Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hemostasia requer a atividade combinada e regulado de células, proteínas, íons e tecidos em um contexto espaço-temporal restrito 1. actividade não controlada pode conduzir a hemorragia ou trombose e morbidade ou mortalidade num espectro de distúrbios relacionados com a coagulação do sangue. Um experimento de câmara de fluxo microfluídico é uma técnica desafiadora que imita hemostasia in vitro. Esta abordagem permite a investigação da interação complexa de processos que fazem parte de hemostasia com um papel de liderança para as plaquetas do sangue.

A seguir a lesão vascular, as plaquetas aderem às proteínas de matriz subendotelial exposta (glico) para evitar a perda de sangue. Após a adesão, activação e agregação de plaquetas em resposta a auto- e paracrino sinalização que, finalmente, conduz à formação de uma rede de plaquetas, estabilizado por fibrina e resultando num firme, ferida trombo 2 de vedação. Diferentemente da maioria dos outros testes de função plaquetária, experimentos com câmaras de fluxo tomar em consideração o parâmetro físico do fluxo sanguíneo e, portanto, a influência de reologia nas células que participam biomoléculas e 3,4.

experimentos câmara de fluxo geraram conhecimentos marco na hemostasia e trombose variando parâmetros-chave que influenciam hemostático (sub) processos, incluindo os perfis de matriz adesiva, reologia e fluxo, composição celular, presença de toxinas ou drogas, força iônica e muitos mais. Nas últimas duas décadas, o baixo rendimento experimentos câmara de fluxo que exigem grandes volumes de amostras (10-100 ml) evoluíram para câmaras microfluídicos, muitas vezes consistem em câmaras de placas paralelas pequenas e incluindo a tecnologia moderna para perfusão de sangue total em condições de cisalhamento controladas 5. Microscaling aumentou significativamente ensaio de rendimento principalmente porque a configuração de hardware tem simplificado e menos volume (sangue) é necessário, tornando a experiência mais acessível e Versatile. Por exemplo, o sangue a partir de pequenos animais de laboratório pode agora ser utilizado sem a necessidade de sacrificar os animais. As amostras de sangue de ratos geneticamente modificados têm, portanto, auxiliado na identificação de moléculas-chave promover ou inibir a hemostasia e em novos conhecimentos básicos 6.

Laboratórios de pesquisa especializados, muitas vezes ainda usam câmaras de fluxo personalizado feito por exemplo, de polidimetilsiloxano (PDMS) 7, que polimeriza em moldes litografadas que pode ser blueprinted por software. A câmara resultante é barato e descartável e pode ser facilmente desmontado para análise post hoc. Além disso, basicamente, qualquer construção de embarcações, incluindo bifurcações ou curvas fechadas podem ser construídas no comando. Esta vantagem é também a sua desvantagem desde normalização já era o principal problema com experimentos câmara de fluxo, e PDMS personalizado feito câmaras não têm ajudado isso. No topo desta questão em particular, revestimento (condições), sondas fluorescentes, anticoagulante, temperaturaratura e tempo entre a amostragem e análise são todos mal padronizado 8. Padronização dessas variáveis ​​é um desafio, mas, no entanto, necessário para permitir a comparação de resultados entre laboratórios. Este tópico é o assunto principal da Sociedade Internacional sobre Trombose e Hemostasia na subcomissão Científico e Normalização em Biorheology 9,10.

Os concentrados de plaquetas (PC) são transfundidas em pacientes que sofrem de várias doenças que provocam trombocitopenia e / ou sangramento. Mas plaquetas no PC são conhecidos para dessensibilizar, especialmente em função do tempo de armazenamento 11, um processo de deterioração associada ao envelhecimento e vulgarmente referidos como lesão de armazenagem de plaquetas. Às vezes é alegado que essas plaquetas restaurar em circulação, uma vez transfundido 12, mas as evidências para isso é escasso. Além disso, a funcionalidade de plaquetas que formam um PC não é rotineiramente testadas porque a relação entre tais ensaios eeficácia terapêutica ou profilática não está claro 13. câmaras de fluxo microfluídicos oferecem um meio para investigar a função plaquetária no PC para otimizar a cadeia de manipulações entre a recolha ea emissora. É uma ferramenta de pesquisa poderosa para (pareados) comparações diretas de PC como já anteriormente publicados 14,15 e é descrito aqui.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes éticas institucionais para a pesquisa em amostras humanas e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores envolvidos. Aprovação para as experiências descritas aqui foi obtido do conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Antuérpia.

Nota: as indicações de temperatura são sempre temperatura ambiente, a menos que especificado.

Configuração 1. Preparação Fluxo Câmara

  1. Lanes preparando, Tubing and Pins
    1. Vortex a suspensão de colagénio vigorosamente e diluir 20/01 na solução de glucose isotónica fornecido pelo fornecedor para uma concentração final de 50 ug / ml.
      Nota: Nós usamos colágeno de tendão equino, composta principalmente de tipo fibrilas I. O tipo I de colagénio equino é muitas vezes referida como "Horm" colagénio e é o padrão de ouro para este tipo de ensaio 9, tanto por razões históricas, bem como biológicos. Tipo de colagénio III humano também pode ser utilizado, mas the fibrilas revestimento e menos bem a resposta de plaquetas não é tão forte. Outras superfícies de revestimento também pode ser utilizado, por exemplo Factor de von Willebrand (vWF), fibrinogénio, fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 ou combinações destes 16.
    2. Tome um novo biochip descartável de recipiente do provedor. As dimensões dos biochips utilizados aqui são 0.4W x 0,1H x 20L em mm 3.
    3. Pipeta de 0,8 ul para a pista (s) do biochip microfluídico em uma extremidade do chip e marcar como saída. Certifique-se que a pista está cheia 5 / 6º com o colágeno contendo solução de revestimento preparada no ponto 1.1.1. Certifique-se de que não existem bolhas de ar.
      NOTA: Os canais são parcialmente revestido para evitar a acumulação de fibras de colagénio na entrada do canal (ver discussão).
    4. Incubar a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite num recipiente fechado e humidificada.
    5. Bloquear os canais revestidos por pipetagem de tampão de bloqueio (1,0% (w v) de soro / albumina bovina umd 0,1% (w / v) de glucose em 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) solução salina tamponada (HBS; 0,9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) na outra extremidade e Mark como entrada. Certifique-se de que a faixa está completamente cheia com o tampão de bloqueio evitando bolhas de ar.
    6. Cortar tubos em igual comprimento (12 cm). Use um por pista e se conectar cada tubo com um alfinete. Por exemplo, um experimento comparando duas condições, realizados em duplicado exigirá quatro trechos de tubulação e quatro pinos para ser preparado.
    7. Lavar a tubagem com água destilada, utilizando uma seringa e uma agulha G 26 ou os conectores de acompanhamento.
    8. Saturar o tubo com tampão de bloqueio. Armazenar em um recipiente fechado e humidif içado, durante um mínimo de 1 hora.
  2. Preparando Bomba e Manifold
    1. Lavar a bomba e manifold com água destilada, remover bolhas de ar.
    2. Aspirar o tampão de bloqueio para fora da pista (s) biochip usando a ponta 10 ul fixo na saída. Limpe a superfície doo biochip com um pó de precisão livre limpeza e álcool desnaturado para remover impressões e poeira.
    3. Fixar o biochip em um estágio do microscópio automatizado. Se mais de uma faixa é usada simultaneamente em uma corrida, conectar o divisor colector de oito pistas para a saída biochip.
      Nota: O divisor colector de oito pistas é uma peça de hardware (Figura S1) ligado à bomba e ao biochip. Ele permite a operação de todas as pistas (oito) disponíveis no biochip um ou uma combinação de pistas que podem ser no software que acompanha definidos pelo operador.
    4. Use os pinos na tubulação para corrigi-los na entrada biochip. Colocar a outra extremidade da tubagem (sem pinos) num tubo de ensaio cónico de 1,5 ml cheio com HBS. Lavar todos os tubos e as suas faixas ligadas com 1 ml de HBS de usar a bomba, de modo a remover o restante tampão de bloqueio e fracamente aderente colagénio.

2. Preparação de amostras de sangue

  1. Coleta e separação desangue total fresco de um voluntário saudável. 17
    1. Recolher os primeiros mililitros de sangue em tubos evacuados contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante e exclusivamente utilizar esta amostra para contagem de sangue completo (CBC) com um analisador hematológico automático.
    2. Recolher um volume de sangue de um anticoagulante adequado, utilizando tubos de vácuo. anticoagulantes padrão para experimentos câmara de fluxo são heparina ou hirudina quando fibrina formação não faz parte do protocolo de estudo e citrato de sódio quando é.
      Nota: a heparina foi utilizada como anticoagulante para todas as experiências descritas nos resultados.
      Nota: A quantidade de sangue depende do número de experiências para ser executado. Cerca de um tubo (7 ml) por 3 vias.
    3. Colocar os tubos num rotor pendente reconstituição sangue.
      Nota: O ensaio deve ser concluído no prazo de 3 horas de flebotomia.
    4. Centrifuga-se durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico em plaquetas (PRP). Não use a pausa centrífuga para não perturbar o pellet ligeiramente comprimido.
      1. Quando mais do que um tubo foi recolhida, reunir o sangue num tubo de centrifugação cónico.
        Nota: A centrifugação pode ser feito mais lentamente ou menos longo, dependendo do rendimento de PRP e "contaminação" diferencial de células preferidos.
    5. Retirar e descartar o PRP e creme leucocitário produzindo concentrado de hemácias com poucas plaquetas.
      Nota: A contagem das plaquetas na fracção de glóbulos vermelhos embalados é de 13 ± 5 x 10 3 por ul (média ± DP, n = 12) em média nas nossas mãos.
  2. Reconstituição de sangue
    1. Descongelar grupo sanguíneo AB (Rhesus D negativo) o plasma a 37 ° C durante 5 min e 20 seg por 4 ml.
    2. Determinar o hematócrito dos glóbulos vermelhos empacotados em 2.1.5 preparados usando um analisador hematológico automático.
    3. Determinar a concentração de plaquetas no banco de sangue preparadas plaquetas concentrado thaT vai ser utilizado para reconstituir a fracção de glóbulos vermelhos acima.
    4. Calcule o volume de concentrado de hemácias e concentrado de plaquetas que irão produzir 40% de hematócrito e 250 x 10³ plaquetas / ul em uma amostra de 1 ml.
      Nota: Outros títulos de células alvo pode ser definido arbitrariamente, dependendo do protocolo do estudo.
    5. Transferência embalado células vermelhas do sangue e de plasma para um tubo fresco, utilizando uma ponta de pipeta cortada e adicionar concentrado de plaquetas até um volume de amostra de 1 ml é atingida.
      Nota: Dependendo das variáveis ​​estudadas, a fração de plasma deve ser igual em todas as amostras reconstituídas porque plasma tem uma influência significativa sobre a taxa de formação de trombos. Por exemplo, repetido de congelação-descongelação ou plasma retirado de doadores diferentes ou em diferentes anticoagulantes podem influenciar o resultado.
    6. Misture o sangue reconstituído suavemente por inversão e realizar um CBC.
    7. Prepara-se uma amostra de controlo "em branco", na qual o volume da fracção de plaquetas é substituídopelo mesmo volume de 0,9% (m / v) de cloreto de sódio em água para determinar a concentração de plaquetas endógenas (isto é, não-bancárias de sangue plaquetas) no sangue reconstituído usando um CBC.
  3. Marcação
    1. Pipeta de 1 ml reconstituído sangue num tubo de ensaio contendo 1 ul de 5 mM de calceína AM (5 uM de concentração final).
      Nota: Outros corantes celulares podem ser usados ​​14.
    2. Misture delicadamente por inversão.
    3. Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de usar.

3. Perfusão Assay

  1. Concentre o objectivo de as fibras de colagénio aderiram ao fundo das pistas. O ideal é usar as configurações de contraste de interferência diferencial (DIC) de contraste de fase ou para esta estratégia de focalização. Selecione 'Z atual definido para as regiões telha selecionados' no software experimento para corrigir digitalmente os Z-posições selecionadas.
  2. Seleccionar uma região de interesse (ROI) na pista (XY) no software do experimento microscope que será gravado durante o experimento.
    Nota: O ROI pode ser de qualquer área de superfície escolhido arbitrariamente dentro de uma pista de perfusão. É aconselhável não para analisar a formação de trombos perto da entrada e saída de uma pista de modo a evitar efeitos laterais do perfil de fluxo variável nessa região, mesmo que esta seja relativamente pequena. A área de superfície ROI deve conter um número significativo de plaquetas ou de trombos para permitir o nivelamento do sinal. Neste protocolo do ROI é um agregado digitalmente costurado de três tamanhos iguais imagens lado-a-lado, resultando em 0,62 milímetros 2 no meio da pista de 2 cm de comprimento.
  3. Misturar suavemente as amostras por inversão e posicionar estes junto ao biochip na fase automatizado.
  4. Colocar o tubo que está ligado com a entrada do biochip nos tubos de ensaio contendo as amostras de sangue reconstituído.
  5. Lançar a bomba a 50 dyne / cm 2 (ou outras tensões de cisalhamento como desejado) para esses canais ligados a tubos de ensaiocontendo as amostras de sangue reconstituídos utilizando o software da bomba.
    Nota: Outros tensões de corte pode ser utilizado.
  6. gravar imagens a cada 15 segundos durante 5 minutos em tempo real usando o software de aquisição e experiência do microscópio.
    Nota: Outra série temporal pode ser utilizado, dependendo do set-up experimental.
    Nota: Em geral, utilizar uma ampliação de 100X (objectiva 10X e 10X lentes), mas superior (ou inferior) de ampliação pode ser facilmente utilizado como uma alternativa.

4. Lave Fora

  1. Lavar todos os tubos ligados à tomada e ligado ao colector ou multicanal bomba usando água destilada, seguido de hipoclorito de sódio (lixívia) 0,5% (v / v) e, finalmente, NaOH a 0,1 M em água. Descartar o tubo preso à entrada biochip como resíduos perigosos.

Análise 5. Os dados

  1. Determinar a cinética de crescimento do trombo com o software de análise de imagem. Os comandos a seguir são específicos para ZEN2012. Abra a Análise plugin de imagem para determinar a cobertura da superfície das plaquetas.
  2. Defina o limite de fluorescência na guia Analisar interactivo para definir a intensidade dos pixels que se correlaciona com um sinal positivo, ou seja, uma das plaquetas aderiram ou plaquetas aderentes.
  3. Use Criar tabelas para gerar automaticamente uma planilha que conterá as áreas de superfície separadas (em mm 2) desses "objetos" que contêm pixels com um sinal entre os limiares selecionados. Isto é realizado para cada ponto de tempo.
    Nota: Uma vez que os limiares de fluorescência ter sido escolhido, o software de análise detecta automaticamente 'objetos' no campo de visão que preenchem os critérios. Esses objetos são trombos, pequenos agregados de plaquetas ou plaquetas individuais e abranger uma série de pixels. Cada objeto é listado na planilha separadamente.
  4. Guarde estas planilhas no formato XML e abri-los em um programa de planilhapara outros cálculos.
  5. Total de áreas da superfície dos objectos seleccionados por soma e dividir o resultado pela área total do campo de medição (uM 2). Isto vai produzir a cobertura de superfície relativa (%). Fazê-lo para cada ponto de tempo.
  6. Traçar estas coberturas de superfície em função do tempo de perfusão e calcular a inclinação por regressão linear, obtendo-se a cinética de crescimento de trombos que condição particular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para demonstrar a variação intra-ensaio, três amostras de sangue total reconstituído idênticos foram perfundidos simultaneamente sobre as superfícies de colagénio revestido (Figura 1). Isto resultou em um coeficiente de variação de 8,7%. Esta estatística sugere intra-ensaio aceitável e variação intralaboratorial permitindo comparação fiável entre amostras relacionadas.

A entrada da câmara de fluxo comercial descrevemos aqui é perpendicular à câmara de medição, e isto pode causar um pouco turbulento, em vez de um fluxo laminar naquele ponto. Especialmente nas experiências sem anticoagulação esta pode causar o entupimento devido ao aumento do tempo de contacto entre o sangue e o agonista imobilizada. A entrada entupido pode confundir a leitura a jusante na câmara. Portanto, a configuração foi optimizado por revestimento parcialmente a câmara de fluxo (Figura 2), deixando oentradas desprovidas de agonista de plaquetas, evitando assim a activação prematura de hemostasia primária e secundária. Revestimento parcial das superfícies adesivas é além disso utilizado com sucesso por outros grupos de investigação no campo 16. Além disso, este truque prático simples é um trunfo para estudar a zona de "transição", onde o sangue que flui sobre a superfície não-reativo (não revestido) continua sobre a parte reativa (revestido).

Transfusão foi simulado através da reconstituição de sangue com o componente deficiente. Para este fim, sangue total anticoagulado a partir de um dador saudável foi tornada trombocitopénica por centrifugação e PC plaquetas diferenciais foram adicionados para aumentar as contagens de plaquetas. Uma questão importante aqui foi o número de plaquetas para apontar para? Na maioria dos casos, as transfusões de vida real não resultar na normalização da contagem de plaquetas no paciente trombocitopénica. Em vez de um valor acima de um certo limiar, é voltado para,embora o valor alvo exato é mal definidas 19. Para compreender a influência de diferentes contagens de plaquetas em câmaras de fluxo de microfluidos resultados no contexto da reconstituição sangue, várias reconstituições foram realizadas com concentrações decrescentes de plaquetas (Figura 3). Como esperado, a diminuição da contagem de plaquetas resultou em menor aderência em função do tempo de perfusão. Por conseguinte, dentro de um dado estudo, as contagens de plaquetas deve ser padronizada para permitir uma comparação entre condições de amostra 20. O mero facto de que existe menos aderência quando as contagens de plaquetas são de baixa tem, no entanto não significa que o teste não pode ser utilizado para medir a deposição de plaquetas em amostras trombocitopênicos porque configurações microscopia e da câmara podem ser adaptados para aumentar a sensibilidade. Finalmente, na maioria dos casos, a amostra utilizada para a reconstituição trombocitopénica restante contém plaquetas autólogas que se assemelha à situação na maioria exigindo transfusão de pacientes 19. É Currtemente claro se eo que o papel das plaquetas autólogas é no contexto da transfusão de plaquetas com alogénicos, mas é uma questão interessante para pesquisas futuras.

Após a recolha de sangue a partir de dadores voluntários saudáveis, o sangue total é frequentemente arrefecida para e mantida à temperatura ambiente constante antes da preparação de componentes. As plaquetas são no entanto sensível às mudanças de temperatura. A Figura 4 mostra o efeito de temperaturas diminuíram após a recolha de sangue e durante a perfusão. Os trombos foram encontrados para construir mais lentamente quando o sangue foi arrefecida até à temperatura ambiente (Figura 4A) em comparação com uma amostra idêntica (emparelhado) mantida a 37 ° C durante todo o estudo (Figura 4B).

Na circulação, as plaquetas se ligam a locais de lesão vascular em condições de estresse de cisalhamento elevado. Diferentes taxas de cisalhamento em microfluídicos câmaras de fluxo coated com VWF / fibrinogénio resultou em diferenças de adesão total de plaquetas no ponto final (Figura 5A) e para a cinética de crescimento do trombo (Figura 5B).

Finalmente, para demonstrar como câmaras de fluxo microf luidico pode ser utilizado para investigar PC utilizado para transfusão, a cinética de crescimento do trombo em função de armazenamento de PC foi investigada. Todas as variáveis ​​em preparação de amostras e experimental set-up foram padronizados em todo o período do estudo. Assim, o único parâmetro variável foi PC tempo de armazenagem. A figura 6 indica a diminuir o crescimento do trombo em função do tempo de armazenamento que demonstra o efeito da lesão de armazenagem de plaquetas na hemostasia in vitro.

figura 1
Figura 1:. A variação intra-ensaio em experiências câmara de fluxo de microfluidos Flo Microfluidic experimentos de câmara w foram realizados em colagénio imobilizado em 50 dinas / cm². Todas as três amostras de sangue total reconstituído idênticos foram perfundidos e em paralelo, ao mesmo tempo. Os resultados são mostrados como alcance (bigodes) para cobertura de superfície em função do tempo de perfusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: canal. Parcialmente revestida fibras (A) colagénio visualizadas por microscopia de contraste de fase foram encontradas apenas na região revestida. (B) um instantâneo depois de 5 min de perfusão com uma amostra de sangue total de Calceina AM rotulados reconstituído bombeada a 50 dines / cm 2 é mostrado. Ambas as imagens foram tiradas com uma ampliação de 100X. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: cinética de crescimento do trombo depender de contagem de plaquetas no sangue reconstituído (A) O sangue foi reconstituído a partir de uma plaqueta banco de sangue concentrado obtendo-se diferentes concentrações de plaquetas:. 245 x 10³ / mL (●), 42 x 10³ / l (■) e 12 x 10³ / ul (▲). experimentos câmara de fluxo microfluidico com canais de colagénio revestidas foram realizadas simultaneamente para todas as três amostras a uma tensão de corte de 50 dines / cm. (B) As pistas calculados por regressão linear dos dados brutos em painel A estão representados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

onteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4:. Temperatura e câmaras de fluxo de microfluidos sangue total coletado em vacutainers heparina foi conservada durante 15 min num banho de água à temperatura ambiente (A) ou a 37 ° C (B). Perfusão de microfluidos no colagénio imobilizado a uma tensão de corte de 50 dines / cm 2 foi realizada. Tiros snap no ponto final (5 min de perfusão) são retratados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Papel da tensão de cisalhamento na adesão das plaquetas ao imobilizada VWF / f ibrinogénio (A). Quatro idêntica, calceina AM marcada, reconstituída sangue inteiroAs amostras foram perfundidos sobre uma superfície revestida VWF / fibrinogênio com o estresse variável de corte: 4,5 dinas / cm² (●), 50 dinas / cm² (■), 90 dinas / cm² (▲) e 225 dinas / cm² (♦). Após 3 minutos de perfusão, um snap shot foi tomado de todos os quatro canais. Coberturas (B) de superfície em função do tempo das amostras descritas no (A) são apresentados ilustrando diferenças na cinética de crescimento do trombo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6:. A formação de trombos de concentrados de plaquetas em função do tempo de armazenamento Todas as experiências câmara de fluxo de microfluidos foram realizadas sob condições normalizadas sobre as superfícies revestidas com colagénio a uma taxa de cisalhamento de 50 dines / cm 2. Sangue foi reconstituído com amostras de plaquetas do mesmo concentrado testado em duplicidade, no dia três (●), sete (■) e dez (▲) pós doação. Coberturas de superfície em função do tempo de perfusão são retratados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

S Figura 1

Figura S1:. Microfluidic fluxo câmara de configuração de hardware (A) Um Vena 8 Fluoro + biochip é montado na fase automatizado do microscópio e está ligado através de uma tubagem flexível para uma bomba de seringa com colector para dividir a função de bombeamento em oito canais separados. (B) reconstituída sangue flui através do tubo descartável do lado direito para dentro dos canais seleccionados do biochip (entrada). A tubulação descartável é fixo na entrada através de um stainlaço ess pin descartável fornecida com a configuração. O fluxo de sangue em (B) é da direita para a esquerda e é recolhido em tubos flexíveis longas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Experimentos câmara de fluxo microfluidicos são uma excelente ferramenta para investigar a função das plaquetas no fluxo sanguíneo e são usados ​​para avaliar a hemostasia in vitro em vários contextos experimentais. Apesar de pobre normalização interlaboratory 9, demonstra-se que dentro do nosso laboratório a variação experimental é aceitável. Isto permite comparar de forma confiável amostras (pareados) dentro de um determinado estudo. Este foi validado utilizando o fenômeno bem documentado de lesão de armazenagem de plaquetas, que é uma consequência prejudicial de armazenagem de plaquetas em condições de banco de sangue 11. Além disso, publicou recentemente o impacto de três tecnologias patógeno inativação disponíveis sobre a função PC plaquetas em câmaras de fluxo microfluídicos após a reconstituição de 14,15 sangue.

As plaquetas respondem de forma diferente quando os parâmetros biofísicos e químicas são variados 20. Portanto, a tensão de cisalhamento, número de células e composi celularção, temperatura, revestimento, anticoagulante e muitos outros fatores podem ser modificados dentro deste protocolo, dependendo da pergunta da pesquisa. Este protocolo utiliza apenas ferramentas de hardware e software disponíveis comercialmente, permitindo a outros laboratórios para realizar um ensaio similar. Para fins de pesquisa básica que pode ser uma desvantagem, especialmente porque o hardware disponível é menos versátil do que as configurações feitas à medida. O ensaio in si é robusto mas reprodutibilidade sofre variação biológica e temporal. Portanto, as amostras de ensaio têm de ser emparelhados, tanto quanto possível estudar e tamanhos deve ser suficientemente grande. As amostras também necessita de ser emparelhados com o tempo, porque o sangue apenas reconstituído pode ser armazenado por um curto período de tempo.

Apesar de câmaras de fluxo microfluídicos para estudos de função plaquetária têm impulsionado o campo de pesquisa, o cuidado deve ser tomado para overinterpret a dependência de plaquetas no sangue reologia. Em primeiro lugar, a forma rectangular da câmara de fluxo não é fisiológica, BUt o melhor que temos para permitir óptico com foco no crescimento de trombos. Em segundo lugar, os vasos sanguíneos não são feitos de plástico e a influência da elasticidade dos vasos sanguíneos na função plaquetária não pode, portanto, ser estudada neste protocolo. Em terceiro lugar, o coração faz com que o fluxo pulsátil, enquanto bombas de seringa são mais linear (embora também um pouco pulsátil). Finalmente, tipo I de colagénio fibrilar é o material padrão utilizado para os estudos de plaquetas sob fluxo, que é de origem animal. De notar no entanto, tipo fibrilar I colágeno e resultados clínicos para a função plaquetária correlacionam-se bem em muitos casos, como mostrado por décadas de experiência no (transmissão de luz) agregometria 21,22.

Há muitos ensaios para estudar a função plaquetária 23. A maioria destes endereço de um ou um par de características de plaquetas, enquanto as plaquetas colocando para trabalhar em (modelos de) hemostasia. imagens em tempo real de formação de trombos, como demonstrado aqui, é a mais inclusiva, até à data. Isso significa que a maioria dos aspectos da plaA resposta da Telet a lesão do vaso estão incluídos. vantagens únicas são a inclusão de fluxo sanguíneo e a presença de todas as células sanguíneas. O ensaio é sensível aos fármacos actualmente utilizados para a terapia antiplaquetária 24, bem como a mudanças genéticas resultantes em função das plaquetas aberrante 25. Isto demonstra o seu valor como um indicador relevante da função plaquetária. A natureza abrangente deste ensaio, no entanto, implica também que é menos analítica do que os ensaios que medem características específicas de resposta do plaquetas. Efeitos das manipulações de bancos de sangue em concentrados de plaquetas pode, pois, pegou por ensaios de câmara de fluxo, mas interpretar o que lhes causa, a análise adicional é necessária. Por exemplo, os nossos dados indicam que a temperatura influencia significativamente a adesão de plaquetas em câmaras de fluxo de microfluidos. Mas uma análise detalhada adicional mostrou que as plaquetas refrigerados mudar de forma e de cluster GPIbα receptores 26.

et al. 16 demonstraram a relevância da definição do substrato para plaquetas biologia de sistemas. Além disso, a combinação de diferentes velocidades de cisalhamento em função do substrato é importante porque a ligação de plaquetas ao vWF imobilizado irá requerer altas taxas de cisalhamento, enquanto isso é menos importante para a ligação ao colagénio. Portanto, dependendo da questão de pesquisa, as escolhas podem ser feitas sobre o que substratos e suas respectivas taxas de fluxo devem ser incluídos.

Em conclusão, apresentamos um protocolo para experimentos câmara de fluxo microfluídicos para estudar a função das plaquetas no contexto de bancos de sangue e medicina de transfusão. Os esforços de normalização estão em curso 9,10,28-30 ea maioria destas recomendações estão incluídas no protocolo apresentado. A reconstituição do sangue é um modelo paratransfusão, mas o trabalho de validação adicional deve indicar a relevância para os resultados clínicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
  2. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
  3. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
  4. Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
  5. Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
  6. Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
  7. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. (2013).
  8. Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87, (Suppl 1), S51-S55 (2012).
  9. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
  10. Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
  11. Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
  12. Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
  13. Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
  14. Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
  15. Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. (2015).
  16. de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
  17. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  18. Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7, (Suppl 1), 17-20 (2009).
  19. Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
  20. Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
  21. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
  23. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
  24. Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
  25. Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
  26. Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. (2012).
  27. Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
  28. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  29. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
  30. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics