Peering på Brain Polysomer med Atomic force mikroskopi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den translationelle maskiner, dvs polysom ​​eller polyribosome, er en af de største og mest komplekse cytoplasmatiske machineries i celler. Polysomer, der dannes ved ribosomer, mRNA'er, flere proteiner og ikke-kodende RNA'er, repræsenterer integrerede platforme, hvor translationelle kontrol finder sted. Men mens ribosomet er blevet bredt studeret, afholdelse af polysomer mangler stadig omfattende forståelse. Således kræves en stor indsats for at belyse polysom ​​organisation og enhver ny mekanisme for translationel kontrol, som kan indlejres. Atomic force mikroskopi (AFM) er en type af scanning probe mikroskopi, der tillader køb af 3D-billeder på nanoskala opløsning. Sammenlignet med elektronmikroskopi (EM) teknikker, en af ​​de vigtigste fordele ved AFM er, at det kan erhverve tusindvis af billeder både i luften og i opløsning, således at prøven, der skal holdes under nær fysiologiske betingelser uden behov for farvning og fastsættelse proprocedurer. Her er en detaljeret protokol til nøjagtig rensning af polysomer fra musehjerne og deres afsætning på glimmer substrater beskrevet. Denne protokol muliggør polysom ​​billeddannelse i luft og væske med AFM og deres rekonstruktion som tredimensionale genstande. Supplerende til cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), kan den foreslåede metode bekvemt bruges til systematisk at analysere polysomer og studere deres organisation.

Introduction

Syntesen af protein er den mest energikrævende proces i celler 1,2. Derfor er det ikke overraskende, at protein mængderne hovedsagelig styres på translatoriske i stedet for transkriptionel niveau 3,4,5. Polysom ​​er den grundlæggende makromolekylære komponent, der konverterer mRNA oplysninger i funktionelle proteinholdige udlæsninger. Polysomer er hidtil anerkendt som makromolekylære komplekser, hvor flere translationelle kontroller konvergerer 6-13. Trods hundredvis af undersøgelser af ribosom struktur 14- 16, er de detaljerede molekylære indsigt i dynamikken i oversættelse og topologi polysomer stødt på en begrænset interesse. Som en konsekvens, organiseringen af ​​den indfødte polysomalt ribonukleoproteinkompleks og dens potentielle effekt på oversættelse er stadig temmelig obskure spørgsmål. Polysomer kan skjule stadig ukendt bestilt og funktionelle organisationer, potentielt spejling hvilke nukleosomer og epigenetiske controls har repræsenteret for transskription feltet. Faktisk undersøgelsen af ​​denne spændende hypotese kræver yderligere undersøgelser og nye tekniske tilgange. I denne linje, kan strukturelle teknikker og atomic force mikroskopi frugtbart samarbejde om at opklare nye mekanismer til styring af genekspression, hvilket svarer til resultaterne opnået for nukleosom 17,18.

Siden opdagelsen af ribosomet 14-16, er dens struktur blevet grundigt karakteriseret i prokaryoter 19,20, gær 21 og senere i human 22, hvilket giver den molekylære beskrivelse af mekanismerne ved basis af proteinsyntese. Polysomer blev oprindeligt indregnet på membranen af det endoplasmatiske reticulum, danner typiske 2D geometriske organisationer 14. Som nævnt før, er polysom ​​samling ikke været genstand for konstant interesse som ribosomet struktur. I fortiden, er polysomer væsentlige blevet undersøgt af transmission EM-baserede teknikker. Først for nylig, cryo-EM teknikker aktiveret 3D-rekonstruktion af oprensede polysomer fra in vitro-oversættelse systemer 23-26, menneskelige cellelysater 27 eller i celler 28. Disse teknikker tilbudt mere raffineret oplysninger om ribosomet-ribosom organisation i polysomer 23, 26-28 og en foreløbig molekylær beskrivelse af kontaktfladerne af tilstødende ribosomer i hvedekim polysomer 24. , Cryo-EM tomografi tillader således offentliggørelse af ribosom-ribosom interaktioner med molekylær detalje, men det er tynget af en omfattende efterbehandling og genopbygning analyser, som kræver tunge it-ressourcer til datahåndtering. Desuden at opnå den molekylære detaljer af ribosom-ribosom interaktioner, er en højt løst kort over ribosomet påkrævet, og denne form for henvisning ribosom er kun tilgængelig for nogle få arter. Vigtigere, cryo-EM tomografi er ikke i stand til at påvise frit RNA. Therefmalm, er nye teknikker forpligtet til fuldt ud at forstå organiseringen af ​​oversættelsen maskiner.

