Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De translatiemachinerie, dwz de polysoomdisplay of polyribosome, is één van de grootste en meest complexe cytoplasmatische machines in cellen. Polysomen, gevormd door ribosomen, mRNA's, een aantal eiwitten en niet-coderende RNA's, vertegenwoordigen geïntegreerde platforms waar de translationele controles plaatsvinden. Echter, terwijl het ribosoom is op grote schaal onderzocht, de organisatie van polysomen ontbreekt nog uitgebreide kennis. veel inspanning is dus noodzakelijk om polysoomdisplays organisatie en elk nieuw mechanisme van translationele controlesignalen die worden ingesloten helderen. Atomic force microscopie (AFM) is een soort van scanning probe microscopie dat de overname van 3D-beelden op nanoschaal resolutie maakt. Vergeleken met elektronenmicroscopie (EM) techniek, een van de belangrijkste voordelen van AFM dat duizenden beelden zowel in lucht en in oplossing te verwerven, zodat het monster onder dichtbij fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd zonder enige noodzaak voor het kleuren en vaststelling proprocedures. Hier is een gedetailleerd protocol voor de zuivering van nauwkeurig polysomen van muizenhersenen en hun depositie op substraten mica beschreven. Dit protocol maakt polysoomdisplays beeldvorming in lucht en vloeistof met AFM en de wederopbouw driedimensionale objecten. Complementair aan cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), kan de voorgestelde methode gemakkelijk worden gebruikt voor het systematisch analyseren polysomen en het bestuderen van hun organisatie.

Introduction

De synthese van eiwitten is de meeste energie verbruikende proces cellen 1,2. Daarom is het niet verwonderlijk dat eiwit abundanties voornamelijk gecontroleerd op de translatie in plaats van transcriptie niveau 3,4,5. De polysoom is de fundamentele macromoleculaire component die de mRNA informatie in functionele eiwitachtige uitlezingen omgezet. Polysomen zijn tot nu toe beschouwd als macromoleculaire complexen waar verschillende translationele controles samenkomen 6-13. Ondanks honderden studies over ribosoom structuur 14- 16, heeft de gedetailleerde moleculaire inzicht in de dynamiek van de vertaling en de topologie van polysomen een beperkt belang aangetroffen. Als gevolg daarvan, de organisatie van de inheemse polysomale ribonucleoproteïne complex en de mogelijke gevolgen daarvan voor vertalingen zijn nog vrij onduidelijk kwesties. Polysomen kan nog onbekend besteld en functionele organisaties verbergen, potentieel spiegelen wat nucleosomen en epigenetische controls zijn vertegenwoordigd voor het veld transcriptie. Uit het onderzoek van deze intrigerende hypothese vereist bijkomende studies en nieuwe technische benaderingen. In deze lijn, kunnen structurele technieken en atomic force microscopy vruchtbaar samenwerken om nieuwe mechanismen ontrafelen voor de controle van genexpressie, vergelijkbaar met wat werd bereikt voor de nucleosoom 17,18.

Sinds de ontdekking van het ribosoom 14-16, is de structuur uitgebreid gekarakteriseerd in prokaryoten 19,20, gist 21 en meer recent in humane 22, die de moleculaire beschrijving van de mechanismen die aan de basis van eiwitsynthese. Polysomen werden initieel opgenomen op het membraan van het endoplasmatisch reticulum, de vorming van typische 2D geometrische organisaties 14. Zoals eerder vermeld, heeft polysoomdisplay montage niet vatbaar constante belang als ribosoomstructuur geweest. In het verleden zijn polysomen werden voornamelijk bestudeerd door transmission EM-gebaseerde technieken. Pas onlangs, cryo-EM technieken kon de 3D-reconstructie van gezuiverd polysomen van in vitro translatie-systemen 23-26, menselijke cellulaire lysaten 27 of in cellen 28. Deze technieken bood meer verfijnde informatie over de ribosoom-ribosoom organisatie polysomen 23, 26-28 en een eerste moleculaire beschrijving van de contactoppervlakken van aangrenzende ribosomen in tarwekiemen polysomen 24. Zo cryo-EM tomografie maakt de openbaarmaking van ribosoom-ribosoom interacties met moleculaire detail, maar het wordt belast door uitgebreide post-processing en wederopbouw analyses die zware computationele middelen nodig voor gegevensverwerking. Bovendien zou de moleculaire details van ribosoom-ribosoom interacties te verkrijgen, een hoogst vastbesloten kaart van het ribosoom vereist en dergelijke referentie ribosoom is alleen beschikbaar voor enkele soorten. Belangrijk is cryo-EM tomografie is niet in staat om gratis RNA te detecteren. Thereferts worden nieuwe technieken die nodig zijn om de organisatie van de vertaling machines volledig te begrijpen.

Naast cryo-EM, is de AFM is ook gebruikt als een nuttig hulpmiddel voor directe beeldvorming van polysomen in lagere eukaryoten 29-33 en mensen 27. Vergeleken met EM, AFM vereist geen monster fixatie of de etikettering. Bovendien kunnen metingen worden uitgevoerd in de buurt van fysiologische omstandigheden en met de unieke mogelijkheid om duidelijk te identificeren zowel ribosomen en naakt RNA strengen 27 uitgevoerd. Beeldvorming van enkele polysomen kan relatief snel worden uitgevoerd, het verkrijgen van duizenden beelden op nano-resolutie met weinig post-processing inspanning in vergelijking met de uitgebreide en zware post-processing en wederopbouw analyses vereist door cryo-EM microscopie. Consequently, AFM data verwerking en analyse niet duur werkstations en hoge rekenkracht nodig hebben. Als zodanig is deze techniek verzamelt informatie over polysomale uniek morfologische kenmerken (zoalshoogte, lengte en breedte), ribosoom dichtheden is de aanwezigheid van vrije RNA en het aantal ribosomen per polysoomdisplays 27 met een hoger debiet dan cryo-EM. In een dergelijke manier, AFM staat voor een krachtige en complementaire aanpak van EM technieken om polysomen 27 portretteren.

Hier presenteren we een volledige pijpleiding van zuivering tot data-analyse, waar AFM wordt toegepast op de afbeelding en analyseren muizenhersenen polysomen. De voorgestelde protocol gericht op zuivering kwesties en de nauwkeurige afzetting van polysomen op mica substraten die worden gebruikt voor AFM beeldvorming. In aanvulling op de conventionele analyse van deeltjes die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd met gangbare software wordt gebruikt door de AFM gemeenschap, een ImageJ 34 plugin, genaamd RiboPick, wordt gepresenteerd voor het tellen van het aantal ribosomen per polysoomdisplays 27, 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het wordt gebruikt om de muis weefsels te verkrijgen praktijken werden goedgekeurd door het orgaan voor de bescherming van dieren (OPBA) van de Universiteit van Trento (Italië), protocol nr. 04-2015, volgens Art.31 wetsdecreet nr. 26/2014. Alle muizen werden op het modelorganisme Facility van het Centre for Integrative Biology (CIBIO), Universiteit van Trento, Italië onderhouden.

Let op: Om RNA degradatie van de monsters te voorkomen, bereiden alle buffers met behulp van DEPC behandeld water voor het minimaliseren van RNase besmetting.

1. Bereiding van polysomen van Whole Brains

  1. Verzamelen hersenweefsel (15 min)
    1. Euthanaseren wild-type muis stam C57BL / 6 met CO 2 stikken gedurende 5 min 36. Ontleden voorzichtig de hersenen uit de schedel 36, plaatst het weefsel in een 1,5 ml buis en meteen plaats het in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Bereiding van lysaat (30 min)
    1. Verpulveren de hele hersenweefsel met behulpeen vijzel onder vloeibare stikstof.
    2. Breng ongeveer 25 mg poeder een koude microcentrifugebuis onmiddellijk voeg 0,8 ml lysisbuffer (zie tabel 1) en verstoren de cel (het ontdooien van de verpulverde weefsel te voorkomen) door op en neer pipetteren 25 keer snel.
    3. Centrifugeer de buis bij 12.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C om celresten te pelleteren.
    4. Breng de supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis en houden de buis op ijs gedurende 15 min.
    5. Centrifugeer de buis bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C kernen en mitochondriën te pelleteren.
    6. Breng de supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis.
    7. Bewaar het supernatant bij -80 ° C maximaal 6 maanden gebruik ze onmiddellijk.
  3. Sucrosegradiënt centrifugering preparaat en (2 uur en 30 min)
    1. Was de ultracentrifuge buizen uitgebreid met RNase-vrij water (diethylpyrocarbonaat behandeld water (DEPC-water) of commercieel) eend 3% H 2 O 2 / DEPC H2O oplossing.
    2. Zet de buizen op ijs en voeg 5,5 ml koude 50% sucrose oplossing onder aan elke buis (zie tabel 1 voor sucrose toegevoegd). Voeg voorzichtig de 15% sucrose oplossing druppelsgewijs blijven dicht bij de interfase om een ​​scherpe interfase behouden, totdat de buis volledig is gevuld. Wanneer de buis volledig is gevuld, sluit met een rubberen stop aan luchtbelvorming voorkomen.
    3. In een koude ruimte voorzichtig leggen de buizen horizontaal en hou het in deze positie gedurende 2 uur. Na deze tijd, langzaam strek de buizen terug in de verticale positie en leg ze op ijs. De hellingen zijn nu klaar om te worden gebruikt. Als alternatief, de voorbereiding van de 15-50% sucrose gradiënt met behulp van een conventionele gradient voormalig.
    4. In een koelruimte Haal 1,0 ml van de top van de gradiënt en de overlay sucrose druppelsgewijs met de cytosolische lysaat (dat wil zeggen, de bovenstaande vloeistof verkregen in step 1,2).
    5. laat de buizen voorzichtig in de emmers van swinging bucket rotor. Centrifugeer de gradiënten van 100 min bij 180.000 xg bij 4 ° C onder toepassing van een ultracentrifuge.
    6. Na het centrifugeren, laat de buizen in hun bakken gedurende 20 minuten bij 4 ° C te laten verlopen stabiliseren.
  4. Sucrosegradiënt fractionering (2 uur)
    1. Haal een ultracentrifuge buis van de ultracentrifuge rotor en monteren op de collector-inrichting van een dichtheidsgradiënt fractionering System. Verzamel 1 ml fracties volgen van de absorptie bij 260 nm met een UV / VIS detector (zie figuur 1 bovenste paneel). Houd de verzamelde fracties op het ijs.
    2. Aliquots van 30-40 ul van de fracties van belang, bewaar ze op ijs alvorens ze op te slaan bij -80 ° C tot gebruik. Gebruik geen monsters of sucrose fracties die meer dan twee invriezen-ontdooien cycli ondergingen (zie figuur 1 onderste paneel).
    </ Li>

2. Monstervoorbereiding voor Atomic Force Microscopy (3 uur)

  1. Met behulp van tape, schil van de mica vellen.
  2. Was de mica vellen 3-4 keer met DEPC-water en plaats deze in een kleine petrischaal. Dan droog het oppervlak met behulp van lucht.
  3. Bedek de mica met 200 ui 1 mM NiSO 4 en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de nikkel-oplossing en daarna droog het oppervlak met behulp van lucht. Voer alle toekomstige stappen bij 4 ° C door het plaatsen van de petrischaal met de mica op het ijs.
  5. Dooi een hoeveelheid verkregen in 1.4.2 op ijs en voorzichtig al het monster druppel toevoegen door druppel op het mica. Met behulp van een 100-200 pi tip, verspreid het monster op het gehele oppervlak van het mica. Incubeer het monster op ijs gedurende 3 min.
  6. Bedek de micablad druppelsgewijs met 200 ul koude buffer-AFM (zie tabel 1) en incubeer gedurende 1 uur op ijs.
  7. Imaging in vloeibare
    1. Verwijder zorgvuldig de Buffer-AFM en was de mica vellen 3-4 tijds met 200 ul koud Buffer-AFM om overtollig sucrose te verwijderen. Was daarna de mica platen 3 maal met koude Washing Solution (zie tabel 1), waarbij het ​​mica oppervlak met enkele microliter oplossing.
    2. Ga naar punt 3 (Afbeelding acquisitie).
  8. Beeldvorming in de lucht
    1. Haal de Buffer-AFM en was de mica 3-4 keer met 200 ul koud Buffer-AFM om de overmaat sucrose te verwijderen. Vervolgens was de mica 3 keer met koude Washing Solution (zie tabel 1) en laat het overtollige water met behulp van papier.
    2. Laat het monster gedroogd onder de chemische kap met de bovenkant van de petrischaal gedeeltelijk open. Na 2 uur, sluit de petrischaal en bewaar bij kamertemperatuur. Meet het monster na 2-3 uur omdat ze stabiel zijn voor jaren.

3. Image Acquisition (15 min per beeld na thermische stabilisatie)

Noot: polysomen geïmmobiliseerd op mica kunnen worden afgebeeld in lucht of vloeistof, via de AC modus.

  1. Bevestig de mica om de monsterhouder met dubbelzijdig tape.
  2. Schuif de monsterhouder in de AFM etappe volgende aanwijzingen van de fabrikant. Bij beeldvorming in vloeibare, indien mogelijk, proberen het monster op een temperatuur lager dan 25 ° C te polysoomdisplays stabiliteit te verhogen.
  3. Selecteer een cantilever geschikt voor AC beeldvorming en monteren op de tip houder volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Hier, gebruik uitkragingen met geweld constant tussen 2-20 N / m voor de lucht imaging en rond 0,1 N / m voor vloeibare beeldvorming.
  4. Stel de laser plek op de cantilever en nul het kwadrant detector signalen.
  5. Selecteer een geschikt rijden frequentie en rijd de cantilever met een amplitude van 10-20 nm.
  6. Benader het monster totdat de punt aangrijpt op het oppervlak.
  7. Selecteer een scan gebied van 2x2 micrometer, het verwerven van minstens 512x512 pixel beelden (pixel breedte <4 nm), selecteert u een live achtergrond aftrekken modus en een Z-schaal van 20-25 nm.
  8. inspecteren thij kijken voor de aanwezigheid van ronde voorwerpen gekenmerkt door de hoogte tussen 10 en 15 nm bij het verwerven luchtmengsel en 25 en 30 nm wanneer in vloeibare en de breedte in het bereik van 25-30 nm. Stel het setpoint en feedback parameters tot scherpe voorwerpen worden gevisualiseerd. De achtergrond moet relatief vlak in goede monsters verschijnen enkele 2-4 nm hoogte voorwerpen (zie figuur 2A en B).
  9. Als het beeld ziet er goed uit (zoals vermeld in punt 3.8), het verwerven van een aantal (minstens tien) 2x2 micron scans op verschillende sample gebieden.
  10. (Optioneel). Indien nodig, het verwerven van hoge resolutie beelden van de geselecteerde polysomen (zie Figuur 2C).
  11. Solliciteer software correcties (vliegtuig aftrekken en lijn per lijn correctie algoritmes) aan de AFM beelden verwijderen van willekeurige tilt en drijven effecten te corrigeren.

4. Data-analyse (30 min per beeld)

  1. afbeeldingen Export in ImageJ (optioneel: breng een schaal factor) preferentially met een lossless compressie formaat, bijvoorbeeld de TIFF-formaat (zie figuur 3A).
  2. Gebruik de ImageJ macro toolset RiboPick.ijm (in de ImageJ macro / toolset subdirectory moet worden gekopieerd) aan ribosomen in polysomen (zie figuur 3B) tellen en berekenen statistische eigenschappen van het monster (zie figuur 3C).
    1. Start het laden van een afbeelding met behulp van de <image lezen> tool die het programma geïnitialiseerd.
    2. Pluk het ribosoom centra met de standaard <selectie Point> ImageJ gereedschap (shift + linker muisknop kan de multi-selectie van ribosomen). Markeer de geselecteerde ribosomen met de <Mark ribosomen> tool. Ribosoom coördinaten zal verschijnen in een aangepaste tekst venster.
    3. Voeg meer ribosomen dezelfde polysoomdisplays herhalen van de procedure aangegeven in het punt 4.2.2.
    4. Verwijder ten onrechte gemarkeerd ribosomen met behulp van de <Undo laatste pick> gereedschap (begint het verwijderen van de laatst toegevoegde ribosoom aan de eerste212; in de huidige polysoomdisplays alleen).
    5. Wanneer de polysoom is voltooid, gebruikt u de <New polysoomdisplays> tool. Aangezien het polysoom wordt toegevoegd als een overlay aan het beeld, wordt het tekstvenster bijgewerkt.
    6. Gebruik de <Resultaat opslaan en in de buurt> te schrijven het ribosoom coördineert een PNG-afbeelding die de geplukt ribosomen en polysomen een samenvatting van het bestand (de standaard eenheden van het beeld worden gebruikt) en. Het originele beeld is gesloten zonder te worden opgeslagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sucrosegradiënt polysomale profilering van de hele hersenen van muizen

Het is mogelijk om polysomen zuiveren van een cellulair lysaat door polysomale profielen om macromoleculen scheidt volgens hun gewicht en grootte. Met polysomale profilering, cytoplasmatische lysaten verkregen uit gekweekte cellen of weefsels, zoals in dit voorbeeld, worden geladen op een lineaire sucrosegradiënt en verwerkt door ultracentrifugatie van vrij RNA van 40S en 60S subeenheden, 80S ribosomen en polysomen scheiden volgens hun sedimentatie coëfficiënten ( Figuur 1 bovenste paneel). De absorptie van het monster bij 254 nm en de fractieverzameling kan de isolatie van de sucrose verrijkte fractie ribosomen of polysomen met een verschillend aantal ribosomen per transcript. De fracties worden verzameld, in monsters verdeeld AFM beeldvorming en bewaard bij -80 ° C (Figuur 1onderste paneel).

Inheemse polysomen van muizenhersenen waargenomen door de AFM in de lucht te onthullen strakke ribosoom interacties

Afbeelding overname wordt uitgevoerd met behulp van AC-modus (ook bekend als tapping mode). Deze modaliteit is vooral geschikt voor beeldvorming van zachte monsters (zoals polysomen) omdat de tip-sample interactie en de bijbehorende schuifkrachten aanzienlijk verminderd. Op deze wijze zowel de punt als het monster worden bewaard. AFM beeldvorming wordt overgenomen gegevens met hoge resolutie, met exacte waarden hangen af ​​van verschillende factoren, zoals de meetomstandigheden, de aard van de tip en de eigenschappen van het monster. In de in dit artikel beschreven omstandigheden een laterale resolutie van ongeveer 4-6 nm en een verticale resolutie van 0,1-0,2 nm haalbaar zijn. Na de afzetting van sucrose porties op mica, AFM biedt beschrijvingen van enkele polysomen datverschijnen als clusters van dicht opeengepakte ribosomen (Figuur 2A, C en C). Door dwarsdoorsnede analyse (Figuur 2D), de hoogte van ribosomale pieken ongeveer 14 nm in overeenstemming met wat eerder werd waargenomen voor menselijke ribosomen in polysomen na luchtdroging 27. De hart op hart afstand van ribosomen geïdentificeerd door de lijn profiel is 23 nm, wat in overeenstemming is met de afmeting van ribosomen in oplossing 37, 38.

Het aantal ribosomen per polysoomdisplays uit één fractie laat een mono gedispergeerde verdeling

Figuur 3A meldt een typisch beeld AFM verkregen door het verkrijgen van een monster geabsorbeerd op mica uit een fractie van de sucrosegradiënt. De inzet toont een digitale zoom van een enkele polysoom, met een vergroting factor die geschikt zijn voor de identificatie van RibosOMES in de polysoomdisplays. Paneel B toont dezelfde afbeelding na het ribosoom identificatie met de RiboPick macro. Rode cirkels (zie inzet) markeren de ribosomen, en een progressief nummer (cyaan) wordt gebruikt om de associatie van de ribosoom coördineert met een specifiek polysoom. De frequentieverdeling van het aantal ribosomen per polysoomdisplays werd geanalyseerd fractie # 10 (zie Figuur 1, onderste paneel, corresponderend met middelmatig molecuulgewicht polysomen (MMW)), waaruit duidelijk blijkt een enkele piek (Paneel C, grijze balken). De experimentele verdeling werd voorzien van een Gauss-curve (zwarte lijn), die werd gecentreerd op 5,8 ribosomen / polysoomdisplays, met een standaarddeviatie van 1,3 ribosomen / polysoomdisplays.

Figuur 1
Figuur 1. Representatieve profiel absorptie van sucrose gradiënt sedimentatie van de hele hersenen van muizen. (Boven panel) Een polysomale cytoplasmatisch lysaat werd verkregen van P27 muizenhersenen en op een lineaire sucrosegradiënt (15-50% sucrose [w / v]). Het is mogelijk om duidelijke pieken die overeenkomen met de absorptie bij 254 nm van RiboNucleoParticles (RNP), ribosomale subeenheden (40S en 60S), ribosomen (80S) en polysomen observeren. Om herhaalde vries en dooicycli vermijden van monsters vóór AFM depositie op mica, is het handig om te splitsen in aliquots zowel ribosomale fractie en fracties polysomale (onderste paneel) met een verschillend aantal ribosomen per transcript (dat wil zeggen, lage, midden- en hoge -Molecular-weight polysomen (LMW, MMW en HMW, respectievelijk)). De monsters kan zolang twee jaar bewaard bij -80 ° C.

figuur 2
Figuur 2. Afbeeldingen van de hersenen polysomen door te kloppen-Mode Atomic Force Microscopy. (A) Voorbeeld AFM beeld van MMW hersenen van polySomes na absorptie op mica met behulp van een lineaire grijze kleur schaal. (B) Hetzelfde beeld getoond in (A) wordt weergegeven met een andere Z-series in de kleurenschaal: 0-0,5 nm grijs voor de achtergrond, 0,5-2 nm en 2-10 nm geel voor ribosomen. In dit geval een betere visuele contrast wordt verkregen voor zowel lage als hoge Z-range objecten. (C) Vergroting van een typische MMW polysoom met doorsnede profiel (gestippelde witte lijn). (D) Lengte profiel van twee ribosomen gedefinieerd dwarsdoorsnedeprofiel in (C) toont ribosoom hoogte van 14 nm. Deze waarde is compatibel met wat eerder waargenomen in AFM voor menselijke ribosomen in polysomen 27.

figuur 3
Figuur 3. Voorbeeld van het tellen van het aantal ribosomen per polysoomdisplays in MMW hersenen polysomen. (A) image AFM dat vertegenwoordigt de ingang van de ImageJ macro, RiboPick. (B) Na elke ribosomen per polysoomdisplays, RiboPick tekens handmatig plukken in het beeld de positie van elk ribosoom (rode cirkels). (C) Het verkregen aantal ribosomen per polysomen kan worden uitgezet als distributie die kan worden uitgerust met een Gauss-curve. Het aantal polysomen als in dit voorbeeld 164 verkregen uit 9 onafhankelijke beelden. De montage met de Gauss-curve geeft de gemiddelde waarde van de bevolking van polysomen in de MMW fractie (# ribosomen / polysoomdisplays 5,8 ± 1,3, R 2 = 0,99).

<tr>
Buffer Samenstelling Toepassing
lysis Buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 Bereiding van lysaat (1,1)
10 mM NaCl
10 mM MgCl2
1% Triton-X100
1% Na-deoxycholaat
0,4 U / ml RNase Inhibitor
1 mM DTT
0,2 mg / ml cycloheximide
5 U / ml DNase I
50% sucrose-oplossing 50% (w / v) sucrose in Sucrosegradiënt preparaat (1,2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
15% sucrose-oplossing 15% (w / v) sucrose in Sucrosegradiënt preparaat (1,2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
Nickel Solution 1 mM NiSO 4 Steekproef voorbereiding AFM (2)
Buffer-AFM 100 mM NaCl Steekproef voorbereiding AFM (2)
10 mM MgCl2
100 ug / ml cycloheximide
10 mM Hepes
3% (w / v) sucrose, pH = 7,4
Washing Solution DEPC-water Steekproef voorbereiding AFM (2)
100 ug / ml cycloheximide

Tabel 1. Buffers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De structuur van DNA werd bewezen van cruciaal belang voor het proces van transcriptie en de organisatie van de chromatinestructuur geavanceerde ons begrip van transcriptionele regulatie van genexpressie te beschrijven, is het essentieel om de organisatie en structuur van polysomen analyseren de waarheidsgetrouwe begrip verbeteren van de vertaling en de regelgeving.

Met de beschreven protocol, een optimale dichtheid van polysomen zacht geïmmobiliseerd op een vlak oppervlak, geschikt voor AFM beeldvorming wordt verkregen. Met behulp van deze voorwaarden geschikt bereid samples, kan bijna 50 polysomen per uur worden verworven, klaar voor verdere analyse en karakterisering. Bovendien gedroogde monsters bewaard bij kamertemperatuur bleken geschikt voor beeldvorming op meer dan één jaar.

Om succesvol polysoom beelden te verkrijgen met ons protocol, zijn er een aantal belangrijke stappen: op weefsels die goed werd snel bevroren onmiddellijk na gebruik dissection en bewaard bij -80 ° C om RNA degradatie te minimaliseren; de lysis buffer bevattende cycloheximide en RNase inhibitoren ribosoom dissociatie van mRNA voorkomen; alle incubaties op ijs in het monster depositie op mica voeren; en wanneer de monsterbereiding voor AFM beeldvorming op lucht, het monster zich was op het mica met buffers en RNase vrij water in de aanwezigheid van cycloheximide. Het laatste punt is bijzonder belangrijk. Als het beeld lijkt te gladde oppervlakken op ongeveer de juiste hoogte, maar 100-1000 nm breed bevatten, is dit een duidelijke indicatie van een slecht gewassen monster (vaak ribosomen / polysomen kan worden nog steeds waargenomen als zwakke, ingesloten objecten). Een methode om dit probleem op te lossen is om de wassen procedure herhalen, maar dit meestal niet het probleem te verzachten op een reeds gedroogde monster. In dit geval is het goed weer beginnen met een nieuw monster.

Gezien de resolutie van de AFM, kan deze methode voor het bestuderen van polysomen de struc niet oplossenrele details van de ribosomale interfaces in polysomen. In feite, AFM is een aanvullende en eenvoudiger benadering van cryo-EM, wat neerkomt op een effectieve en robuuste techniek te verwerven en analyseren van duizenden polysomen, en beter inzicht in de totale ribosoom organisatie polysomen. Belangrijk is dat dit protocol heeft het unieke voordeel van het identificeren van filamenten compatibel met RNA 27. Diezelfde procedure kan worden gebruikt voor elke polysomale monster verkregen uit een biologisch weefsel of cellijn. Belangrijker kan ook met succes worden toegepast om transcript-specifieke informatie via in vitro translatie worden uitgereikt, zoals onlangs aangetoond door Lauria en medewerkers 35. Deze methodologie zal de weg vrijmaken voor een aantal experimenten, om het begrip van de kinetiek van polysoomdisplays vorming of veranderingen in polysoom organisatie onder verschillende cellen of weefsels voorwaarden te krijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics