परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मस्तिष्क polysomes पर peering

Neuroscience

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Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

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Abstract

Translational मशीनरी, यानी, polysome या polyribosome, कोशिकाओं में सबसे बड़ा और सबसे जटिल cytoplasmic मशीनरी में से एक है। Polysomes, राइबोसोम, mRNAs, कई प्रोटीन और गैर-कोडिंग RNAs द्वारा गठित एकीकृत प्लेटफॉर्म जहां translational नियंत्रण जगह ले प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, जबकि राइबोसोम व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, polysomes के संगठन अभी भी व्यापक समझ की कमी है। इस प्रकार बहुत प्रयास के क्रम में polysome संगठन और translational नियंत्रण के किसी भी उपन्यास तंत्र है कि एम्बेडेड हो सकता है स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी का एक प्रकार है कि nanoscale संकल्प पर 3 डी छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तकनीक की तुलना में, AFM के मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह दोनों हवा में और समाधान में छवियों के हजारों प्राप्त कर सकते हैं नमूना सक्षम धुंधला हो जाना और समर्थक फिक्सिंग के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना पास शारीरिक शर्तों के तहत बनाए रखा जानाcedures। इधर, माउस मस्तिष्क और अभ्रक substrates पर अपने बयान से polysomes की सटीक शुद्धि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित है। इस प्रोटोकॉल AFM और तीन आयामी वस्तुओं के रूप में उनके पुनर्निर्माण के साथ हवा और तरल में polysome इमेजिंग सक्षम बनाता है। क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) के लिए पूरक, प्रस्तावित विधि आसानी से व्यवस्थित polysomes का विश्लेषण करने और उनके संगठन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

प्रोटीन के संश्लेषण कोशिकाओं 1,2 में सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया है। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि प्रोटीन प्रचुरता मुख्य रूप से translational बजाय ट्रांसक्रिप्शनल स्तर 3,4,5 पर नियंत्रित किया जाता है। polysome मौलिक macromolecular घटक है कि कार्यात्मक प्रोटीन readouts में mRNA जानकारी धर्मान्तरित है। Polysomes इस प्रकार अब तक macromolecular परिसर जहां कई translational नियंत्रण एकाग्र 6-13 के रूप में पहचाने जाते हैं। राइबोसोम की संरचना 14- 16 पर अध्ययन के सैकड़ों के बावजूद, अनुवाद की गतिशीलता में विस्तृत आणविक अंतर्दृष्टि और polysomes के टोपोलॉजी एक सीमित ब्याज सामना करना पड़ा है। एक परिणाम के रूप में, देशी polysomal ribonucleoprotein परिसर के संगठन और अनुवाद पर इसके संभावित प्रभाव अभी भी बल्कि अस्पष्ट मुद्दे हैं। Polysomes अभी भी अज्ञात आदेश दिया और कार्यात्मक संगठनों छिपा सकते हैं, संभवतः क्या nucleosomes और epigenetic विवाद mirroringरास प्रतिलेखन क्षेत्र के लिए प्रतिनिधित्व किया है। दरअसल, इस साज़िश परिकल्पना की जांच अतिरिक्त अध्ययन और नई तकनीकी दृष्टिकोण की आवश्यकता है। इस लाइन में, संरचनात्मक तकनीक और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी लाभकारी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने, वैसे ही क्या nucleosome 17,18 के लिए हासिल किया गया था करने के लिए नए तंत्र को खंडित करने के लिए सहयोग कर सकते हैं।

राइबोसोम 14-16 की खोज के बाद से, इसकी संरचना बड़े पैमाने पर प्रोकैर्योट 19,20, खमीर 21 और मानव 22 में और अधिक हाल ही में बताया गया है, प्रोटीन संश्लेषण के आधार पर तंत्र की आणविक विवरण प्रदान करते हैं। Polysomes शुरू में जालिका की झिल्ली पर मान्यता प्राप्त किया गया है, ठेठ 2 डी ज्यामितीय संगठनों 14 के गठन। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, polysome विधानसभा राइबोसोम की संरचना के रूप में निरंतर ब्याज की वस्तु नहीं किया गया है। अतीत में, polysomes टीआर द्वारा अनिवार्य रूप से अध्ययन किया गया हैansmission ईएम आधारित तकनीक। हाल ही में, क्रायो ईएम तकनीक इन विट्रो अनुवाद प्रणालियों 23-26 से शुद्ध polysomes के 3D पुनर्निर्माण, मानव सेलुलर lysates 27 या कोशिकाओं 28 में सक्षम होना चाहिए। इन तकनीकों में polysomes 23, 26-28 और गेहूं के बीज polysomes 24 में आसन्न राइबोसोम के संपर्क सतहों की एक प्रारंभिक आणविक विवरण में राइबोसोम-राइबोसोम संगठन के बारे में और अधिक परिष्कृत जानकारी की पेशकश की। इस प्रकार, क्रायो ईएम टोमोग्राफी आणविक विस्तार के साथ राइबोसोम-राइबोसोम बातचीत का खुलासा करने की अनुमति देता है, लेकिन यह व्यापक बाद के प्रसंस्करण के बोझ से दबे है और पुनर्निर्माण का विश्लेषण करती डेटा से निपटने के लिए भारी कम्प्यूटेशनल संसाधनों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, राइबोसोम-राइबोसोम बातचीत की आणविक विस्तार प्राप्त करने के लिए, राइबोसोम की एक उच्च संकल्प लिया नक्शा आवश्यक है, और संदर्भ राइबोसोम के इस तरह के केवल कुछ प्रजातियों के लिए उपलब्ध है। महत्वपूर्ण बात है, क्रायो ईएम टोमोग्राफी मुक्त आरएनए का पता लगाने में सक्षम नहीं है। Therefअयस्क, नई तकनीक पूरी तरह से अनुवाद मशीनरी के संगठन को समझने के लिए आवश्यक हैं।

बगल में क्रायो ईएम, AFM भी कम eukaryotes 29-33 और मनुष्यों के 27 में polysomes के प्रत्यक्ष इमेजिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में नियोजित किया गया है। ईएम की तुलना में, AFM कोई नमूना निर्धारण या लेबलिंग की आवश्यकता है। इसके अलावा, माप के पास शारीरिक स्थितियों में और स्पष्ट रूप से दोनों राइबोसोम और नग्न आरएनए किस्में 27 की पहचान करने की अनूठी संभावना के साथ किया जा सकता है। एकल polysomes की इमेजिंग अपेक्षाकृत जल्दी व्यापक और भारी बाद के प्रसंस्करण के लिए और पुनर्निर्माण क्रायो ईएम माइक्रोस्कोपी द्वारा आवश्यक विश्लेषण तुलना में थोड़ा बाद के प्रसंस्करण के प्रयास के साथ नैनो संकल्प पर छवियों के हजारों प्राप्त किया जा सकता है। नतीजतन, AFM डेटा को संभालने और विश्लेषण महंगा कार्यस्थानों और उच्च कंप्यूटिंग शक्ति की जरूरत नहीं है। जैसे, इस तकनीक के लक्षण polysomal आकार के बारे में जानकारी, (जैसे एकत्रऊंचाई, लंबाई और चौड़ाई), राइबोसोम घनत्व, मुक्त शाही सेना की मौजूदगी और क्रायो ईएम तुलना में एक उच्च throughput के साथ polysome 27 प्रति राइबोसोम की संख्या। इस तरह से, AFM ईएम तकनीकों के लिए एक शक्तिशाली और पूरक दृष्टिकोण polysomes 27 चित्रित करने का प्रतिनिधित्व करता है।

यहाँ हम शुद्धि से डेटा विश्लेषण जहां AFM छवि के लिए आवेदन किया है और माउस मस्तिष्क polysomes का विश्लेषण किया जाता है के लिए एक पूर्ण पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तावित प्रोटोकॉल शुद्धि के मुद्दों पर और अभ्रक substrates पर polysomes कि AFM इमेजिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं की सटीक बयान पर केंद्रित है। पारंपरिक कण विश्लेषण है कि आसानी से आम AFM समुदाय द्वारा इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है के अलावा, एक ImageJ 34 प्लगइन, RiboPick कहा जाता है, polysome 27, 35 प्रति राइबोसोम की संख्या की गणना के लिए प्रस्तुत किया है।

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Protocol

माउस के ऊतकों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रथाओं ट्रेंटो के विश्वविद्यालय के जानवरों के संरक्षण (OPBA) (इटली) के लिए निकाय द्वारा अनुमोदित किया गया, प्रोटोकॉल नहीं। 04-2015, art.31 के अनुसार विधान डिक्री नहीं। 26/2014। सभी चूहों एकीकृत जीवविज्ञान के लिए केंद्र (CIBIO), ट्रेंट विश्वविद्यालय, इटली की मॉडल जीव सुविधा पर बनाए रखा गया।

सावधानी: नमूनों में से किसी आरएनए गिरावट से बचने के लिए, RNase संदूषण को कम करने के लिए DEPC इलाज पानी का उपयोग कर सभी बफ़र्स तैयार करते हैं।

पूरे दिमाग से polysomes की 1. तैयारी

  1. मस्तिष्क के ऊतकों सभा (15 मिनट)
    1. 5 मिनट के लिए 36 सीओ 2 asphyxiation के साथ जंगली प्रकार माउस तनाव C57BL / 6 euthanize। ध्यान से मस्तिष्क, खोपड़ी 36 से काटना एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक जगह और तुरंत तरल नाइट्रोजन में जगह है। -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर।
  2. lysate की तैयारी (30 मिनट)
    1. का उपयोग करते हुए पूरे मस्तिष्क के ऊतकों घोटनाएक मोर्टार और तरल नाइट्रोजन के तहत मूसल।
    2. एक ठंडा microcentrifuge ट्यूब के बारे में 25 मिलीग्राम पाउडर स्थानांतरण और तुरंत ऊपर और नीचे pipetting 25 गुना जल्दी से lysis बफर (1 टेबल देखें) के 0.8 मिलीलीटर जोड़ने और सेल को बाधित (चूर्णित ऊतक के विगलन से बचने के लिए)।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र सेलुलर मलबे गोली।
    4. एक नया microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र नाभिक और माइटोकॉन्ड्रिया गोली।
    6. एक नया microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
    7. 6 महीने की एक अधिकतम के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला स्टोर या इसे तुरंत का उपयोग करें।
  3. सुक्रोज ढाल तैयारी और centrifugation (2 घंटा और 30 मिनट)
    1. RNase मुक्त पानी (diethylpyrocarbonate इलाज पानी (DEPC-पानी) या वाणिज्यिक) के साथ धो ultracentrifuge ट्यूबों बड़े पैमाने पर एकडी 3% एच 22 / DEPC एच 2 ओ समाधान।
    2. बर्फ पर ट्यूबों रखो और प्रत्येक ट्यूब (सूक्रोज समाधान के लिए 1 टेबल देखें) के नीचे ठंड 50% sucrose के समाधान के 5.5 मिलीलीटर जोड़ें। ध्यान से, ड्रॉप द्वारा 15% sucrose के समाधान बूंद को जोड़ने के लिए, क्रम में एक तेज अंतरावस्था को संरक्षित करने में interphase के करीब रहने तक ट्यूब पूरी तरह से भर जाता है। जब ट्यूब पूरी तरह से भर जाता है, एक रबड़ डाट के साथ इसे बंद हवा बुलबुला गठन से बचने के लिए।
    3. एक ठंडे कमरे में धीरे क्षैतिज ट्यूबों नीचे लेट गया और 2 घंटे के लिए इस स्थिति में इसे रख लो। इस समय के बाद, धीरे धीरे नलियों ऊर्ध्वाधर स्थिति में वापस सीधा और बर्फ पर डाल दिया। ढ़ाल अब इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, एक पारंपरिक ढाल पूर्व का उपयोग कर 15-50% सूक्रोज ढाल तैयार करते हैं।
    4. एक ठंडे कमरे में ढाल के ऊपर से ध्यान से 1.0 मिलीलीटर हटाने और साइटोसोलिक lysate साथ ड्रॉप द्वारा ड्रॉप सुक्रोज (यानी, सतह पर तैरनेवाला काएं में प्राप्त उपरिशायीपी 1.2)।
    5. ध्यान से झूल बाल्टी रोटर की बाल्टी में ट्यूब कम है। एक ultracentrifuge का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 180,000 XG पर 100 मिनट के लिए ढ़ाल अपकेंद्रित्र।
    6. बाद centrifugation, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अपने बाल्टी में ट्यूबों छोड़ ढ़ाल को स्थिर करने के लिए करते।
  4. सुक्रोज ढाल विभाजन (2 घंटा)
    1. ध्यान से ultracentrifuge रोटर से एक ultracentrifuge ट्यूब को हटाने और एक घनत्व ढाल fractionation प्रणाली के कलेक्टर डिवाइस पर माउंट। एक यूवी / विज़ डिटेक्टर (चित्रा 1 देखें ऊपरी पैनल) के साथ 260 एनएम पर absorbance की निगरानी के 1 मिलीलीटर अंशों लीजिए। बर्फ पर एकत्र भिन्न रखें।
    2. , ब्याज के भागों के 30-40 μl की aliquots तैयार उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग में भंडारण से पहले बर्फ पर उन्हें रखने के लिए। Aliquots या सुक्रोज अंशों कि दो से अधिक ठंड विगलन के चक्र से गुजरना पड़ा प्रयोग न करें (चित्रा 1 कम पैनल देखें)।
    </ Li>

2. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार (3 घंटा)

  1. टेप का उपयोग करना, अभ्रक शीट दूर छील।
  2. अभ्रक शीट DEPC-पानी के साथ 3-4 बार धोएं और एक छोटे से पेट्री डिश में जगह। फिर हवा का उपयोग कर सतह सूखी।
  3. 1 मिमी NISO 4 के 200 μl के साथ अभ्रक कवर और आरटी पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. निकल समाधान निकालें और फिर हवा का उपयोग कर सतह सूखी। बर्फ पर अभ्रक के साथ पेट्री डिश रखकर 4 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य की सभी चरणों को बाहर ले।
  5. बर्फ पर एक विभाज्य 1.4.2 में प्राप्त गला लें और धीरे अभ्रक पर ड्रॉप द्वारा ड्रॉप नमूना के सभी जोड़ सकते हैं। एक 100-200 μl टिप का उपयोग करना, अभ्रक की पूरी सतह पर नमूना फैल गया। 3 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना सेते हैं।
  6. 200 μl ठंड बफर-AFM से ड्रॉप द्वारा अभ्रक चादर बूंद कवर (1 टेबल देखें) और बर्फ पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. तरल में इमेजिंग
    1. बफर-AFM ध्यान से निकालें और अभ्रक शीट 3-4 समय धोनेअतिरिक्त सुक्रोज को दूर करने के लिए 200 μl ठंड बफर-AFM के साथ है। तब अभ्रक शीट ठंड धोने के समाधान के साथ 3 बार धोने (1 टेबल देखें), अभ्रक सतह समाधान के कुछ microliters द्वारा कवर किया जा रहा।
    2. 3 (छवि अधिग्रहण) बात करने के लिए जाओ।
  8. हवा में इमेजिंग
    1. ध्यान से बफर-AFM हटाने और अभ्रक अतिरिक्त सुक्रोज को दूर करने के लिए 200 μl ठंड बफर-AFM के साथ 3-4 बार धो लो। फिर, अभ्रक ठंड धोने के समाधान के साथ 3 बार धोने (1 टेबल देखें) और कागज का उपयोग कर अतिरिक्त पानी के निकास।
    2. नमूना छोड़ पेट्री डिश आंशिक रूप से खुला के शीर्ष के साथ रासायनिक हुड के नीचे सूखी। 2 घंटे के बाद, आरटी पर पेट्री डिश और दुकान बंद कर दें। 2-3 घंटे के बाद नमूना उपाय के रूप में वे साल के लिए स्थिर रहे हैं।

3. छवि अधिग्रहण (थर्मल स्थिरीकरण के बाद छवि प्रति 15 मिनट)

नोट: polysomes अभ्रक पर स्थिर हवा में या तरल में imaged किया जा सकता है, एसी मोड का उपयोग।

  1. डबल पक्षीय टेप का उपयोग नमूना धारक को अभ्रक संलग्न।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन AFM चरण में नमूना धारक डालें। जब इमेजिंग तरल में, यदि संभव हो तो, एक तापमान से कम 25 डिग्री सेल्सियस पर नमूना बनाए रखने के लिए समय में polysome स्थिरता को बढ़ाने के लिए प्रयास करें।
  3. एसी इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक ब्रैकट का चयन करें और निर्माता के निर्देशों का पालन टिप धारक पर माउंट। इधर, बल 2-20 एन / एयर इमेजिंग के लिए और मीटर के आसपास 0.1 एन / तरल इमेजिंग के लिए मीटर के बीच निरंतर उपयोग के साथ cantilevers।
  4. ब्रैकट पर लेजर हाजिर समायोजित करें और शून्य चतुर्थ भाग डिटेक्टर का संकेत है।
  5. एक उपयुक्त ड्राइविंग आवृत्ति का चयन करें और 10-20 एनएम के एक आयाम के साथ ब्रैकट ड्राइव।
  6. नमूना दृष्टिकोण जब तक टिप सतह संलग्न है।
  7. 2x2 माइक्रोन की एक स्कैन क्षेत्र का चयन करें, कम से कम 512x512 पिक्सेल छवियों (पिक्सेल चौड़ाई <4 एनएम) के अधिग्रहण, एक जीवित पृष्ठभूमि घटाव मोड और 20-25 एनएम के एक Z पैमाने का चयन करें।
  8. टी का निरीक्षणवह छवि 10 और 15 एनएम के बीच ऊंचाई के द्वारा होती है, जब सीमा 25-30 एनएम में हवा और 25 और तरल में 30 एनएम कब और चौड़ाई में प्राप्त दौर वस्तुओं की उपस्थिति के लिए लग रही है। जब तक तेज वस्तुओं कल्पना कर रहे हैं setpoint और प्रतिक्रिया के मापदंडों को समायोजित करें। पृष्ठभूमि कुछ 2-4 एनएम ऊंचाई वस्तुओं (चित्रा 2A और बी देखें) के साथ अच्छा नमूनों में अपेक्षाकृत सपाट दिखाई देनी चाहिए।
  9. (के रूप में बिंदु 3.8 में संकेत दिया) छवि अच्छा लग रहा है, तो कई (कम से कम दस) अलग नमूना क्षेत्रों में 2x2 माइक्रोन स्कैन अधिग्रहण।
  10. (वैकल्पिक)। यदि आवश्यक हो, चयनित polysomes के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त (देखें चित्र -2)।
  11. सॉफ्टवेयर सुधार (विमान घटाव और लाइन से लाइन सुधार एल्गोरिदम) लागू AFM छवियों मनमाना झुकाव को दूर करने और प्रभाव बहती सही करने के लिए।

4. डेटा विश्लेषण (छवि प्रति 30 मिनट)

  1. preferent: ImageJ (पैमाने कारक लागू वैकल्पिक) में निर्यात छवियोंially एक दोषरहित संपीड़न प्रारूप का प्रयोग, उदाहरण के लिए, झगड़ा प्रारूप (चित्रा 3A देखें)।
  2. Polysomes में राइबोसोम (देखें चित्र 3 बी) गिनती और नमूना के सांख्यिकीय गुणों की गणना करने के ImageJ मैक्रो toolset RiboPick.ijm (ImageJ मैक्रो / toolset subdirectory में कॉपी किया जा करने के लिए) का उपयोग करें (देखें चित्र -3 सी)।
    1. <पढ़ें छवि> उपकरण है कि कार्यक्रम initializes का उपयोग कर एक छवि लोड हो रहा है शुरू करो।
    2. मानक ImageJ <बिंदु चयन> उपकरण (Shift + क्लिक करें छोड़ दिया राइबोसोम की बहु-चयन की अनुमति देता है) के साथ राइबोसोम केन्द्रों उठाओ। <मार्क राइबोसोम> उपकरण के साथ चयनित राइबोसोम निशान। राइबोसोम निर्देशांक एक कस्टम पाठ विंडो में दिखाई देगा।
    3. एक ही polysome प्रक्रिया बिंदु 4.2.2 में संकेत दिया दोहरा करने के लिए और अधिक राइबोसोम जोड़ें।
    4. <पूर्ववत पिछले पिकअप> उपकरण (शुरू होता है पिछले जोड़ा राइबोसोम से पहले एक को हटाने का उपयोग कर गलत तरीके से चिह्नित राइबोसोम हटाये212; वर्तमान में polysome केवल)।
    5. जब polysome पूरा हो गया है, <नई polysome> उपकरण का उपयोग करें। जैसा कि polysome नंबर छवि के लिए एक ओवरले के रूप में जोड़ा जाता है, पाठ खिड़की अद्यतन किया जाता है।
    6. का प्रयोग करें <परिणाम और करीब सहेजें> राइबोसोम निर्देशांक फ़ाइल (छवि का मूलभूत इकाइयों का उपयोग कर रहे हैं) और एक PNG छवि है कि उठाया राइबोसोम और polysomes का सार लिखने के लिए। मूल छवि को बचाया जा रहा है बिना बंद कर दिया है।

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Representative Results

पूरे माउस मस्तिष्क के सुक्रोज ढाल polysomal प्रोफाइलिंग

यह polysomal रूपरेखा, जो अपने वजन और आकार के अनुसार बड़े अणुओं को अलग से एक सेलुलर lysate से polysomes शुद्ध करने के लिए संभव है। polysomal रूपरेखा के साथ, इस तरह के उदाहरण के रूप में संवर्धित कोशिकाओं या ऊतकों, से प्राप्त cytoplasmic lysates, एक रेखीय सूक्रोज ढाल पर लादा और ultracentrifugation द्वारा कार्रवाई की जाती है 40 और 60 सब यूनिटों, 80 राइबोसोम और polysomes से मुक्त आरएनए को अलग करने के लिए उनके अवसादन गुणांक के अनुसार ( चित्रा 1 ऊपरी पैनल)। 254 एनएम पर नमूना और अंश संग्रह के absorbance राइबोसोम या प्रतिलिपि प्रति राइबोसोम के विभिन्न संख्या के साथ polysomes में समृद्ध सुक्रोज अंश के अलगाव के लिए सक्षम है। अंशों एकत्र किया जा सकता, AFM इमेजिंग के लिए aliquoted और -80 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 में संग्रहीतकम पैनल)।

माउस मस्तिष्क हवा में AFM द्वारा मनाया से मूल निवासी polysomes तंग राइबोसोम बातचीत से पता चलता है

छवि अधिग्रहण एसी मोड (भी दोहन विधा के रूप में जाना जाता है) का उपयोग किया जाता है। इस साधन (जैसे polysomes के रूप में) मुलायम नमूने इमेजिंग क्योंकि टिप नमूना बातचीत और इसी कतरनी बलों को बहुत कम कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। इस तरह दोनों टिप और नमूना संरक्षित कर रहे हैं। AFM इमेजिंग सही मूल्यों है कि इस तरह की स्थिति को मापने, टिप की तरह है, और नमूना के गुणों के रूप में विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है, के साथ उच्च संकल्प पर डेटा के अधिग्रहण की अनुमति देता है। शर्तों के इस पत्र में वर्णित में के बारे में 4-6 एनएम के एक पार्श्व संकल्प और 0.1-0.2 एनएम के एक ऊर्ध्वाधर संकल्प प्राप्य हैं। अभ्रक पर सुक्रोज aliquots के बयान के बाद, AFM एकल polysomes का विवरण प्रदान करता है किकसकर बांध राइबोसोम (2A चित्रा, सी और सी) के समूहों के रूप में दिखाई देते हैं। द्वारा क्रॉस सेक्शन विश्लेषण (चित्रा 2 डी), ribosomal चोटियों की ऊंचाई क्या पहले हवा सुखाने के बाद 27 polysomes में मानव राइबोसोम के लिए मनाया गया के अनुसार लगभग 14 समुद्री मील दूर है। लाइन प्रोफ़ाइल द्वारा की पहचान राइबोसोम के केन्द्र से दूरी के लिए केंद्र से 23 समुद्री मील दूर है, जो समाधान 37, 38 में राइबोसोम के आयाम के साथ समझौते में है।

एक भी अंश से polysome प्रति राइबोसोम की संख्या एक मोनो छितरी हुई वितरण से पता चलता

चित्रा 3A एक ठेठ AFM छवि एक नमूना सूक्रोज ढाल का एक अंश से अभ्रक पर अवशोषित प्राप्त करके प्राप्त की रिपोर्ट। इनसेट ribos की पहचान के लिए उपयुक्त एक बढ़ाई कारक के साथ, एक भी polysome की एक डिजिटल जूम से पता चलताOMES polysome में। पैनल बी RiboPick मैक्रो के साथ राइबोसोम की पहचान के बाद एक ही छवि को दर्शाता है। लाल हलकों (इनसेट देखें) राइबोसोम के निशान, और एक प्रगतिशील संख्या (सियान) की मदद से राइबोसोम के सहयोग से एक विशेष polysome के साथ समन्वय किया जाता है। Polysome प्रति राइबोसोम की संख्या की आवृत्ति वितरण अंश # 10 के लिए विश्लेषण किया गया था (Figure1, कम पैनल देखें माध्यम आण्विक वजन polysomes (MMW) के लिए इसी), जो स्पष्ट रूप से एक भी शिखर से पता चलता (पैनल सी, धूसर बार)। प्रयोगात्मक वितरण एक गाऊसी वक्र (काला लाइन) है कि 5.8 राइबोसोम / polysome पर केंद्रित था, 1.3 राइबोसोम / polysome का एक मानक विचलन के साथ साथ लगाया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1. पूरे माउस मस्तिष्क के सूक्रोज ढाल अवसादन के लिए प्रतिनिधि absorbance प्रोफ़ाइल। (ऊपरी पीAnel) एक polysomal cytoplasmic lysate p27 माउस मस्तिष्क से प्राप्त की और एक रेखीय सूक्रोज ढाल (15-50% सूक्रोज पर लोड किया गया था [w / v])। यह RiboNucleoParticles के 254 एनएम (RNP) पर absorbance के लिए इसी स्पष्ट चोटियों, ribosomal सब यूनिटों (40 और 60 के दशकों), राइबोसोम (80) और polysomes निरीक्षण करने के लिए संभव है। दोहराया फ्रीज से बचने और अभ्रक पर AFM बयान से पहले नमूने के चक्र पिघलना करने के लिए, यह aliquots में विभाजित करने के लिए सुविधाजनक है दोनों राइबोसोम अंश और polysomal भिन्न (कम पैनल) प्रतिलेख प्रति राइबोसोम के विभिन्न संख्या (यानी, कम, मध्यम और उच्च के साथ -molecular वजन polysomes (LMW, MMW, और HMW, क्रमशः))। aliquots साल के रूप में लंबे समय के रूप में दो के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

चित्र 2
चित्रा 2. मस्तिष्क polysomes की छवियाँ दोहन मोड परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी। (ए) MMW मस्तिष्क पाली की AFM छवि के उदाहरण सेsomes अभ्रक पर अवशोषण के बाद एक रेखीय ग्रे रंग पैमाने का उपयोग। पृष्ठभूमि के लिए 0-0.5 एनएम ग्रे, 0.5-2 एनएम, और राइबोसोम के लिए 2-10 एनएम पीला: (बी) एक ही छवि में (ए) दिखाया रंग पैमाने के लिए एक अलग जेड पर्वतमाला का उपयोग करते हुए दिखाया गया है। इस मामले में एक बेहतर दृश्य विपरीत दोनों कम और उच्च जेड सीमा वस्तुओं के लिए प्राप्त की है। (सी) पार अनुभाग प्रोफ़ाइल (बिंदीदार सफेद लाइन) के साथ एक ठेठ MMW polysome की बढ़ाई। दो राइबोसोम (सी) में पार अनुभाग प्रोफ़ाइल से परिभाषित (डी) ऊंचाई प्रोफ़ाइल 14 एनएम के राइबोसोम ऊंचाई से पता चलता है। यह मान क्या पहले polysomes 27 में मानव राइबोसोम के लिए AFM में मनाया के साथ संगत है।

चित्र तीन
चित्रा 3. MMW मस्तिष्क polysomes में polysome प्रति राइबोसोम की संख्या की गणना का उदाहरण है। (ए) AFM छवि है कि प्रतिनिधिImageJ मैक्रो, RiboPick के इनपुट sents। (बी) मैन्युअल छवि में प्रत्येक राइबोसोम (लाल हलकों) की स्थिति polysome प्रति प्रत्येक राइबोसोम, RiboPick निशान उठा के बाद। (सी) polysomes प्रति राइबोसोम की प्राप्त संख्या एक वितरण है कि एक गाऊसी की अवस्था के साथ फिट किया जा सकता रूप में साजिश रची जा सकता है। इस उदाहरण में माना polysomes की संख्या 164 9 स्वतंत्र छवियों से प्राप्त की है। गाऊसी की अवस्था के साथ फिटिंग MMW अंश में polysomes की जनसंख्या का मतलब मान देता है (# राइबोसोम / polysome 5.8 ± 1.3, आर 2 = 0.99)।

<टीआर>
बफर रचना आवेदन
लिसेस बफ़र 10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5 lysate की तैयारी (1.1)
10 मिमी NaCl
10 मिमी 2 MgCl
1% ट्राइटन-X100
1% ना deoxycholate
0.4 यू / एमएल RNase अवरोध करनेवाला
1 मिमी डीटीटी
0.2 मिलीग्राम / मिलीलीटर cycloheximide
5 यू / एमएल DNase मैं
50% sucrose के समाधान 50% (w / v) में सुक्रोज सुक्रोज ढाल तैयारी (1.2)
100 मिमी NaCl
10 मिमी 2 MgCl
10 मिमी Tris / एचसीएल पीएच 7.5
15% sucrose के समाधान 15% (w / v) में सुक्रोज सुक्रोज ढाल तैयारी (1.2)
100 मिमी NaCl
10 मिमी 2 MgCl
10 मिमी Tris / एचसीएल पीएच 7.5
निकेल समाधान 1 मिमी NISO 4 AFM के लिए नमूना तैयार (2)
बफर-AFM 100 मिमी NaCl AFM के लिए नमूना तैयार (2)
10 मिमी 2 MgCl
100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide
10 मिमी HEPES
3% (w / v) सुक्रोज, पीएच = 7.4
धोने के समाधान DEPC-पानी AFM के लिए नमूना तैयार (2)
100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide

तालिका 1 बफ़र।

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Discussion

के रूप में डीएनए की संरचना की प्रतिलेखन और क्रोमेटिन के संगठन जीन अभिव्यक्ति के transcriptional नियंत्रण के बारे में हमारी समझ के रूप में उन्नत प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण साबित हो गया था, यह संगठन और polysomes की संरचना का विश्लेषण करने के लिए सच्चा समझ में सुधार के लिए आवश्यक है अनुवाद और इसके नियमन की।

वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, polysomes धीरे एक सपाट सतह पर स्थिर की एक इष्टतम घनत्व, AFM इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्राप्त की है। आसानी से तैयार नमूनों के साथ इन शर्तों का उपयोग करना, प्रति घंटे लगभग 50 polysomes, हासिल किया जा सकता आगे के विश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए तैयार है। इसके अलावा, आरटी पर संग्रहीत सूखे नमूने एक वर्ष से अधिक के बाद इमेजिंग के लिए उपयुक्त साबित किया है।

सफलतापूर्वक हमारे प्रोटोकॉल के साथ polysome छवियों को प्राप्त करने के लिए, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: ऊतकों है कि ठीक से dissectio के तुरंत बाद फ्लैश जमे हुए किया गया है का उपयोग करने केn और -80 डिग्री सेल्सियस आरएनए गिरावट को कम करने में संग्रहीत; mRNA से राइबोसोम हदबंदी से बचने के लिए cycloheximide और RNase अवरोधकों युक्त lysis बफर का उपयोग करने के लिए; अभ्रक पर नमूना बयान के दौरान बर्फ पर सभी incubations प्रदर्शन करने के लिए; और जब हवा पर AFM इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करने, बड़े पैमाने पर cycloheximide की उपस्थिति में buffers और RNase मुक्त पानी के साथ अभ्रक पर नमूना धोने के लिए। अंतिम बिंदु विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। (अक्सर राइबोसोम / polysomes अभी भी बेहोश, एम्बेडेड वस्तुओं के रूप में मनाया जा सकता है) छवि पर सही ऊंचाई लगभग लेकिन 100-1,000 एनएम विस्तृत चिकनी सतहों को रोकने के लिए प्रकट होता है, तो यह एक खराब धोया नमूना का एक स्पष्ट संकेत है। इस समस्या को हल करने के लिए एक विधि कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराने के लिए है, लेकिन यह आम तौर पर एक पहले से ही सूखे नमूना पर इस मुद्दे को कम नहीं करता। इस मामले में यह एक नया विभाज्य के साथ फिर से शुरू करने के लायक है।

AFM के संकल्प को देखते हुए, अध्ययन polysomes के लिए इस विधि struc को हल नहीं कर सकतेpolysomes में ribosomal इंटरफेस की सांस्कृतिक विवरण। वास्तव में, AFM एक पूरक और सरल दृष्टिकोण क्रायो ईएम करने के लिए एक प्रभावी और मजबूत तकनीक का प्रतिनिधित्व करने, अधिग्रहण और polysomes के हजारों विश्लेषण, और बेहतर polysomes में समग्र राइबोसोम संगठन को समझने की है। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रोटोकॉल आरएनए 27 के साथ संगत तंतु की पहचान करने का अनूठा लाभ है। यह बहुत ही प्रक्रिया किसी भी जैविक ऊतक या सेल लाइन से प्राप्त किसी भी polysomal नमूना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह भी सफलतापूर्वक इन विट्रो अनुवाद प्रणालियों में उपयोग कर प्रतिलेख-विशिष्ट जानकारी प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, क्योंकि हाल ही में लौरिया और सह कार्यकर्ता 35 के द्वारा प्रदर्शन किया। इस पद्धति कई प्रयोगों के लिए मार्ग प्रशस्त होगा, polysome गठन या अलग सेलुलर या ऊतक की शर्तों के तहत polysome संगठन में बदलाव के कैनेटीक्स की समझ हासिल करने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

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References

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