Udover cryo-EM har AFM også blevet ansat som et nyttigt redskab til direkte billeddannelse af polysomer i lavere eukaryoter 29-33 og mennesker 27. I forhold til EM, AFM kræver ingen prøve fiksering eller mærkning. Desuden kan målinger udføres i nær fysiologiske forhold og med den unikke mulighed for klart at identificere både ribosomer og nøgne RNA-strenge 27. kan udføres Imaging af enkelte polysomer relativt hurtigt, at få tusindvis af billeder på nano-opløsning med lidt efterbehandling indsats i forhold til den omfattende og tunge efterbehandling og genopbygning krævede analyser cryo-EM mikroskopi. Derfor ikke AFM håndtering og analyse af data ikke behøver dyre arbejdsstationer og høj computerkraft. Som sådan er denne teknik indsamler information om polysomalt former, morfologiske karakteristika (såsomhøjde, længde og bredde), ribosom densiteter, tilstedeværelsen af frit RNA og antallet af ribosomer pr polysom ​​27 med et højere gennemløb end kryo-EM. I en sådan måde, AFM repræsenterer en stærk og komplementær tilgang til EM teknikker til at skildre polysomer 27.

Her præsenterer vi en komplet rørledning fra rensning til dataanalyse, hvor AFM anvendes på billedet og analysere musehjerne polysomer. Den foreslåede protokol fokuserer på rensning spørgsmål og den nøjagtige deponering af polysomer på glimmer substrater, der anvendes til AFM billeddannelse. Ud over traditionel partikel analyse, der let kan udføres med fælles software bruges af AFM samfund, en ImageJ 34 plugin, kaldet RiboPick, præsenteres for at tælle antallet af ribosomer pr polysom ​​27, 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De metoder, der anvendes til at opnå musen væv blev godkendt af organ for beskyttelse af dyr (OPBA) ved universitetet i Trento (Italien), protokol nr. 04-2015, som pr Art.31 lovdekret nr. 26/2014. Alle mus blev fastholdt på modelorganismen Facility for Center for Integrativ Biologi (CIBIO), University of Trento, Italien.

Forsigtig: For at undgå enhver RNA-nedbrydning af prøverne, forberede alle buffere bruger DEPC-behandlet vand til minimering RNase forurening.

1. Fremstilling af Polysomer fra hele hjerner

  1. Indsamling hjernevæv (15 min)
    1. Afliv vildtype-mus stammen C57BL / 6 med CO 2 kvælning i 5 min 36. Dissekere omhyggeligt hjernen ud fra kraniet 36, placere vævet i et 1,5 ml rør og straks placere den i flydende nitrogen. Opbevar ved -80 ° C indtil brug.
  2. Fremstilling af lysat (30 min)
    1. Pulverisere hele hjernevæv under anvendelseen morter og støder under flydende nitrogen.
    2. Overfør ca. 25 mg pulver til en kold mikrocentrifugerør og omgående (for at undgå optøning af det pulveriserede væv) tilsættes 0,8 ml lysisbuffer (se tabel 1) og forstyrre cellen ved pipettering op og ned 25 gange hurtigt.
    3. Centrifugeres røret ved 12.000 x g i 1 min ved 4 ° C for at pelletere celledebris.
    4. Supernatanten overføres til et nyt mikrocentrifugerør og holde røret på is i 15 min.
    5. Centrifugeres røret ved 12.000 xg i 5 min ved 4 ° C for at pelletere kerner og mitokondrier.
    6. Supernatanten overføres til et nyt mikrocentrifugeglas.
    7. Supernatanten opbevares ved -80 ° C i højst 6 måneder eller bruge den med det samme.
  3. Saccharose gradient forberedelse og centrifugering (2 timer og 30 min)
    1. Vask ultracentrifugerør indgående med RNase-frit vand (diethylpyrocarbonat behandlet vand (DEPC-vand) eller kommerciel) end 3% H 2 O 2 / DEPC H2O-opløsning.
    2. Sætte rørene på is, og der tilsættes 5,5 ml kold 50% saccharose-opløsning ved bunden af hvert rør (se tabel 1 for sucroseopløsninger). Derefter tilsættes forsigtigt 15% saccharoseopløsning dråbevis, bo tæt på interfasen for at bevare en skarp interfase, indtil røret er helt fyldt. Når røret er helt fyldt, lukkes den med en gummiprop for at undgå luftbobler formation.
    3. I et koldt rum forsigtigt fastsætte rørene vandret og holde det i denne stilling i 2 timer. Efter denne tid, langsomt rette rørene tilbage i lodret position og sætte dem på is. Gradienterne er nu klar til at blive brugt. Alternativt forberede sucrosegradient 15-50% ved anvendelse af en konventionel gradient tidligere.
    4. I et koldt rum Fjern forsigtigt 1,0 ml fra toppen af gradienten og overlay saccharose dråbevis med den cytosoliske lysat (dvs. supernatanten opnået i step 1.2).
    5. Sænk forsigtigt rørene ind i spande af svingende spand rotor. Centrifuger gradienter for 100 minutter ved 180.000 xg ved 4 ° C under anvendelse af en ultracentrifuge.
    6. Efter centrifugeringen, lad rørene i deres spande i 20 min ved 4 ° C for at lade gradienterne stabiliseres.
  4. Saccharosegradientfraktionering (2 timer)
    1. Fjern forsigtigt én ultracentrifugerør fra ultracentrifuge rotor og montere den på indsamleren enhed af en Density Gradient Fraktionering System. Indsamler 1 ml fraktioner overvåger absorbansen ved 260 nm med en UV / VIS-detektor (Se figur 1 øvre panel). Hold de opsamlede fraktioner på is.
    2. Forbered portioner af 30-40 pi af fraktionerne af interesse, holde dem på is før opbevaring dem ved -80 ° C indtil brug. Brug ikke portioner eller saccharose fraktioner, undergik mere end to frysning-optøning cyklusser (se figur 1 nederste panel).
    </ Li>

2. Prøve Forberedelse til Atomic force mikroskopi (3 timer)

  1. Ved hjælp af tape, skrælle glimmer ark.
  2. Vask glimmer ark 3-4 gange med DEPC-vand og læg det i en lille petriskål. Derefter tørres overfladen ved anvendelse af luft.
  3. Dæk glimmer med 200 pi af 1 mM Niso 4 og inkuberes i 3 minutter ved stuetemperatur.
  4. Fjern nikkel-opløsning og derefter tørre overfladen med luft. Udføre alle fremtidige skridt ved 4 ° C ved at placere petriskål med glimmer på is.
  5. Optø en portion opnået i 1.4.2 på is og forsigtigt tilføje alle prøvens dråbevis på glimmer. Ved hjælp af en 100-200 pi tip, sprede prøven på hele overfladen af ​​glimmer. Prøven inkuberes på is i 3 min.
  6. Dæk glimmer ark dråbevis med 200 pi kold Buffer-AFM (se tabel 1) og inkuberes i 1 time på is.
  7. Imaging i flydende
    1. Fjern forsigtigt Buffer-AFM og vaske glimmer ark 3-4 tids med 200 pi kold buffer-AFM at fjerne overskydende sucrose. Derefter vaske glimmer ark 3 gange med kold Washing Solution (se tabel 1), der forlader glimmer overflade dækket af nogle mikroliter opløsning.
    2. Gå til punkt 3 (Billede erhvervelse).
  8. Imaging i luften
    1. Fjern forsigtigt Buffer-AFM og vask glimmer 3-4 gange med 200 pi kold buffer-AFM at fjerne overskydende sucrose. Derefter vaskes glimmer 3 gange med kold Washing Solution (se tabel 1) og dræne det overskydende vand ved hjælp af papir.
    2. Efterlad prøven tørres under kemisk hætte med toppen af ​​petriskålen delvis åben. Efter 2 timer, luk petriskål og opbevar ved stuetemperatur. Måler prøven efter 2-3 timer, som de er stabile i årevis.

3. Image Acquisition (15 min pr billede efter termisk stabilisering)

Bemærk: Polysomer immobiliseret på glimmer kan afbildes i luft, eller flydende, hjælp AC-tilstand.

  1. Fastgør glimmer til indehaveren prøve ved anvendelse af dobbeltklæbende tape.
  2. Sæt holderen prøven i AFM fase efter producentens anvisninger. Når billedbehandling i flydende, hvis det er muligt, forsøge at opretholde prøven ved en lavere temperatur end 25 ° C for at øge polysom ​​stabiliteten i tide.
  3. Vælg en cantilever egnet til AC billedbehandling og montere den på holderen spidsen efter producentens anvisninger. Her bruge støtteben med kraft konstant mellem 2-20 N / m for luft billedbehandling og omkring 0,1 N / m for flydende billeddannelse.
  4. Juster laserpunktet på udliggeren og nul kvadrantelektroderne detektorsignaler.
  5. Vælg et belejligt drivfrekvensen og drev udliggeren med en amplitude på 10-20 nm.
  6. Nærme prøven, indtil spidsen går i indgreb med overfladen.
  7. Vælg en scanning område af 2x2 um, erhverve mindst 512x512 pixel billeder (pixel bredde <4 nm), vælg levende baggrund subtraktion mode og en Z skala på 20-25 nm.
  8. Undersøg than billede søger tilstedeværelsen af ​​runde genstande karakteriseret ved højden mellem 10 og 15 nm, når de erhverver i luft og 25 og 30 nm, når i flydende og bredde i området 25-30 nm. Juster setpunkt og feedback parametre indtil skarpe genstande visualiseres. Baggrunden skal vises forholdsvis flad i gode prøver, med nogle 2-4 nm højde objekter (se figur 2A og B).
  9. Hvis billedet ser godt (som angivet i punkt 3.8), erhverve flere (mindst ti) 2x2 micron scanninger på forskellige forsøgsområder.
  10. (valgfri). Hvis det er nødvendigt, erhverve billeder af udvalgte polysomer høj opløsning (se figur 2C).
  11. Påfør software korrektioner (plane subtraktion og line-by-line korrektionsalgoritmer) at rette AFM billeder fjerne vilkårlige tilt og drivende effekter.

4. Data Analysis (30 min per billede)

  1. Eksport billeder i ImageJ (ekstraudstyr: anvende en skalafaktor) preferentially bruger en tabsfri komprimering format, f.eks TIFF-format (se figur 3A).
  2. Brug ImageJ makro værktøjssæt RiboPick.ijm (der skal kopieres i ImageJ makro / værktøjssæt undermappe) at tælle ribosomer i polysomer (se figur 3B) og beregne statistiske egenskaber af prøven (se figur 3C).
    1. Start indlæse et billede ved hjælp af <Læs billedet> værktøj, der initialiserer programmet.
    2. Pluk ribosomet centre med standard ImageJ <Punkt valg> værktøj (shift + venstreklik tillader multi-udvælgelse af ribosomer). Marker de valgte ribosomer med <Mark ribosomer> værktøj. Ribosom koordinater vises i en brugerdefineret tekst vindue.
    3. Tilføj flere ribosomer til samme polysom ​​gentage proceduren angivet i punkt 4.2.2.
    4. Fjern fejlagtigt markeret ribosomer ved hjælp af <Fortryd sidste pick> værktøj (starter fjerne fra den sidste tilføjet ribosomet til den første212; i den aktuelle polysom ​​kun).
    5. Når polysom ​​er afsluttet, skal du bruge <Ny polysom> værktøj. Som tilføjes polysom ​​nummer som et overlay til billedet, bliver teksten vinduet opdateret.
    6. Brug <Gem resultaterne og tæt> til at skrive ribosomet koordinater fil (standard enheder af billedet bruges) og en PNG-billede, der opsummerer den plukkede ribosomer og polysomer. Det originale billede er lukket uden at blive gemt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Saccharosegradient polysomalt profilering af hele musehjerne

Det er muligt at oprense polysomer fra et cellulært lysat af polysomalt profilering, som adskiller makromolekyler i overensstemmelse med deres vægt og størrelse. Med polysomalt profilering, cytoplasmatiske lysater fremstillet ud fra dyrkede celler eller væv, såsom i dette eksempel er påført en lineær saccharosegradient og behandles af ultracentrifugering til at separere fri RNA fra 40'erne og 60S-underenheder, 80S ribosomer og polysomer efter deres sedimentationskoefficienter ( Figur 1 øvre panel). Absorbansen af ​​prøven ved 254 nm, og fraktionsopsamling muliggøre isoleringen af ​​den sucrosefraktion beriget med ribosomer eller polysomer med forskelligt antal ribosomer pr transkript. Fraktionerne kan opsamles, alikvoteret til AFM billeddannelse og opbevaret ved -80 ° C (figur 1nedre panel).

Native polysomer fra musehjerne observeret af AFM i luft afsløre stramme ribosom interaktioner

Billedoptagelse udføres under anvendelse AC mode (også kendt som at trykke tilstand). Denne modalitet er specielt velegnet til billeddannelse bløde prøver (såsom polysomerne), fordi tip-prøven interaktion og de tilsvarende forskydningskræfter er stærkt reduceret. På denne måde både spidsen og prøven bevares. AFM imaging tillader erhvervelse af data i høj opløsning, med eksakte værdier, der afhænger af forskellige faktorer, såsom målebetingelserne, arten af ​​spidsen, og egenskaberne ved prøven. I betingelserne beskrevet i dette papir en lateral opløsning på omkring 4-6 nm og en vertikal opløsning på 0,1-0,2 nm er opnåelige. Efter afslutningen af ​​afsætningen af ​​saccharose Portionerne på glimmer, AFM indeholder beskrivelser af enkelte polysomer dervises som klynger af tæt pakkede ribosomer (fig 2A, C og C). Ved tværsnit analyse (figur 2D), højden af ribosomale toppe er omkring 14 nm i overensstemmelse med hvad der tidligere blev observeret for humane ribosomer i polysomer efter lufttørring 27. Centret til centerafstand på ribosomer identificeret af linjen profil er 23 nm, hvilket er i overensstemmelse med dimensionen af ribosomer i opløsning 37, 38.

Antallet af ribosomer pr polysom ​​fra en enkelt fraktion viser en mono-dispergeret distribution

Figur 3A rapporterer en typisk AFM billede opnået ved at erhverve en prøve absorberet på glimmer fra en fraktion af saccharosegradienten. Det indsatte viser en digital zoom på et enkelt polysom, med en forstørrelsesfaktor beskriver identifikation af ribosOMES i polysom. Panel B viser det samme billede efter ribosomet identifikation med RiboPick makro. Røde cirkler (se indsat) markere ribosomer, og et progressivt nummer (cyan) bruges til at hjælpe foreningen af ​​ribosomet koordinerer med en bestemt polysom. Frekvensfordelingen af antallet af ribosomer pr polysom ​​blev analyseret for fraktion # 10 (se Figur 1, nedre panel, svarende til middel molekylvægt polysomer (MMV)), som tydeligt viser en enkelt top (felt C, grå søjler). Den eksperimentelle fordeling var udstyret med en Gaussisk kurve (sort linje), der var centreret på 5,8 ribosomer / polysom, med en standardafvigelse på 1,3 ribosomer / polysom.

figur 1
Figur 1. Repræsentative absorbans profil for saccharosegradient sedimentering af hele musehjerne. (Øvre panel) En polysomalt cytoplasmatisk lysat blev opnået fra P27 musehjerne og sat på en lineær saccharosegradient (15-50% saccharose [w / v]). Det er muligt at observere klare toppe svarende til absorbansen ved 254 nm af RiboNucleoParticles (RNP), ribosomale subunits (40S og 60S), ribosomer (80S) og polysomer. At undgå gentagne fryse og tø cyklusser af prøver inden AFM afsætning på glimmer, er det praktisk at opdeles i alikvoter både ribosom fraktion og polysomalt fraktioner (nederste panel) med forskelligt antal ribosomer pr transkript (dvs. lav-, mellem- og høj -molecular vægt polysomer (LMW, MMV, og HMW henholdsvis)). Portionerne kan opbevares ved -80 ° C i op til to år.

Figur 2
Figur 2. Billeder af hjernen polysomer ved Tapping-Mode Atomic force mikroskopi. (A) Eksempel på AFM billede af MMV hjerne polysomes efter absorption på glimmer anvendelse af en lineær farveskala grå. (B) Det samme billede vist i (A) er afbildet ved hjælp af en forskellige Z-intervaller for farveskalaen: 0-0,5 nm grå til baggrunden, 0,5-2 nm, og 2-10 nm gule ribosomselektiv. I dette tilfælde opnås en bedre visuel kontrast for både lave og høje Z-range objekter. (C) Forstørrelse af en typisk MMV polysom ​​med tværsnit profil (punkteret hvid linje). (D) Højde profil af to ribosomer defineret af tværsnittet profil i (C) viser ribosom højde på 14 nm. Denne værdi er kompatibel med, hvad der tidligere observeret i AFM for humane ribosomer i polysomer 27.

Figur 3
Figur 3. Eksempel på at tælle antallet af ribosomer pr polysom ​​i MMV hjerne polysomer. (A) AFM billede, der repræsenterer input fra ImageJ makro, RiboPick. (B) Efter manuelt plukke hver ribosomer pr polysom, RiboPick mærker i billedet positionen af hver ribosomkomplekser (røde cirkler). (C) Den opnåede antal ribosomer pr polysomer kan plottes som en fordeling, der kan udstyres med en Gaussisk kurve. Antallet af polysomer anses i dette eksempel er 164, opnået fra 9 uafhængige billeder. Beslaget med den gaussiske kurve returnerer middelværdien af befolkningen i polysomer i MMV fraktion (# ribosomer / Polysomprofiler 5,8 ± 1,3, R2 = 0,99).

<tr>
Buffer Sammensætning Anvendelse
lysis Buffer 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 Fremstilling af lysat (1,1)
10 mM NaCl
10 mM MgCl2
1% Triton-X100
1% Na-deoxycholat
0,4 U / ml RNase Inhibitor
1 mM DTT
0,2 mg / ml cycloheximid
5 U / ml DNase I
50% saccharose løsning 50% (w / v) sucrose i Saccharosegradient forberedelse (1.2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
15% saccharoseopløsning 15% (vægt / volumen) saccharose i Saccharosegradient forberedelse (1.2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
Nikkel Løsning 1 mM Niso 4 forberedelse Prøve til AFM (2)
Buffer-AFM 100 mM NaCl forberedelse Prøve til AFM (2)
10 mM MgCl2
100 ug / ml cycloheximid
10 mM Hepes
3% (vægt / volumen) sucrose, pH = 7,4
vaskeopløsning DEPC-Water forberedelse Prøve til AFM (2)
100 ug / ml cycloheximid

Tabel 1. Buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som strukturen af ​​DNA blev vist sig at være af afgørende betydning for at beskrive processen med transskription og afholdelse af kromatin avancerede vores forståelse af transkriptionel kontrol af genekspression, er det vigtigt at analysere organisation og struktur polysomer at forbedre sandfærdige forståelse oversættelse og dens regulering.

Med den beskrevne protokol, en optimal tæthed af polysomer forsigtigt immobiliseret på en flad overflade, opnås egnet til AFM billeddannelse. Ved hjælp af disse forhold med bekvemt forberedt prøver, kan næsten 50 polysomer timen erhverves, klar til yderligere analyser og karakterisering. Desuden har tørrede prøver opbevaret ved stuetemperatur vist sig at være egnet til billeddannelse efter mere end et år.

For at kunne opnå polysom ​​billeder med vores protokol, er der nogle afgørende skridt: at bruge væv, der er blevet ordentligt flash-frosne umiddelbart efter dissection og opbevaret ved -80 ° C til minimering RNA-nedbrydning; at bruge lysis buffer indeholdende cycloheximid og RNase-inhibitorer for at undgå ribosom dissociation fra mRNA; at udføre alle inkubationer på is under prøven deposition på glimmer; og ved udarbejdelsen af ​​prøven til AFM billeddannelse på luft, til ekstensivt vaske prøven på glimmer med buffere og RNase frit vand under tilstedeværelse af cycloheximid. Det sidste punkt er særlig vigtig. Hvis billedet ser ud til at indeholde glatte overflader på omtrent den rigtige højde, men 100-1.000 nm bred, det er en klar indikation af en dårligt vasket prøve (ofte ribosomer / polysomer kan stadig observeres som svage, indlejrede objekter). En metode til at løse dette problem er at gentage vaskeproceduren, men det betyder ikke normalt afhjælpe problemet på en allerede tørret prøve. I dette tilfælde er det værd at starte igen med en ny portion.

I betragtning af den opløsning af AFM, kan denne metode til at studere polysomer ikke løse struk-relle oplysninger om ribosomale grænseflader i polysomer. Faktisk AFM er en komplementær og enklere tilgang til cryo-EM, der repræsenterer en effektiv og robust teknik, erhverve og analysere tusindvis af polysomer, og bedre at forstå den overordnede ribosom organisation i polysomer. Vigtigere er det, denne protokol har den unikke fordel at identificere filamenter er kompatible med RNA 27. Denne meget samme procedure kan anvendes til enhver polysomalt prøve opnået fra enhver biologisk væv eller cellelinie. Endnu vigtigere er det kan også udmærket anvendes til at opnå transkript-specifikke oplysninger anvendelse af in vitro translationssystemer, som det for nylig påvist af Lauria og medarbejdere 35. Denne metode vil bane vejen for flere eksperimenter, at opnå forståelse af kinetikken af ​​polysom ​​dannelse eller ændringer i polysom ​​organisation under forskellige cellulære eller væv betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics