Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion

Bioengineering

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Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

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Abstract

Introduction

Hémostase exige l'activité combinée et régulée des cellules, des protéines, des ions et des tissus dans un contexte spatiotemporel limité 1. une activité non contrôlée peut conduire à une hémorragie ou d'une thrombose et de la morbidité ou de la mortalité dans un spectre de troubles liés à la coagulation du sang. Une expérience de la chambre d'écoulement microfluidique est une technique difficile qui imite l' hémostase in vitro. Cette approche permet d'étudier l'interaction complexe des processus qui prennent part à l'hémostase avec un rôle de premier plan pour les plaquettes sanguines.

Suite à une lésion vasculaire, les plaquettes adhèrent aux protéines matrice sous-endothéliale exposée (glyco) pour empêcher la perte de sang. À la suite de l' adhérence, les plaquettes d' activer et de l' agrégat en réponse à la signalisation automobile et paracrine qui conduit finalement à la formation d'un réseau de plaquettes stabilisées par la fibrine et résultant en un solide, d'une plaie 2 thrombus d' étanchéité. Contrairement à la plupart des autres tests de la fonction plaquettaire, EXPERIments avec des chambres d'écoulement prennent en compte le paramètre physique de l' écoulement sanguin et par conséquent l'influence de la rhéologie dans les cellules participant biomolécules et 3,4.

expériences en chambre de débit ont généré des idées marquantes de l'hémostase et de la thrombose en faisant varier les paramètres clés qui influencent hémostatique (sub) processus, y compris les profils matrice adhésive, rhéologie et de débit, la composition cellulaire, la présence de toxines ou des médicaments, la force ionique et beaucoup plus. Au cours des deux dernières décennies, à faible débit des expériences en chambre d'écoulement nécessitant des volumes d'échantillons de grande taille (10-100 ml) ont évolué vers des chambres microfluidiques souvent constituées de petites chambres à plaques parallèles et dont la technologie moderne pour perfuser le sang total dans des conditions mur de cisaillement contrôlées 5. Microscaling a augmenté de façon significative le débit dosage surtout parce que la configuration matérielle a simplifié et moins (sang) volume est nécessaire, ce qui rend l'expérience Versati plus accessible etle. Par exemple, le sang de petits animaux de laboratoire peut maintenant être utilisé sans qu'il soit nécessaire de sacrifier les animaux. Des échantillons de sang de souris génétiquement modifiées ont ainsi contribué à l'identification de molécules clés favorisant ou inhibant l' hémostase et de nouvelles idées de base 6.

Les laboratoires de recherche spécialisés souvent utilisent encore sur mesure chambres d'écoulement , par exemple de polydiméthylsiloxane (PDMS) 7 qui polymérise sur des moules lithographiées qui peuvent être blueprinted par le logiciel. La chambre résultant est peu coûteux, jetable et peut être facilement démonté pour analyse post-hoc. En outre, essentiellement toute la conception des navires, y compris les bifurcations ou des virages serrés peut être construit sur commande. Cet avantage est aussi son inconvénient puisque la normalisation était déjà le principal problème avec les expériences de la chambre d'écoulement et PDMS sur mesure chambres n'ont pas aidé cela. En plus de cette question particulière, le revêtement (conditions), des sondes fluorescentes, anticoagulant, templit- et le temps entre le prélèvement et l' analyse sont tous mal standardisés 8. La normalisation de ces variables est difficile, mais néanmoins nécessaire pour permettre la comparaison des résultats entre les laboratoires. Ce sujet est le principal objet de la Société internationale de thrombose et d' hémostase au sous-comité scientifique et de la normalisation sur Biorheology 9,10.

Les concentrés plaquettaires (PC) sont transfusées chez les patients souffrant de diverses maladies qui causent la thrombocytopénie et / ou des saignements. Mais les plaquettes dans le PC sont connus pour désensibiliser, en particulier en fonction du temps de stockage 11, un processus de dégradation liée au vieillissement et communément appelée lésion de stockage des plaquettes. On prétend parfois que ces plaquettes restaurer en circulation une fois transfusé 12, mais la preuve de ceci est rare. En outre, la fonctionnalité des plaquettes constituant un PC ne sont pas systématiquement testé car la relation entre ces essais etl' efficacité thérapeutique ou prophylactique ne sait pas 13. chambres d'écoulement microfluidiques offrent un moyen d'enquêter sur la fonction plaquettaire dans le PC pour optimiser la chaîne de manipulations entre la collecte et la délivrance. Il est un puissant outil de recherche pour (appariés) des comparaisons directes de PC comme nous l' avons déjà publiés 14,15 et est décrite ici.

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Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices éthiques institutionnelles pour la recherche sur des échantillons humains et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les bailleurs de fonds impliqués. Approbation pour les expériences décrites ici a été obtenu à partir de la commission d'examen institutionnel de l'Hôpital universitaire d'Anvers.

Nota: Les indications de température sont toujours la température ambiante, sauf indication contraire.

Installation 1. Préparation Chambre de débit

  1. Lanes Préparation, tubages et Pins
    1. Vortexer la suspension de collagène vigoureusement et on dilue au 1/20 dans la solution de glucose isotonique fourni par le fournisseur à une concentration finale de 50 pg / ml.
      Note: Nous utilisons le collagène de tendon équin, principalement composé de type fibrilles I. Le type de collagène équin I est souvent désigné comme "Horm" collagène et est la norme d' or pour ce type de dosage 9 pour des raisons historiques, ainsi que biologiques. humain de type III, le collagène peut aussi être utilisé, mais the fibrilles manteau moins bien et la réponse plaquettaire est pas aussi forte. D' autres surfaces de revêtement peuvent également être utilisés, par exemple , facteur de von Willebrand (VWF), le fibrinogène, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, la thrombospondine-1 , ou des combinaisons de ceux - ci 16.
    2. Prenez une nouvelle biopuce jetable du conteneur du fournisseur. Les dimensions des biopuces sont utilisées ici 0.4W x 0,1 H x 20L mm 3.
    3. Pipet 0,8 ul dans la voie (s) de la biopuce microfluidique sur une extrémité de la puce et marquer comme sortie. Assurez-vous que la voie est rempli 5/6 avec le collagène contenant une solution de revêtement préparée en 1.1.1. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air.
      Remarque: Les canaux sont partiellement recouverts pour éviter l'accumulation de fibres de collagène à l'entrée du canal (voir la discussion).
    4. Incuber à 4 ° C pendant 4 heures ou pendant une nuit dans un récipient fermé et humidifiée.
    5. Bloquer les canaux revêtus par pipetage du tampon de blocage (1,0% (p v) de sérum / albumine bovine à unej 0,1% (p / v) de glucose à 10 mM, 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), une solution saline tamponnée (HBS, 0,9% (p / v) de NaCl, pH 7,4) à l'autre extrémité et une marque comme entrée. Assurez-vous que la voie est complètement rempli avec le tampon de blocage évitant les bulles d'air.
    6. Couper un tube à longueur égale (12 cm). Utilisez un par voie et connecter chaque tube avec une épingle. Par exemple, une expérience comparant deux conditions, courir en double exemplaire, il faudra quatre tronçons de tubes et quatre broches à préparer.
    7. Rincer le tube avec de l'eau distillée en utilisant une seringue et une aiguille 26 G, ou les connecteurs annexés.
    8. Saturer le tube avec un tampon de blocage. Conserver dans un récipient fermé et humidifié pour un minimum de 1 heure.
  2. Préparation de la pompe et de collecteur
    1. Rincer la pompe et le collecteur avec de l'eau distillée, éliminer les bulles d'air.
    2. Aspirer le tampon de blocage de la voie (s) de biopuce en utilisant la pointe de 10 pi fixe à la sortie. Nettoyer la surface dela biopuce avec une poussière de précision sans essuyage et l'alcool dénaturé pour éliminer les empreintes et la poussière.
    3. Fixer la biopuce sur une platine de microscope automatisé. Si plus d'une voie est utilisée simultanément en une seule opération, connectez le à huit voies répartiteur collecteur à la sortie de biopuce.
      Note: Les huit voies collecteur répartiteur est un morceau de matériel (figure S1) relié à la pompe et la biopuce. Il permet le fonctionnement de tous les (huit) des voies disponibles sur une biopuce ou une combinaison de voies de circulation, qui peuvent être définis par l'opérateur dans le logiciel qui l'accompagne.
    4. Utilisez les broches dans le tube pour les fixer dans l'entrée de biopuce. Placer l'autre extrémité du tube (sans broche) dans un tube à essai conique de 1,5 ml rempli avec du HBS. Rincer tous les tuyaux et leurs voies connectés avec 1 ml HBS en utilisant la pompe, de façon à éliminer reste du tampon de blocage et mal adhérer collagène.

2. Préparation des échantillons de sang

  1. Collecte et séparation desensemble du sang frais à partir d' un volontaire sain. 17
    1. Recueillir les premiers millilitres de sang dans un tube sous vide contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) comme anticoagulant et utiliser exclusivement cet échantillon pour numération globulaire complète (CBC) avec un analyseur d'hématologie automatisé.
    2. Collecter un volume de sang dans un anticoagulant approprié en utilisant des tubes sous vide. Anticoagulants standard pour les expériences de la chambre d'écoulement sont l'héparine ou l'hirudine lorsque la fibrine formation ne fait pas partie du protocole d'étude et de citrate de sodium quand il est.
      Remarque: L'héparine a été utilisée comme anticoagulant pour toutes les expériences décrites dans les résultats.
      Note: La quantité de sang est fonction du nombre d'essais à effectuer. Environ 1 tube (7 ml) à 3 voies.
    3. Placer les tubes sur un rotateur en attendant la reconstitution du sang.
      Remarque: Le test doit être terminé à moins de 3 h de saignées.
    4. Centrifuger pendant 15 min à 250 g pour préparer plasma riche en plaquettes (PRP). Ne pas utiliser la pause de centrifugation pour éviter de perturber le culot légèrement tassées.
      1. Lorsque plus d'un tube a été recueilli, en commun le sang dans un seul tube de centrifugation conique.
        Remarque: La centrifugation peut être effectuée plus lentement ou moins long terme, en fonction du rendement du PRP et différentiel cellule "contamination" préférée.
    5. Retirer et jeter le PRP et le manteau buffy rendement des cellules de globules rouges avec quelques plaquettes.
      Remarque: Le nombre de plaquettes dans la fraction de globules rouges est de 13 ± 5 x 10 3 par pi (moyenne ± écart type, n = 12) en moyenne dans nos mains.
  2. Reconstitution du sang
    1. groupe sanguin AB Thaw (Rhésus D négatif) du plasma à 37 ° C pendant 5 min et 20 sec par 4 ml.
    2. Déterminer le taux d'hématocrite des globules rouges concentrés préparés 2.1.5 en utilisant un analyseur hématologique automatisé.
    3. Déterminer la concentration en plaquettes dans la banque de sang préparé concentré plaquettaire that sera utilisé pour reconstituer la fraction de globules rouges ci-dessus.
    4. Calculer le volume de globules rouges concentrés et un concentré de plaquettes qui produiront 40% d'hématocrite et 250 x 10 ^ plaquettes / ul dans un échantillon de 1 ml.
      Note: D'autres titres cibles des cellules peuvent être fixés de façon arbitraire, en fonction du protocole d'étude.
    5. Transfert concentré de globules rouges et le plasma dans un nouveau tube à l'aide d'une pointe de pipette écrêté et ajouter le concentré de plaquettes jusqu'à un volume de 1 ml d'échantillon est atteinte.
      Remarque: En fonction des variables étudiées, la fraction de plasma doit être égale dans tous les échantillons reconstitués, car le plasma a une influence significative sur le taux de formation de thrombus. Par exemple, répétée congélation-décongélation ou de plasma provenant de donneurs différents ou sur différents anticoagulants peuvent influencer le résultat.
    6. Mélanger le sang reconstitué doucement en inversant et effectuer une CBC.
    7. Préparer un "blanc" échantillon de contrôle dans lequel le volume de la fraction plaquettaire est remplacépar le même volume de 0,9% (m / v) de chlorure de sodium dans de l' eau pour déterminer la concentration de plaquettes endogènes ( à savoir les plaquettes sanguines non bancaires) dans le sang reconstitué à l' aide d' une SRC.
  3. étiquetage
    1. Pipeter 1 ml de sang reconstituées dans un tube à essai contenant 1 ul de 5 mM calcéine AM (5 uM de concentration finale).
      Note: D' autres colorants cellulaires peuvent être utilisés 14.
    2. Mélanger doucement en inversant.
    3. Incuber pendant 5 min à 37 ° C avant utilisation.

3. Perfusion Assay

  1. Concentrez l'objectif sur les fibres de collagène collées au fond des ruelles. Idéalement, utilisez contraste de phase ou de réglages contraste interférentiel différentiel (DIC) pour cette stratégie de focalisation. Sélectionnez 'Z Set actuel pour les régions de tuiles sélectionnées »dans le logiciel d'expérimentation pour résoudre numériquement les Z-positions sélectionnées.
  2. Sélectionner une région d'intérêt (ROI) dans la voie (xy) dans le logiciel d'expérimentation des microscope qui sera enregistrée au cours de l'expérience.
    Remarque: Le retour sur investissement peut être une zone de surface choisie arbitrairement dans une voie de perfusion. Il est conseillé de ne pas analyser la formation de thrombus à proximité de l'entrée et la sortie d'une voie afin d'éviter les effets secondaires du profil d'écoulement variable dans cette région, même si cela est relativement faible. La surface spécifique du ROI doit contenir un nombre de plaquettes ou de thrombus pour permettre le nivellement du signal. Dans ce protocole , le retour sur investissement est un agrégat numériquement cousu de trois images côte à côte de taille égale entraînant 0,62 mm 2 dans le milieu de la 2 cm de long couloir.
  3. Mélanger les échantillons doucement en inversant et positionner ceux-ci à côté de la biopuce sur la scène automatisée.
  4. Placer le tuyau qui est relié à l'entrée de la biopuce dans les tubes à essai contenant des échantillons de sang reconstituées.
  5. Lancez la pompe à 50 dyne / cm 2 (ou d' autres contraintes de cisaillement comme souhaité) pour les canaux liés tubes à essaicontenant les échantillons de sang reconstituées à l'aide du logiciel de la pompe.
    Remarque: Les autres contraintes de cisaillement peuvent être utilisés.
  6. Enregistrement des images toutes les 15 sec pendant 5 min en temps réel en utilisant le logiciel d'acquisition et de l'expérience du microscope.
    Remarque: D'autres séries de temps peut être utilisé en fonction de la configuration expérimentale.
    Note: Nous utilisons généralement un grossissement 100X (objectif 10X et 10X lentilles), mais supérieur (ou inférieur) grossissement peut facilement être utilisé comme une alternative.

4. Laver Out

  1. Laver tous les tubes fixé à la sortie et raccordée au collecteur à canaux multiples ou à la pompe à l'aide d'eau distillée, suivi d'hypochlorite de sodium (eau de Javel) 0,5% (v / v) et enfin 0,1 M de NaOH dans l'eau. Jeter le tube épinglé à l'entrée de la biopuce comme des déchets dangereux.

Analyse 5. Données

  1. Déterminer la cinétique de croissance du thrombus avec le logiciel d'analyse d'images. Les commandes suivantes sont spécifiques pour ZEN2012. Ouvrez l'analyse plugin image pour déterminer la couverture de surface des plaquettes.
  2. Régler le seuil de fluorescence dans l'onglet Analyser Interactive pour définir l'intensité de pixel qui est en corrélation avec un signal positif, à savoir une plaquette collée ou de plaquettes adhérentes.
  3. Utilisez Créer des tables pour générer automatiquement une feuille de calcul qui contiendra les zones de surface séparées (en pm 2) de ces "objets" contenant des pixels avec un signal entre les seuils sélectionnés. Cette opération est effectuée pour chaque point de temps.
    Remarque: Une fois les seuils de fluorescence ont été choisi, le logiciel d'analyse détecte automatiquement des «objets» dans le champ de vision qui remplissent les critères. Ces objets sont thrombus, les petits agrégats de plaquettes ou de plaquettes individuelles et couvrent un certain nombre de pixels. Chaque objet est répertorié dans la feuille de calcul séparément.
  4. Conservez ces feuilles de calcul au format XML et les ouvrir dans un programme de feuille de calculpour d'autres calculs.
  5. Nombre de zones de la surface des objets sélectionnés par sommation et diviser le résultat par la superficie totale du champ de mesure (pm 2). Cela donnera la couverture de surface relative (%). Faites-le pour chaque point de temps.
  6. Tracer ces couvertures de surface en fonction du temps de perfusion et de calculer la pente de la régression linéaire, ce qui donne la cinétique de cette condition particulière de croissance du thrombus.

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Representative Results

Pour démontrer la variation intra-essai, trois échantillons de sang identiques reconstitués entiers ont été perfusés simultanément sur ​​collagène surfaces revêtues (figure 1). Il en est résulté un coefficient de variation de 8,7%. Cette statistique suggère intra-dosage acceptable et variation intralaboratoire permettant la comparaison fiable entre les échantillons liés.

L'entrée de la chambre d'écoulement commercial, nous décrivons ici est perpendiculaire à la chambre de mesure et cela peut provoquer un peu turbulent au lieu d'un écoulement laminaire à ce point. En particulier dans des expériences sans anticoagulation cela peut provoquer l'encrassement en raison du temps de contact accru entre le sang et l'agoniste immobilisé. L'entrée obstrué peut confondre l'affichage en aval dans la chambre. Par conséquent, l'installation a été optimisé par le revêtement partiellement la chambre d'écoulement (figure 2) quittant leentrées dépourvues d'agoniste plaquettaire, évitant ainsi l'activation prématurée de l'hémostase primaire et secondaire. Revêtement partiel de surfaces adhésives est par ailleurs utilisé avec succès par d' autres groupes de recherche dans le domaine 16. De plus, cette astuce pratique simple est un atout pour étudier la zone "de transition" où le sang coule sur la surface non-réactive (non couché) continue sur (couché) partie réactive.

Transfusion a été simulée en reconstituant le sang avec le composant déficient. A cet effet, anticoagulé sang total d'un donneur sain a été rendu thrombocytopénique par centrifugation et PC plaquettes différentiels ont été ajoutés pour augmenter le nombre de plaquettes. Une question importante ici est ce que le nombre de plaquettes à viser? Dans la plupart des cas, les transfusions réelles ne conduisent pas à la normalisation de la numération plaquettaire chez le patient thrombocytopénique. Plutôt une valeur supérieure à un certain seuil est destiné pour,bien que la valeur cible exacte est mal définie 19. Pour comprendre l'influence de la variation de la numération plaquettaire sur les chambres d'écoulement microfluidique résultats obtenus dans le cadre de la reconstitution dans le sang, plusieurs reconstitutions ont été effectuées avec des concentrations décroissantes de plaquettes (figure 3). Comme prévu, les numérations plaquettaires inférieures ont conduit à moins d'adhérence en fonction du temps de perfusion. Par conséquent, dans une étude donnée, la numération plaquettaire doivent être normalisées pour permettre une comparaison entre les conditions d'échantillonnage 20. Le simple fait qu'il y ait moins d'adhérence lorsque la numération plaquettaire est faible ne signifie cependant que le test ne peut pas être utilisé pour mesurer le dépôt de plaquettes dans des échantillons thrombocytopénie parce que les paramètres de microscopie et de la caméra peuvent être adaptés pour augmenter la sensibilité. Enfin, dans la plupart des cas, l'échantillon thrombocytopénique utilisé pour la reconstitution contient restantes plaquettes autologues qui ressemble à la situation dans la plupart transfusion exigeant des patients 19. Il est Currremment pas clair si et quel est le rôle des plaquettes autologues est dans le contexte de la transfusion de plaquettes allogéniques, mais est une question intéressante pour la recherche future.

Après la collecte de sang de donneurs volontaires en bonne santé, le sang total est souvent refroidi et maintenu à température ambiante constante avant la préparation du composant. Les plaquettes sont cependant sensibles aux variations de température. La figure 4 montre l'effet de diminution après le prélèvement de sang et pendant la perfusion de températures. Thrombus n'a été trouvée pour construire plus lentement quand le sang a été refroidi à la température ambiante (figure 4A) par rapport à une (paire) identique échantillon maintenu à 37 ° C tout au long de l'étude (figure 4B).

Dans la circulation, les plaquettes se lient aux sites de lésions des vaisseaux dans des conditions d'élévation contrainte pariétale. Différents taux de cisaillement dans microfluidiques chambres d'écoulement coated avec VWF / fibrinogène a entraîné des différences pour l' adhésion des plaquettes totale au point final (figure 5A) et la cinétique de croissance de thrombus (figure 5B).

Enfin, pour démontrer comment microfluidique chambres flux peut être utilisé pour enquêter sur PC utilisé pour les transfusions, la cinétique de croissance de thrombus en fonction de stockage de PC a été étudiée. Toutes les variables dans la préparation de l'échantillon et expérimental ont été normalisés pendant toute la période d'étude. Par conséquent, le seul paramètre variable est PC stockage du temps. La figure 6 indique la baisse la croissance du thrombus en fonction du temps de stockage démontrant l'effet d' une lésion de stockage des plaquettes sur l' hémostase in vitro.

Figure 1
Figure 1:. Variation intra-essai dans microfluidiques expériences en chambre d'écoulement flo microfluidique expériences en chambre w ont été réalisées sur le collagène immobilisé à 50 dynes / cm². Les trois échantillons de sang entiers identiques reconstitués ont été perfuses en parallèle et en même temps. Les résultats sont présentés en tant que gamme (moustaches) pour une couverture de surface en fonction du temps de perfusion. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: canal partiellement revêtu. (A) Les fibres de collagène visualisées par microscopie à contraste de phase n'a été trouvée que dans la zone revêtue. (B) Un instantané après 5 min de perfusion avec un échantillon de sang entier calcéine AM étiqueté reconstitué pompé à 50 dynes / cm 2 est représenté. Les deux images ont été prises à un grossissement de 100X. ig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: cinétique de croissance thrombus dépendent du nombre de plaquettes dans le sang reconstitué (A) Le sang a été reconstitué à l' aide d' une plaquette de banque de sang concentré donnant différentes concentrations de plaquettes:. 245 x 10³ / pl (●), 42 x 10³ / pi (■) et 12 x 10³ / ul (▲). expériences en chambre d'écoulement microfluidique avec chaînes revêtues de collagène ont été effectuées simultanément pour les trois échantillons à une contrainte de cisaillement de 50 dynes / cm². (B) Les pentes calculées par régression linéaire des données brutes dans le panneau A sont représentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ontenu "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 4
Figure 4:. Température et chambres d'écoulement microfluidiques sang total recueilli dans vacutainers d'héparine a été conservé pendant 15 min dans un bain d'eau à température ambiante (A) ou à 37 ° C (B). Perfusion microfluidique sur le collagène immobilisé à une contrainte de cisaillement de 50 dynes / cm 2 a été effectué. SNAP SHOTS au point final (5 min de perfusion) sont représentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Rôle de la contrainte de cisaillement sur ​​l' adhésion plaquettaire immobilisée VWF / fibrinogène (A). Quatre identiques, calcéine AM étiqueté, reconstitué sang totalles échantillons ont été perfusés sur une surface revêtue VWF / fibrinogène avec cisaillement variable de contrainte: 4,5 dynes / cm² (●), 50 dynes / cm² (■), 90 dynes / cm² (▲) et 225 dynes / cm² (♦). Après 3 minutes de perfusion, un coup de pression a été prise de tous les quatre canaux. Couvertures (B) de surface en fonction du temps des échantillons décrits dans (A) sont présentés illustrant les différences de cinétique de croissance du thrombus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6:. La formation de thrombus dans des concentrés de plaquettes en fonction du temps de stockage Toutes les expériences de la chambre d'écoulement microfluidique ont été réalisées dans des conditions normalisées sur les surfaces revêtues de collagène à un taux de 50 dynes / cm 2 au cisaillement. Le sang était reconstituted avec des échantillons de plaquettes du même concentré testé en double sur trois jours (●), sept (■) et dix (▲) après le don. Couvertures de surface en fonction du temps de perfusion sont représentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

S Figure 1

Figure S1:. La configuration matérielle de la chambre d'écoulement microfluidique (A) Veine 8 fluoroscopie + biopuce est monté sur l'étage automatisé du microscope et il est relié par l' intermédiaire d'un tube flexible à une pompe à seringue avec le collecteur pour séparer la fonction de pompage en huit canaux séparés. (B) le sang Reconstitué circule à travers le tube jetable sur le côté droit dans les canaux sélectionnés de la biopuce (entrée). La tubulure à usage unique est fixé dans l'orifice d'entrée à travers une stainlacier ess broche jetable fourni avec la configuration. Le flux sanguin dans (B) est de droite à gauche et est recueilli dans de longs tuyaux flexibles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Microfluidiques expériences en chambre d'écoulement sont un excellent outil pour étudier la fonction plaquettaire dans le sang circulant et sont utilisés pour évaluer l' hémostase in vitro dans des contextes expérimentaux. Malgré une mauvaise standardisation interlaboratoires 9, nous démontrons que , dans notre laboratoire , la variation expérimentale est acceptable. Ceci permet de comparer de manière fiable des échantillons (appariés) dans une étude donnée. Ceci a été validé en utilisant le phénomène bien documenté de la lésion de stockage des plaquettes, ce qui est une conséquence néfaste de stockage des plaquettes dans des conditions de banque de sang 11. En outre, nous avons récemment publié l'impact de trois technologies disponibles d'inactivation des pathogènes sur la fonction PC plaquettaire dans des chambres d'écoulement microfluidiques après reconstitution de 14,15 de sang.

Les plaquettes répondent différemment lorsque les paramètres biophysiques et -CHIMIQ sont variés 20. Par conséquent, la contrainte de cisaillement, nombre de cellules et composi cellulairetion, la température, le revêtement, anticoagulant et bien d'autres facteurs peuvent être modifiés dans ce protocole en fonction de la question de recherche. Ce protocole utilise uniquement des outils matériels et logiciels disponibles dans le commerce, permettant à d'autres laboratoires pour effectuer un test similaire. Aux fins de la recherche fondamentale, cela peut être un inconvénient en particulier parce que le matériel disponible est moins polyvalent que les configurations sur mesure. Le test en lui-même est robuste, mais la reproductibilité souffre de la variation biologique et temporelle. Par conséquent, les échantillons d'essai doivent être jumelés autant que possible et d'étudier la taille doit être suffisamment grande. Les échantillons doivent également être jumelé dans le temps, parce que le sang reconstitué ne peut être stocké pendant une courte période.

Bien que les chambres d'écoulement microfluidiques pour les études de la fonction plaquettaire ont stimulé le domaine de la recherche, la prudence devrait être prise à surinterpréter la dépendance des plaquettes sur la rhéologie du sang. Tout d'abord, la forme rectangulaire de la chambre d'écoulement est pas physiologique, but le meilleur que nous avons pour permettre optique de focalisation sur les thrombus de plus en plus. Deuxièmement, les vaisseaux sanguins ne sont pas faits de plastique et l'influence de l'élasticité des vaisseaux sanguins sur la fonction plaquettaire peut donc pas être étudiés dans ce protocole. Troisièmement, le coeur provoque un flux pulsatile, tandis que les pompes à seringues sont plus linéaires (bien aussi légèrement pulsatile). Enfin, le type de collagène fibrillaire est le matériau standard utilisé pour les études de plaquettes sous flux, qui est d'origine animale. Il convient de noter cependant, le type fibrillaire du collagène et des résultats cliniques pour la fonction plaquettaire corréler bien dans de nombreux cas , comme le montre par des décennies d'expérience dans (transmission de la lumière) agrégométrie 21,22.

Il existe de nombreux essais pour étudier la fonction plaquettaire 23. La plupart de ces adresse une ou deux caractéristiques de plaquettes en plaquettes mettant à travailler dans (modèles de) hémostase. imagerie en temps réel de la formation de thrombus comme démontré ici est la plus inclusive, à ce jour. Cela signifie la plupart des aspects de la plaLa réponse de telet à la lésion du vaisseau sont inclus. Des avantages uniques sont l'inclusion de la circulation sanguine, et la présence de toutes les cellules sanguines. L'essai est sensible aux médicaments actuellement utilisés pour la thérapie antiplaquettaire 24 ainsi que des modifications génétiques résultant de la fonction plaquettaire anormale 25. Cela démontre sa valeur comme un indicateur pertinent de la fonction plaquettaire. La nature globale de ce test implique néanmoins aussi qu'il est moins analytique que ces tests de mesure des caractéristiques spécifiques de la réponse de la plaquette. Effets des manipulations de banques de sang sur les concentrés de plaquettes peuvent donc, en ramassé par des analyses de la chambre d'écoulement, mais d'interpréter ce qui les provoque, une analyse supplémentaire est nécessaire. Par exemple, nos données indiquent que la température influe de manière significative l'adhésion plaquettaire dans des chambres d'écoulement microfluidique. Mais une analyse supplémentaire détaillée a montré que les plaquettes réfrigérées changent de forme et de grappe GPIba récepteurs 26.

et al. , 16 a démontré la pertinence de la définition du substrat pour la biologie des systèmes plaquettaires. En outre, la combinaison de la variation des taux de cisaillement en fonction du substrat est importante car la liaison des plaquettes au facteur Willebrand immobilisé nécessitera des vitesses de cisaillement élevées, bien que cela soit moins important pour la liaison au collagène. Par conséquent, en fonction de la question de recherche, les choix peuvent être faits sur ce que les substrats et leurs débits respectifs doivent être inclus.

En conclusion, nous présentons un protocole pour microfluidiques expériences en chambre d'écoulement pour étudier la fonction plaquettaire dans le contexte des banques de sang et de la médecine transfusionnelle. Les efforts de normalisation sont en cours 9,10,28-30 et la plupart de ces recommandations sont incluses dans le protocole présenté. La reconstitution du sang est un modèle pourtransfusion mais le travail de validation supplémentaire devraient indiquer la pertinence des résultats cliniques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

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References

  1. Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
  2. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
  3. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
  4. Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
  5. Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
  6. Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
  7. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. (2013).
  8. Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87, (Suppl 1), S51-S55 (2012).
  9. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
  10. Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
  11. Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
  12. Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
  13. Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
  14. Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
  15. Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. (2015).
  16. de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
  17. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  18. Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7, (Suppl 1), 17-20 (2009).
  19. Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
  20. Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
  21. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
  23. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
  24. Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
  25. Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
  26. Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. (2012).
  27. Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
  28. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  29. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
  30. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).

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