Peering på Brain Polysomes med Atomic Force Microscopy

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den translasjonsforskning maskiner, dvs. polysome eller polyribosome, er en av de største og mest komplekse cytoplasmatiske machineries i cellene. Polysomes, dannet av ribosomer, mRNA-er, flere proteiner og ikke-kodende RNA, representerer integrert plattformer der translasjonelle kontroller finner sted. Men mens ribosomet har blitt mye studert, organisering av polysomes fortsatt mangler fullstendig forståelse. Således mye anstrengelse er nødvendig for å belyse polysome organisasjon og en hvilken som helst ny mekanisme for translasjons-kontroll som kan være innebygd. Atomic force mikroskopi (AFM) er en type scanning probe mikroskopi som gjør at kjøpet av 3D-bilder på nanonivå oppløsning. Sammenlignet med elektronmikroskopi (EM) teknikker, en av de viktigste fordelene med AFM er at det kan skaffe seg tusenvis av bilder både i luft og i løsning, slik at prøven som skal holdes under nær fysiologiske betingelser uten behov for farging og fiksering prodyrer. Her er et detaljert protokoll for nøyaktig rensing av polysomes fra musehjerne og deres avsetning på glimmer substrater er beskrevet. Denne protokollen gjør polysome bildebehandling i luft og væske med AFM og deres rekonstruksjon som tredimensjonale objekter. Komplementær til Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), kan den foreslåtte metoden enkelt brukes til systematisk å analysere polysomes og studere deres organisasjon.

Introduction

Syntesen av protein er den mest energikrevende prosess i celler 1,2. Derfor er det ikke overraskende at protein Forekomsten er i hovedsak kontrollert ved det translasjonelle i stedet for transkripsjonsnivået 3,4,5. Den polysome er den grunnleggende makromolekylære komponent som konverterer mRNA informasjonen inn i funksjonelle proteinavlesninger. Polysomes er så langt anerkjent som makromolekylære komplekser der flere translasjonsforskning kontroller møtes 6-13. Til tross for hundrevis av studier på ribosom struktur 14- 16, har de detaljerte molekylære innsikt i dynamikken i oversettelse og topologien av polysomes oppstått et begrenset interesse. Som en konsekvens, organisering av de innfødte polysomal ribonucleoprotein komplekse og dens virkning på muligheten oversettelse er fortsatt ganske obskure saker. Polysomes kan skjule fortsatt ukjent bestilt og funksjonelle organisasjoner, potensielt speiling hvilke nucleosomes og epigenetisk controls har representert for transkripsjon feltet. Faktisk etterforskningen av denne spennende hypotese krever ytterligere studier og nye tekniske tilnærminger. I denne linjen, kan strukturelle teknikker og atomic force mikroskopi motivert samarbeide for å løse nye mekanismer for å styre genekspresjon, på samme måte som det som ble oppnådd for nucleosome 17,18.

Siden oppdagelsen av ribosomet 14-16, har dens struktur blitt grundig karakterisert ved prokaryoter 19,20, gjær 21 og mer nylig i human 22, som gir den molekylære beskrivelse av mekanismene på basis av proteinsyntesen. Polysomes ble først anerkjent på membranen av det endoplasmatiske retikulum, danner typiske 2D geometriske organisasjoner 14. Som nevnt tidligere, har polysome sammenstillingen ikke vært gjenstand for konstant interesse som ribosomet struktur. I det siste har polysomes blitt studert i hovedsak av transmission EM-baserte teknikker. Bare nylig, cryo-EM teknikker aktivert 3D-rekonstruksjon av renset polysomes fra in vitro oversettelsessystemer 23-26, menneskelige cellelysatene 27 eller i celler 28. Disse teknikkene tilbudt mer raffinert informasjon om ribosom-ribosom organisasjon i polysomes 23, 26-28 og en foreløpig molekylær beskrivelse av kontaktflatene på tilstøtende ribosomer i hvetekim polysomes 24. Dermed kan cryo-EM tomografi offentliggjøring av ribosom-ribosom interaksjoner med molekylær detalj, men det er tynget av omfattende etterbehandling og gjenoppbygging analyser som krever tunge beregningsressurser for datahåndtering. Videre, for å få den molekylære detalj av ribosom-ribosom interaksjoner, kreves et svært løst kart over ribosom, og denne typen referansen ribosom er kun tilgjengelig for noen få arter. Viktigere er cryo-EM tomografi ikke i stand til å oppdage gratis RNA. Therefmalm, nye teknikker som kreves for å fullt ut forstå organiseringen av oversettelses maskiner.

Foruten cryo-EM, har AFM er også ansatt som et nyttig verktøy for direkte avbildning av polysomes i lavere eukaryoter 29-33 og mennesker 27. Sammenlignet med EM, krever AFM ikke prøve fiksering eller merking. I tillegg kan målinger utføres i nærheten av fysiologiske betingelser og med en unik mulighet til klart å identifisere både ribosomer og nakne RNA tråder 27. Imaging av enkelt polysomes kan utføres relativt raskt, skaffe tusenvis av bilder på nano-oppløsning med lite etterbehandling innsats i forhold til den omfattende og tung etterbehandling og gjenoppbygging analyser som kreves av Cryo-EM mikroskopi. Derfor gjør AFM databehandling og analyse ikke trenger dyre arbeidsstasjoner og høy datakraft. Som sådan, samler denne teknikken informasjon om polysomal former, morfologiske egenskaper (så somhøyde, lengde og bredde), ribosom densiteter, tilstedeværelse av fri RNA og antallet ribosomer pr polysome 27 med en høyere gjennomstrømning enn cryo-EM. I en slik måte, representerer AFM en kraftig og komplementær tilnærming til EM teknikker for å portrettere polysomes 27.

Her presenterer vi en komplett rørledning fra rensing til dataanalyse hvor AFM brukes til bilde og analysere mus hjernen polysomes. Den foreslåtte protokoll fokuserer på renseproblemer og på den nøyaktige avsetning av polysomes på glimmer substrater som brukes for AFM avbildning. I tillegg til konvensjonell partikkelanalyse som lett kan utføres med vanlig programvare som brukes av AFM samfunnet, en ImageJ 34 plugin, kalt RiboPick, blir presentert for å telle antall ribosomer pr polysome 27, 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den praksis brukes for å få muse vev ble godkjent av Body for beskyttelse av dyr (OPBA) ved Universitetet i Trento (Italia), protokoll nr. 04-2015, som per Art.31 lovdirektiv no. 26/2014. Alle mus ble opprettholdt på modellorganisme Facility for Senter for Integrative Biology (CIBIO), Universitetet i Trento, Italia.

Forsiktig: For å unngå enhver RNA degradering av prøvene, forberede alle buffere ved hjelp DEPC-behandlet vann for å minimere RNase forurensning.

1. Utarbeidelse av Polysomes fra Whole Brains

  1. Gathering hjernevev (15 min)
    1. Avlive villtype mus stammen C57BL / 6 med CO 2 kvelning for 5 min 36. Dissekere nøye hjernen ut fra skallen 36, plasserer vevet inn i en 1,5 ml tube og umiddelbart plassere den i flytende nitrogen. Oppbevar ved -80 ° C inntil bruk.
  2. Fremstilling av lysat (30 min)
    1. Pulverisere hele hjernevevet ved hjelpen morter og støter under flytende nitrogen.
    2. Overfør ca. 25 mg pulver til en kald mikrosentrifugerør og umiddelbart (for å unngå opptining av pulveriserte vev) tilsett 0,8 ml lysebuffer (se tabell 1) og forstyrre cellen ved pipettering opp og ned 25 ganger raskere.
    3. Sentrifuger røret ved 12.000 xg i 1 min ved 4 ° C for å pelletere cellerester.
    4. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør og holde røret på is i 15 min.
    5. Sentrifuger røret ved 12.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å pelletere kjerner og mitokondrier.
    6. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør.
    7. Oppbevare den overliggende væske ved -80 ° C i maksimalt 6 måneder eller bruke den umiddelbart.
  3. Sukrosegradient forberedelse og sentrifugering (2 timer og 30 min)
    1. Vask ultrasentrifuge rør mye med RNase-fritt vann (dietylpyrokarbonat behandlet vann (DEPC-vann) eller kommersiell) end 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O-løsning.
    2. Sette rørene på is og tilsett 5,5 ml kald 50% sukrose-løsning i bunnen av hvert rør (se tabell 1 for sukrose-løsninger). legge forsiktig 15% sukrose løsning dråpe for dråpe, bor like ved inter for å bevare en skarp inter, inntil røret er fylt helt opp. Når røret fylles helt ut, lukke den med en gummipropp for å unngå luftbobledannelse.
    3. I et kaldt rom forsiktig legge ned rør horisontalt og holde den i denne posisjonen i to timer. Etter denne tid, sakte rette rørene tilbake i loddrett stilling og sette dem på is. Gradientene er nå klar til bruk. Alternativt forberede 15-50% sukrose gradient ved hjelp av en konvensjonell gradient tidligere.
    4. I et kaldt rom Fjern forsiktig 1,0 ml fra toppen av gradient og overlay sukrose dråpe for dråpe med cytosoliske lysat (dvs. supernatanten oppnådd i step 1,2).
    5. Senk rørene inn i bøtter med svingende bøtte rotoren. Sentrifuger gradienter til 100 minutter ved 180 000 xg ved 4 ° C ved anvendelse av en ultrasentrifuge.
    6. Etter sentrifugering, la rørene i deres bøtter i 20 minutter ved 4 ° C for å la gradienter stabiliseres.
  4. Sukrose gradient fraksjonering (2 timer)
    1. Fjern forsiktig en ultrasentrifuge røret fra ultra rotoren og montere den på solfangeren enheten av en Density Gradient Fraksjone System. Samle 1 ml fraksjoner registrering av absorbansen ved 260 nm med et UV / VIS detektor (Se figur 1 øvre panel). Hold de innsamlede fraksjoner på is.
    2. Forbered porsjoner av 30-40 ul av fraksjonene av interesse, holde dem på isen før lagre dem ved -80 ° C til bruk. Ikke bruk aliquoter eller sukrose fraksjoner som gjennomgikk mer enn to fryse-tine-sykluser (se figur 1 nedre panel).
    </ Li>

2. Prøvepreparering for Atomic Force Mikroskopi (3 timer)

  1. Ved hjelp av tape, skrelle av glimmer ark.
  2. Vask glimmer ark 3-4 ganger med DEPC-vann og legg den i en liten petriskål. Deretter tørker overflaten ved hjelp av luft.
  3. Dekk glimmer med 200 ul 1 mM NISO 4 og inkuberes i 3 minutter ved romtemperatur.
  4. Fjern det løse nikkelløsning, og deretter tørke overflaten ved bruk av luft. Gjennomføre alle fremtidige trinn ved 4 ° C ved å plassere petriskål med glimmer på is.
  5. Tine en delmengde oppnådd i 1.4.2 på is og tilsett alle av prøven dråpe for dråpe på glimmer. Ved hjelp av en 100-200 ul spiss, spre prøven på hele overflaten av glimmer. Inkuber prøven på is i 3 min.
  6. Dekk glimmer arket dråpe for dråpe med 200 pl kald buffer-AFM (se tabell 1) og inkuberes i 1 time på is.
  7. Imaging i flytende
    1. Fjern forsiktig Buffer-AFM og vaske glimmer ark 3-4 tids med 200 pl kald buffer-AFM for å fjerne overskudd av sukrose. Deretter vaskes glimmer ark 3 ganger med kald vaskeoppløsning (se tabell 1), slik at det glimmer overflate dekket av noen mikroliter oppløsning.
    2. Gå til punkt 3 (Bilde oppkjøp).
  8. Imaging i luft
    1. fjerne Buffer-AFM forsiktig og vaske glimmer 3-4 ganger med 200 ul kald buffer-AFM for å fjerne overskudd av sukrose. Deretter vaske glimmer 3 ganger med kald vaskeoppløsning (se tabell 1) og drenere overflødig vann ved bruk av papir.
    2. La prøven til tørrhet under den kjemiske hette med toppen av petriskålen delvis åpen. Etter 2 timer, lukker petriskål og oppbevar ved romtemperatur. Måle prøven etter 2-3 timer som de er stabile i flere år.

3. Image Acquisition (15 min per bilde etter termisk stabilisering)

Note: Polysomes immobilisert på glimmer kan avbildes i luft eller i væske, ved hjelp av AC-modus.

  1. Fest glimmer til prøveholderen ved bruk av dobbeltsidig tape.
  2. Sett prøveholderen i AFM fasen etter produsentens anvisninger. Ved avbildning i væske, hvis mulig, forsøker å opprettholde prøven ved en temperatur lavere enn 25 ° C for å øke polysome stabilitet i tid.
  3. Velg en cantilever egnet for AC bildebehandling og montere det på spissen holder følge produsentens anvisninger. Her bruker bommene med kraft konstant mellom 2-20 N / m for luft bildebehandling og rundt 0,1 N / m for væske bildebehandling.
  4. Juster laser flekk på cantilever og nullstille kvadrant detektorsignalene.
  5. Velg et beleilig kjørefrekvens og drive cantilever med en amplitude på 10-20 nm.
  6. Approach prøven inntil spissen griper inn i overflaten.
  7. Velg en skanneområde 2x2 mikrometer, erverve minst 512x512 piksler (pixel bredde <4 nm), velger du en live bakgrunn subtraksjon modus og en Z skala fra 20-25 nm.
  8. Inspiser than bilde ser for tilstedeværelsen av runde gjenstander preget av høyden mellom 10 og 15 nm ved kjøp i luften og 25 og 30 nm når i flytende og bredden i området 25-30 nm. Juster skal og tilbakemeldinger parametre til skarpe gjenstander er visualisert. Bakgrunnen skal vises forholdsvis flat i gode eksempler, med noen 2-4 nm høyde gjenstander (se figur 2A og B).
  9. Hvis bildet ser bra ut (som angitt i punkt 3.8), skaffe flere (minst ti) 2x2 micron skanner ved ulike utvalgsområder.
  10. (valgfri). Om nødvendig, skaffe høyoppløselige bilder av utvalgte polysomes (se Figur 2C).
  11. Påfør programvarekorreksjoner (plan subtraksjon og line-by-line korreksjon algoritmer) for å korrigere AFM bilder fjerne vilkårlig tilt og drivende effekter.

4. Data Analysis (30 min per bilde)

  1. Eksportere bilder i ImageJ (valgfritt: bruke en skaleringsfaktor) preferentially bruker en tapsfri komprimering format, for eksempel TIFF-format (se figur 3A).
  2. Bruk ImageJ makroverktøysett RiboPick.ijm (som skal kopieres i ImageJ makro / verktøysett underkatalog) for å telle ribosomer i polysomes (se Figur 3B) og beregne statistiske egenskapene til prøven (se Figur 3C).
    1. Begynn å laste ned et bilde ved hjelp av <Les bilde> verktøy som initialiserer programmet.
    2. Plukk ribosom sentre med standard ImageJ <Point utvalg> verktøy (shift + venstreklikk gjør at multi-utvalg av ribosomer). Marker valgte ribosomer med <Marker ribosomer> verktøyet. Ribosom koordinatene vises i en egendefinert tekstvindu.
    3. Legg til flere ribosomer til samme polysome gjenta prosedyren angitt på det punktet 4.2.2.
    4. Fjern feilaktig merket ribosomer bruker <Angre siste pick> verktøy (starter å fjerne fra den siste lagt ribosom til den første212; i den aktuelle polysome eneste).
    5. Når polysome er ferdig, kan du bruke <Ny polysome> verktøyet. Som polysome nummeret er lagt til som et overlegg til bildet, blir tekstvinduet oppdatert.
    6. Bruk <Lagre resultater og nær> for å skrive ribosomet koordinerer fil (standard enheter av bildet blir brukt) og et PNG-bilde som oppsummerer plukket ribosomer og polysomes. Det opprinnelige bildet er stengt uten å lagres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sukrose gradient polysomal profilering av hele musen hjernen

Det er mulig å rense polysomes fra et cellulært lysat av polysomal profilering, som skiller makromolekyler i henhold til deres vekt og størrelse. Med polysomal profilering, cytoplasmatiske lysatene oppnådd fra dyrkede celler eller vev, slik som i dette eksemplet er lastet opp på en lineær sucrose-gradient og behandlet ved ultrasentrifugering for å separere fri RNA fra 40S og 60S subenheter, 80S ribosomer og polysomes i henhold til deres sedimenterings koeffisienter ( Figur 1 øvre panel). Absorbansen til prøven ved 254 nm og den fraksjonsoppsamling muliggjøre isoleringen av sukrose fraksjon anriket i ribosomene eller polysomes med forskjellig antall ribosomer pr transkript. De fraksjoner kan samles, alikvoteres for AFM avbildning og lagret ved -80 ° C (Figur 1nedre panel).

Native polysomes fra musehjerne observert av AFM i luft avsløre trange ribosom interaksjoner

Image oppkjøpet er utført ved hjelp AC-modus (også kjent som å trykke mode). Denne modaliteten er særlig egnet for avbilding av myke prøver (for eksempel polysomes) fordi spissen-prøven interaksjon og tilsvarende skjærkrefter er sterkt redusert. På denne måte både spissen og prøven blir bevart. AFM avbildning tillater innsamling av data med høy oppløsning, med eksakte verdier som er avhengige av forskjellige faktorer, som for eksempel målebetingelsene, den type av spissen, og egenskapene til prøven. I de betingelser som er beskrevet i denne artikkelen en lateral oppløsning på omkring 4-6 nm og en vertikal oppløsning på 0,1-0,2 nm er oppnåelige. Etter avsetning av sukrose porsjoner på glimmer, gir AFM beskrivelser av enkelt polysomes somvises som klynger av tettpakkede ribosomer (figur 2A, C og C). Ved å tverrsnitt analyse (figur 2D), er høyden av ribosomale topper rundt 14 nm i henhold til det som tidligere ble observert for humane ribosomer i polysomes etter lufttørking 27. Den senter til senter avstand på ribosomer som er identifisert ved linjeprofil er 23 nm, som er i overensstemmelse med dimensjonene av ribosomer i oppløsning 37, 38.

Antallet ribosomer pr polysome fra en enkelt fraksjon viser et mono-dispergert fordeling

Figur 3A rapporterer en typisk AFM bilde oppnås ved å skaffe en prøve absorbert på glimmer fra en fraksjon av sakkarose-gradient. Det innfelte viser en digital zoom av et enkelt polysome, med en forstørrelsesfaktor som er egnet for identifisering av ribosomes i polysome. Panel B viser det samme bildet etter ribosomet identifikasjon med RiboPick makro. Røde sirkler (se innfelt) markerer ribosomer, og en progressiv nummer (cyan) brukes til å hjelpe foreningen av ribosomet koordinerer med en bestemt polysome. Frekvensfordelingen av antallet ribosomer pr polysome ble analysert for fraksjon # 10 (Se Figur 1, nedre panel, tilsvarende midlere molekylvekt polysomes (MMW)), som klart viser en enkelt topp (panel C, grå søyler). Den eksperimentelle distribusjons var utstyrt med en Gauss-kurve (svart linje) som var sentrert på 5,8 ribosomer / polysome, med et standardavvik på 1,3 ribosomer / polysome.

Figur 1
Figur 1. Representant absorbans profil for sukrose gradient sedimentering av hele musen hjernen. (Øvre panel) En polysomal cytoplasmatisk lysat ble oppnådd fra P27 musehjerne og applisert på en lineær sucrose-gradient (15-50% sukrose [w / v]). Det er mulig å observere tydelige topper tilsvarende absorbans ved 254 nm av RiboNucleoParticles (RNP), ribosomale subenheter (40S og 60S), ribosomer (80-tallet) og polysomes. For å unngå gjentatte fryse og tine sykluser av prøvene før AFM avsetning på glimmer, er det praktisk å dele inn i porsjoner både ribosom brøk og polysomal fraksjoner (nedre panel) med ulikt antall ribosomer pr transkripsjon (dvs. lav, middels og høy -molecular vekt polysomes (LMV, MMW, og HMV, henholdsvis)). Alikvotene kan oppbevares ved -80 ° C så lenge som to år.

Figur 2
Figur 2. Bilder av hjerne polysomes ved å tappe-modus Atomic Force Mikros. (A) Eksempel på AFM bilde av MMW hjerne polysomes etter absorpsjon på glimmer etter lineær grå fargeskala. (B) Det samme bildet vises i (A) er avbildet ved hjelp av en annen Z-områder for fargeskalaen: 0-0,5 nm grå for bakgrunnen, 0,5-2 nm, og 2-10 nm gule for ribosomer. I dette tilfelle et bedre visuell kontrast oppnås for både lave og høye Z gående stedene. (C) Forstørrelse av en typisk MMW polysome med tverrsnitt profil (stiplet hvit linje). (D) Høyde profil av to ribosomer definert av tverrsnittsprofil i (C) viser ribosom høyde på 14 nm. Denne verdien er kompatibel med det som tidligere er observert i AFM for menneske ribosomer i polysomes 27.

Figur 3
Figur 3. Eksempel på å telle antallet ribosomer pr polysome i MMW hjerne polysomes. (A) AFM bilde som representerer input av ImageJ makro, RiboPick. (B) Etter manuelt plukke hver ribosomer pr polysome, RiboPick merkene i bildet posisjonen til hver ribosom (røde sirkler). (C) Den oppnådde antallet ribosomer pr polysomes kan plottes som en fordeling som kan utstyres med en gaussisk kurve. Antallet polysomes vurderes i dette eksempel er 164, erholdt fra 9 uavhengige bilder. Beslaget med Gauss-kurven returnerer gjennomsnittsverdien av befolkningen i polysomes i MMW fraksjonen (# ribosomer / polysome 5,8 ± 1,3, R 2 = 0,99).

<tr>
buffer sammensetning Søknad
lysis Buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 Utarbeidelse av lysat (1,1)
10 mM NaCl
10 mM MgCl2
1% Triton-X100
1% Na-deoxycholate
0,4 U / ml RNase Inhibitor
1 mM DTT
0,2 mg / ml cykloheksimid
5 U / ml DNase
50% sukrose-løsning 50% (vekt / volum) sukrose i Sakkarose-gradient preparat (1,2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
15% sukrose-løsning 15% (vekt / volum) sukrose i Sakkarose-gradient preparat (1,2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
nikkel Solution 1 mM NISO 4 Prøvepreparering for AFM (2)
Buffer-AFM 100 mM NaCl Prøvepreparering for AFM (2)
10 mM MgCl2
100 ug / ml cykloheksimid
10 mM Hepes
3% (vekt / volum) sukrose, pH = 7,4
vasking Solution DEPC-Water Prøvepreparering for AFM (2)
100 ug / ml cykloheksimid

Tabell 1. buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etter hvert som DNA-strukturen ble vist seg å være av største viktighet for å beskrive prosessen av transkripsjon og som organisering av kromatin utvidet vår forståelse av transkripsjonen kontroll av genekspresjon, er det viktig å analysere organiseringen og strukturen av polysomes å forbedre sant forståelse av oversettelse og regulering.

Med den beskrevne protokoll, en optimal tetthet av polysomes forsiktig immobilisert på en flat overflate, egnet for avbildning AFM oppnås. Ved hjelp av disse forholdene med praktisk forberedt prøver, kan nesten 50 polysomes timen bli kjøpt opp, klar for videre analyser og karakterisering. Dessuten har tørkede prøver lagret ved RT vist seg å være egnet for avbildning etter mer enn ett år.

For å kunne oppnå polysome bilder med vår protokoll, er det noen avgjørende skritt: å bruke vev som har blitt skikkelig flash-frosset umiddelbart etter dissection og lagret ved -80 ° C for å minimalisere RNA-degradering; å bruke lyseringsbuffer som inneholdt cykloheksimid og RNase inhibitorer for å unngå ribosom dissosiasjon fra mRNA; å utføre alle inkuberinger på is i løpet av prøven avsetning på glimmer; og ved fremstilling av prøven for AFM avbildning på luft, for i stor utstrekning å vaske prøven på glimmer med buffere og RNase-fritt vann i nærvær av cykloheksimid. Det siste punktet er spesielt viktig. Hvis bildet ser ut til å inneholde glatte flater på omtrent riktig høyde, men 100-1.000 nm bred, er dette en klar indikasjon på en dårlig vasket prøve (ofte ribosomer / polysomes kan likevel observert som svake, innebygde objekter). En metode for å løse dette problemet er å gjenta vaskeprosedyren, men dette betyr vanligvis ikke redusere problemet på en allerede tørket prøve. I dette tilfelle er det verdt å starte på nytt med en ny alikvot.

Gitt oppløsning på AFM, kan denne metoden for å studere polysomes ikke løse strukturelle detaljer om ribosomale grensesnitt i polysomes. Faktisk er AFM en komplementær og enklere tilnærming til Cryo-EM, som representerer en effektiv og robust teknikk, erverve og analysere tusenvis av polysomes, og bedre forstå den generelle ribosom organisasjonen i polysomes. Viktigere, har denne protokollen den unike fordelen av å identifisere filamenter som er kompatible med RNA 27. Denne samme fremgangsmåte kan benyttes for en hvilken som helst polysomal prøve erholdt fra en hvilken som helst biologisk vev eller cellelinje. Enda viktigere er det kan også med hell anvendes for å oppnå transkripsjon spesifikk informasjon ved hjelp av in vitro-translasjonssystemer, som nylig demonstrert ved Lauria og medarbeidere 35. Denne metodikken vil bane vei for flere eksperimenter, å få forståelse av kinetikken polysome formasjon eller endringer i polysome organisasjon under ulike cellulære eller vev forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics