaquetas bajo flujo, que es de origen animal. Es de destacar, sin embargo, el tipo fibrilar I colágeno y resultados clínicos de la función plaquetaria se correlacionan bien en muchos casos, como se muestra por décadas de experiencia en (transmisión de luz) agregometrıa 21,22.

Hay muchos ensayos para estudiar la función plaquetaria 23. La mayoría de estos dirección de uno o un par de características de plaquetas, mientras que poner las plaquetas para trabajar en (modelos de) la hemostasia. de imágenes en tiempo real de la formación de trombos como se ha demostrado aquí es la más inclusiva, hasta la fecha. Esto significa que la mayoría de los aspectos de la plaLa respuesta de Telet de lesión de los vasos están incluidos. Las ventajas únicas son la inclusión de flujo de sangre y la presencia de todas las células sanguíneas. El ensayo es sensible a los fármacos actualmente utilizados para la terapia antiplaquetaria 24, así como a los cambios genéticos resultantes en función de las plaquetas aberrante 25. Esto demuestra su valor como un indicador relevante de la función plaquetaria. La naturaleza integral de este ensayo, sin embargo, también implica que es menos analítico que esos ensayos que miden características de la respuesta de la plaqueta. Por lo tanto, por los efectos de las manipulaciones de bancos de sangre en los concentrados de plaquetas pueden recogido por ensayos de cámara de flujo, pero para interpretar lo que les causa, se requiere un análisis adicional. Por ejemplo, nuestros datos indican que la temperatura influye significativamente en la adhesión de plaquetas en cámaras de flujo de microfluidos. Sin embargo, un análisis detallado adicional ha demostrado que las plaquetas refrigerados cambian de forma y receptores clúster GPIba 26.

et al., 16 demostró la importancia de la definición de sustrato a las plaquetas biología de sistemas. Además, la combinación de la variación de velocidades de cizallamiento en función del sustrato es importante, ya que la unión de las plaquetas a vWF inmovilizado se requieren altas velocidades de cizallamiento, mientras que esto es menos importante para la unión a colágeno. Por lo tanto, dependiendo de la pregunta de investigación, las opciones se pueden hacer en qué sustratos y sus respectivas velocidades de flujo son para ser incluidos.

En conclusión, se presenta un protocolo para los experimentos de la cámara de flujo de microfluidos para estudiar la función de las plaquetas en el contexto de los bancos de sangre y medicina transfusional. Los esfuerzos de normalización en curso son 9,10,28-30 y la mayoría de estas recomendaciones están incluidas en el protocolo presentado. La reconstitución de la sangre es un modelo paratransfusión, pero el trabajo de validación adicional deberán indicar la relevancia de los resultados clínicos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

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References

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