Immobilisering af Multi-biokatalysatorer i alginatkugler for cofaktor Regeneration og Forbedret Genbrugelighed

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Præsenteret er protokollen for co-immobilisering hel-celle biokatalysatorer til cofaktor regenerering og forbedret genanvendelighed, ved hjælp af produktion af L-xylulose som eksempel. Cofaktoren regenerering opnås ved kobling to Escherichia coli stammer, der udtrykker funktionelt komplementære enzymer; helcelle-biokatalysator immobilisering opnås ved celleindkapsling i calciumalginatperler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi har for nylig udviklet en enkel, genanvendelige og koblet hel-celle biokatalytisk systemet med evnen til cofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering til forbedret fremstilling udbytte og vedvarende syntese. Beskrevet hermed er den eksperimentelle procedure for udviklingen af et sådant system, der består af to E. coli-stammer, der udtrykker funktionelt komplementære enzymer. Sammen kan disse to enzymer fungere kooperativt at mediere regenerering af dyre cofaktorer til forbedring af produktudbyttet af bioreaktion. Desuden rapporteres fremgangsmåden til syntetisering en immobiliseret form af den koblede biokatalytiske system ved indkapsling af hele celler i calciumalginatperler. Som et eksempel, præsenterer vi den forbedrede biosyntesen af L-xylulose ud fra L-arabinitol ved kobling E. coli-celler, der udtrykker enzymerne L-arabinitol dehydrogenase eller NADH oxidase. Under optimale betingelser og under anvendelse af en initial koncentration på 150mM L-arabinitol, nåede den maksimale L-xylulose udbytte 96%, hvilket er højere end dem, der rapporteres i litteraturen. Den immobiliseret form af de koblede hel-celle biokatalysatorer viste god driftsstabilitet, vedligeholdelse 65% af udbyttet opnået i den første cyklus efter 7 cykler af successiv genbrug, mens det frie celle systemet næsten helt mistet den katalytiske aktivitet. Derfor metoder rapporteret her giver to strategier, som kunne hjælpe med at forbedre den industrielle produktion af L-xylulose samt andre tillægstjenester forbindelser kræver brug af cofaktorer i almindelighed.

Introduction

Reduktiv helcelle-biotransformation anvendelse af mikroorganismer er blevet en udbredt fremgangsmåde til kemo-enzymatiske syntese af kommercielt og terapeutisk vigtige biomolekyler 1 - 3. Den præsenterer en række fordele i forhold til brugen af isolerede enzymer, især afskaffelse af omkostningstunge downstream rensningsprocesser og demonstration af en forlænget levetid 4 - 7. For biokatalytiske veje hvor der kræves cofaktorer for produktdannelse, hel-celle-systemer har potentiale til at tilvejebringe in situ cofaktor regenerering via tilsætning af billige elektrondonerende co-substrater 5,8,9. Imidlertid er denne kapacitet formindskes til reaktioner, der kræver et støkiometrisk koncentration af sjældne eller dyre co-substrater 10 - 13. Sammen med dårlig genanvendelighed af hele celler, dette vanskeliggør etableringen af ​​en skalerbar og løbende produktion system. Strategiske modifikationer af hel-celle-systemer til disse cofaktor-afhængige biotransformation skal overvinde de førnævnte begrænsninger. Konkret har kombinationen af hel-celle biokatalysatorer, der arbejder kooperativt er vist signifikant at øge produktiviteten og stabiliteten af de nærede enzymer 14. Disse faktorer, som ofte kritiske for, at storstilet produktion af kommercielt levedygtige produkter, kan optimeres yderligere ved co-immobilisering biokatalytiske mikrober 15. Vi har for nylig udviklet en enkel og genbruges helcelle biokatalytisk system, der tillader både cofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering for L-xylulose produktion 16. I denne undersøgelse blev dette system anvendes som et eksempel for at illustrere de eksperimentelle procedurer anvendelsen af ​​disse to strategier til forbedret biotransformation produktionsudbyttet og biokatalysator genanvendelighed.

L-xylulose tilhører en class af biologisk nyttige molekyler opkaldt sjældne sukre. Sjældne sukkerarter er unikke monosaccharider eller sukkerderivater, der forekommer meget sjældent i naturen, men spiller afgørende roller som anerkendelse elementer i bioaktive molekyler 17,18. De har en række ansøgninger fra sødemidler, funktionelle fødevarer til potentielle terapeutika 19. L-xylulose kan anvendes som en potentiel inhibitor af flere a-glucosidaser, og kan også anvendes som en indikator for hepatitis eller levercirrose 17,20. Højeffektiv omdannelse af xylitol til L-xylulose i hel-celle-systemer er tidligere blevet rapporteret i Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701 B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 og Escherichia coli 26. I E. coli, blev det imidlertid kun opnås ved hjælp af lav (<67 mM) xylitol koncentrationer 26 på grund af potentielle hæmmende virkninger af en startkoncentration xylitol højere end 100 mm på xylitol-4-dehydrogenase aktivitet 21,26. Den termodynamiske ligevægt mellem xylulose og xylitol har vist sig at kraftigt favoriserer dannelsen af xylitol 25,27. Derudover er xylulose udbytte begrænset af mængden af dyre cofaktorer, der skal leveres i mangel af en in situ cofaktor regenerering system. Tilsammen udgør disse faktorer begrænse mulighederne for skalering til bæredygtige systemer til L-xylulose biosyntese.

For at overvinde disse begrænsninger og forbedre L-xylulose biotransformation udbytte blev strategien for cofaktor regenerering ansat først ved at etablere en koblet hel-celle biokatalytisk system. Specifikt L-arabinitol-4-dehydrogenase (EF 1.1.1.12) fra Hypocrea jecorina (HjLAD), et enzym i L-arabinose kataboliske pathway af svampe, blev udvalgt til at katalysere omdannelsen af L-arabinitol til L-xylulose 28,29 . Ligesom mange biosyntetiske enzymer, en større limitation af HjLAD er, at det kræver en støkiometrisk mængde af den dyre nikotinamidadenindinukleotid cofaktor (NAD + er den oxiderede form af NADH) at udføre denne omdannelse. NADH oxidase fundet i Streptococcus pyogenes (SpNox) har vist sig at vise high cofaktor-regeneration aktivitet 30,31. Ved at udnytte denne egenskab ved SpNox, E. coli-celler, der udtrykker HjLAD til produktion af L-xylulose blev koblet med E. coli-celler, der udtrykker SpNox til regenerering af NAD + til at øge L-xylulose produktion afbildet ved den koblede reaktion er vist i figur 1A. Under optimale betingelser og under anvendelse af en initial koncentration på 150 mM L-arabinitol, nåede den maksimale L-xylulose udbytte 96%, hvilket gør dette system meget mere effektiv end dem rapporteret i litteraturen.

Strategien med hel-celle-immobilisering blev anvendt næste for yderligere at forøge genanvendeligheden af ​​det koblede biocatalytic-system. Almindeligt anvendte metoder til hel-celle immobilisering omfatter adsorption / kovalent linker til faste matricer, cross-linking / indespærring og indkapsling i polymere netværk 32. Blandt disse fremgangsmåder er den mest egnede fremgangsmåde til celle immobilisering er indkapsling i calciumalginatperler. Deres milde geleringsegenskaber, inaktivt vandig matrix og høj porøsitet bidrage til at bevare de fysiologiske egenskaber og funktionalitet af de indkapslede biologiske 33. Derfor er den koblede biokatalysator indeholdende både E. coli celler indeholdende HjLAD eller SpNox blev immobiliseret i calcium alginat perler til at gøre det muligt for flere cykler af L-xylulose produktion (figur 2) .Den immobiliserede biokatalysator systemet viste god driftsstabilitet, vedligeholdelse 65% af konverteringen udbyttet af den første cyklus efter 7 cykler af successive genbrug, mens det frie celle systemet næsten helt mistet sin katalytiske aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. helcelle Biocatalysts Fremstilling

BEMÆRK: Det rekombinante E. coli celler indeholdende pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 er følgende benævnt E. coli SpNox og E. coli HjLAD henholdsvis.

  1. Inokulere en enkelt koloni af E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium suppleret med kanamycin (50 ug / ml) og inkuberes i en inkubator-ryster O / N ved 37 ° C, 250 rpm.
  2. Fortynd kulturen ved 1: 100 i 200 ml frisk LB indeholdende 50 ug / ml kanamycin og inkuberes ved 37 ° C, 250 rpm, indtil OD600 når ~ 0,6.
  3. Inducere HjLAD proteinekspression ved tilsætning af 0,1 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) til dyrkningsmediet, og der inkuberes ved 16 ° C, 180 rpm i 16 timer.
    1. Alternativt udføre induktion ved 25 ° C, 200 rpm i 6 timer, hvis L-xylulose-biosyntese (trin 2 nedenfor) udføres samme dag.
  4. Høst den inducerede E. coli HjLAD celler ved centrifugering ved 3.200 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og gå videre til trin 2 for at behandle cellepelleten.
  5. Parallelt hermed udføre trin 1,1-1,4 for E. coli SpNox.

2. Biosyntese af L-xylulose ved kobling E. coli HjLAD og E. coli SpNox for Cofactor Regeneration

  1. Resuspender cellepellets af E. coli HjLAD og E. coli SpNox separat i 50 mM Tris-HCI-buffer (pH 8,0) ved en celletæthed på 5,0 g tør cellevægt (gDCW) / L.
    Bemærk: En korrelation mellem gDCW og den optiske densitet målt ved 600 nm (OD 600) kan etableres for at lette eksperimentet. Den formel, der bruges idenne protokol er en gDCW / L = 0,722 * OD 600-,0965, som kan variere mellem forskellige spektrometre.
  2. Bland 600 pi 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 pi 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 pi 20 mM NAD +, og 150 pi 2 M L-arabinitol i en 14 ml rundbundet rør og bringe reaktionsvolumenet til 2 ml ved tilsætning af 550 pi 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) .
    Bemærk: Forholdet mellem de to helcelle biokatalysatorer mængde kan optimeres for at forbedre biosyntesen af ​​produktet. For det beskrevne system, et forhold på E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 viste sig at være optimalt for L-xylulose-biosyntese (figur 1B).
  3. Inkuber reaktionsblandingen ved 30 ° C, 200 opm i 8 timer.
  4. Opsaml supernatanten efter centrifugering ved 4 ° C, 3.200 x g i 10 min blev ennd fortsæt at kvantificere L-xylulose produktion som beskrevet i trin 3 nedenfor.

3. kolorimetrisk analyse for L-xylulose Kvantificering

  1. Aspirer 100 pi reaktionen supernatant opsamlet fra trin 2.4 i et 1,5 ml rør.
  2. Der tilsættes 50 pi 1,5% cystein, 900 pi 70% svovlsyre og 50 pi 0,1% carbazol opløst i ethanol og blandes forsigtigt ved at vende røret 3 gange.
  3. Inkuber reaktionsblandingen ved 37 ° C, 200 rpm i 20 min.
  4. Mål den optiske absorbans af reaktionsblandingen ved 560 nm (A 560) under anvendelse af et spektrofotometer.
    1. Fortynd reaktionsblandingen hvis A 560 læsning er over 1.

4. Immobilisering af rekombinante helcelle Katalysatorer i calciumalginatperler

  1. Opløs 4 g natriumalginat i 100 ml destilleret vand. Forbered alginatopløsning ved tilsætning sodium alginat til vand for at undgå dannelse af klumper. Opvarm blandingen, hvis nødvendigt.
  2. Tilsættes 600 pi of 5.0 gDCW / L E. coli HjLAD og 600 pi of 5.0 gDCW / L E. coli SpNox i 1,2 ml 4% alginat forberedt i trin 4.1 og bland cellerne og alginat ved forsigtig pipettering at undgå bobledannelse.
  3. Aspirer alginat / cellesuspensionen ind i en sprøjte ved anvendelse af en nål og tilsæt blandingen dråbevis til en 0,3 M calciumchlorid (CaCl2) opløsning i et 100 ml bægerglas under kontinuerlig omrøring.
    Bemærk: Mængden af CaCl2 opløsning, der anvendes til alginatkugle dannelse burde være nok for alginat dråberne at være fuldstændig neddykket. Desuden skal afstanden mellem kanylen og overfladen af ​​calciumchloridopløsningen holdes inden for et optimalt område for at sikre dannelse af ensartet sfæriske perler. Den optimale afstand rækkevidde kan bestemmes eksperimentallierede og afhænger af den indre diameter af nålen. Som et skøn blev en afstand på ~ 15 ± 5 cm sig at være optimal for en 0,6 cm (indre diameter) sprøjtenål.
  4. Efterlad perlerne i CaCl2-opløsning til 2 - 3 timer ved stuetemperatur uden omrøring for at tillade tværbinding og gelperler formation.
  5. Dekanteres CaCl2 opløsning uden at forstyrre perlerne ved forsigtigt at hælde CaCl2 opløsning i en 50 ml konisk rør, og overføre de resterende perler i CaCl2-opløsning til en anden 50 ml konisk rør.
  6. Vask perlerne med 10 ml 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) puffer tre gange for at fjerne overskydende CaCl2 og un-indkapslede celler.
    NOTE: På et givet trin, ikke centrifugeres perlerne som dette vil sprænge dem. For at adskille perlerne fra opløsning, tillader suspensionen henstå uforstyrret i 3 - 5 min. Perlerne vil sig på bunden og vaskepufferen kan dekanteresi en anden beholder.
    1. Smid ikke den brugte vaskebuffer. Samle de anvendte Tris-HCI vaskebuffer (30 ml) med den brugte CaCl2 opløsning opsamlet fra trin 4.5.
  7. Pelletering af un-immobiliserede E. coli-celler ved centrifugering af poolede CaCl2 og Tris-HCI-opløsning opsamlet fra trin 4.6 ved 3.200 xg i 20 min. For at bestemme forankringseffektiviteten, beregne densiteten af ​​de pelleterede un-indkapslede celler i gDCW / l som beskrevet i trin 2.1.
  8. Overfør de vaskede perler fra trin 4.6 til et rør. Følg trin 2.2 - 3.4 at evaluere L-xylulose biosyntese ved hjælp af alle de vaskede perler i stedet for cellepellets.

5. Stabilitet Assay af immobiliseret Biocatalysts for L-xylulose Production

  1. Indsamle perlerne fra trin 4.8 og vaskes to gange med 10 ml 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) puffer uden centrifugering (som beskrevet i trin 4.6).
  2. Brug alleaf de vaskede perler at udføre reaktionen som beskrevet i trin 2.2 - 3.4.
  3. Gentag trin 5.1 - 5.2 for ønskede antal produktionscyklus og måle mængden af ​​L-xylulose produceret i reaktionen supernatanten i hver cyklus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at aktivere cofaktor regenerering blev L-xylulose syntese udført i en koblet helcelle biokatalytisk indeholdende E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler. Efter optimering af forskellige parametre blev genanvendelighed af dette system forbedres ved at immobilisere det på calcium alginatkugler (figur 2).

L-xylulose Produktion med cofaktor Regeneration af Coupling E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler.
For at øge bioomdannelsen af L-arabinitol til L-xylulose, E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler blev koblet for at muliggørecofaktor regenerering. For at tage højde for forskellene i proteinekspression og cofaktor tilgængelighed i E. coli SpNox og E. coli HjLAD celler, en sammenlignende undersøgelse af L-xylulose udbytte ved forskellige E. coli SpNox -til- E. coli HjLAD nøgletal blev udført. Som vist i figur 1B, forøgede udbyttet som E. coli SpNox -til- E. coli HjLAD steg fra 0,13: 1 til 1: 1. 1 og 1.33:: De opnåede for nøgletal 1 udbytter 1 var ækvivalente og maksimal for dette kombineret system. Alle yderligere forsøg blev udført med E. coli SpNox -til- E. coli HjLAD forhold på 1: 1. Startende med en initial koncentration på 150 mM L-arabinitol, anvendelse af E. coli HjLAD biokatalysator alene producerede 118 mM L-xylulose efter 8 timers (mætningspunktfor L-xylulose koncentration), som repræsenterer et udbytte på 79% (figur 1C). Til sammenligning anvendelsen af E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler ved en 1: 1 ratioen produceret 144 mM L-xylulose, forbedre udbyttet til 96%.

Optimering af hele celler Biokatalysator Immobilisering
Immobilisering af biokatalysatorer i calciumalginatperler giver mange fordele, såsom forbedret levedygtighed som følge af den milde gel miljø, der beskytter cellerne mod de fysiske spændinger i en bioreaktor. Egenskaberne af disse alginat perler er i høj grad bestemt af formulerings- og procesparametre 34. At optimere udbyttet produktion af L-xylulose ved en immobiliseret form af den koblede helcelle biokatalysator ovenfor beskrevne to vigtigste parametre, nemlig natriumalginat koncentration og CaCl2-koncentration, blev evalueret. Disse erde vigtigste parametre, som bestemmer integritet og stivhed af de calciumalginatperler, som igen påvirker biokatalysatoren immobilisering effektivitet og molekylær diffusion.

Som vist i figur 3A, biokatalysatoren forankringseffektiviteten viste en stigende tendens med stigende natriumalginat koncentration i området af 1 - 3% (vægt / volumen). Når natriumalginat anvendte koncentration i immobiliseringen matrix var mindre end 1%, de resulterende perler var skrøbelig og let brudt på grund af lav mekanisk stabilitet og frigiver de fleste celler i den omgivende CaCl2-opløsning (data ikke vist). Ved at øge natrium- alginat koncentrationen til mere end 2%, de resulterende perler hærdet overdrevent giver problemer i molekylær diffusion 35 (figur 4). Varierende CaCl2 koncentration gav en lignende tendens i biokatalysator immobilization effektivitet. For en fast koncentration af natriumalginat (2% vægt / volumen) og i området fra 0,1 - 0,4 M CaCl2, lavere CaCl2-koncentrationer resulterede i nedsat stivhed af perlerne og øget lækage af celler i den omgivende opløsning. Dette skyldes den begrænsede tilgængelighed af Ca2 + -ioner til tværbinding af guluronat blokke på alginat polymerkæder 36 (figur 3b). Men forøgelse af CaCl2 koncentration fra 0,3 M til 0,4 M forbedret biokatalysatoren forankringseffektiviteten kun marginalt. På grund af den høje forankringseffektiviteten (> 90%), CaCl2-koncentrationer over 0,4 M ikke evalueret. Når anvendtes CaCl2 koncentrationer på mindre end 0,1 M, natriumalginatet dråber indeholdende biokatalysatoren faldt fra hinanden i CaCl2-opløsning og ingen sfæriske perler blev dannet (data ikke vist).

For at maksimerebiokatalysator forankringseffektiviteten uden signifikant langsommere molekylær diffusion i calciumalginatperler, natriumalginatet og CaCl2 koncentrationen blev optimeret næste for forbedret L-xylulose produktion. Under anvendelse af samme koncentrationsområde som til immobilisering effektivitet (1 - 3% vægt / volumen natriumalginat og 0,1 - 0,4 M CaCl2), en optimal natriumalginat koncentration på 2% blev observeret for at opnå maksimal udbytte af L-xylulose produktion (figur 4A ). Ud over denne optimale koncentration, viste udbyttet en faldende tendens. Det var forventet på grund af de problemer i diffusion forbundet med overdreven stivhed calcium alginat perler. Tilsvarende blev den optimale CaCl2 koncentration fundet at være 0,3 M (figur 4B). Kombineret med dataene vist i Figur 3, den optimale natriumalginat koncentration (2%) og CaCl2-koncentration (0,3 M), der tillod dannelse af perler medegnet stivhed og permeabilitet blev etableret, hvilket muliggør minimal celle lækage og maksimal L-xylulose produktionsudbyttet.

Det skal bemærkes, at en anden faktor, der påvirker den samlede katalytiske effektivitet af den immobiliserede biokatalysator er vægten af ​​cellekulturen indkapsles. Den katalytiske effektivitet stiger med stigende celleinokulum op til en optimal inokulum vægt, ud over hvilken den viser en faldende tendens 37. En mulig forklaring på dette fald er cellulær overbelægning, hvilket hindrer molekylær diffusion gennem calciumalginatperler og formindsker den katalytiske effektivitet af systemet. Brug af den optimerede immobilisering betingelse ovenfor blev den højeste L-xylulose produktion opnået med en celle belastning på 3,75 (gDCW) / L 16 (data ikke vist).

Genanvendelighed de immobiliserede og gratis helcelle biokatalysatorer tilL-xylulose Production.
Anvendelse af de etablerede optimeret tilstand på 1: 1 E. coli SpNox til E. coli HjLAD ratio, 2% (vægt / vol) natriumalginat og 0,3 M CaCl2, det immobiliserede koblet helcelle biokatalysator output en maksimal L-xylulose udbytte på 64%, sammenlignet med en meget højere udbytte på 96% for den frie koblet helcelle-systemet (cyklus 1 i figur 5). Bemærk, at udbyttet af immobiliseret E. coli HjLAD celle alene var kun 32,5% (data ikke vist), lavere end den for det immobiliserede koblet system samt den frie enkelt biokatalysator systemet (79%, figur 1C). Denne reduktion var forventet som immobilisering vides at nedsætte aktiviteten af ​​biokatalysatorer, muligvis på grund af substrat diffusionsbegrænsninger, men blev kompenseret med den fordel forbedret genanvendelighed af en biokatalysator ved immobilisering. Denne virkning på stabiliteten af ​​biokatalysatoren erdemonstreret af den faldende tendens i L-xylulose udbytte observeret på udsættelse af de frie og immobiliserede systemer gentagne gange til en batch reaktion proces, vist i figur 5. Udbyttet for gratis system viste en meget stejlere fald end det immobiliserede systemet, hvilket indikerer en hurtigere tab af enzymaktivitet i det frie system. Som følge heraf begge systemer havde en sammenlignelig L-xylulose udbytte for produktionscyklus 2. Ved udgangen af ​​7 cykler af successiv genbrug, de indkapslede biokatalysatorer opretholdt deres stabilitet og bibeholdt 65% af den oprindelige udbytte mens de frie helcelle systemet bibeholdt mindre end 10% af dens evne til at producere L-xylulose. Dette viser, at de immobiliserede biokatalysatorer kunne genbruges effektivt til produktion af L-xylulose, og at fordelen ved forbedret genanvendelighed og stabilitet anlagt den ved immobilisering langt opvejer reduktionen i aktivitet biokatalysator, giver en betydelig fordel til produktionsprocessen ien fri helcelle system.

figur 1
Figur 1. Koblet helcelle-System til den biokatalytiske produktion af L-xylulose. (A) Skematisk illustration af cofaktoren regenerering reaktion, der opstår i en koblet helcelle omfattende E. coli-celler, der huser HjLAD eller SpNox hhv. (B) Variation i udbyttet af L-xylulose med forskellige E. coli SpNox til E. coli HjLAD nøgletal. (C) L-xylulose udbytte ud fra en hel-celle biokatalysatoren består af kun E. coli HjLAD sammenlignet med en koblet helcelle-system bestående af E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler i stand til cofaktor regenerering. De viste plots repræsenterer gennemsnittet og standard afvigelse på tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Immobilisering af hele-celle Biokatalysatorer via Indkapsling i alginatkugler. Skematisk repræsenterer dannelsen af ensartet størrelse Ca2 + alginatkugler ved dråbevis tilsætning af natriumalginatet-cellesuspension til en opløsning af calciumchlorid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. parametre, der påvirker effektiviteten af Immobilisering af helcelle-Biokatalysator i alginatkugler. Immobilisering effektivitet som en funktion af (A) natriumalginat (% vægt / volumen) (B) CaCl2 (M) koncentration. De viste plots repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelsen for tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Evaluering af udbyttet af L-xylulose fra det immobiliserede Koblet helcelle Biokatalysator som en funktion af (A) natriumalginat (% vægt / volumen) (B) CaCl2 (M) koncentration. De viste plots repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelsen for tre uafhængige forsøg.lank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Vurdering af biokatalysatoren Genbrugelighed. Udbyttet af L-xylulose produktion i 7 på hinanden følgende cyklusser af genbrug af immobiliseret og frie koblet hel-celle biokatalysatoren er vist i mørke og lys grå hhv. Den viste plot repræsenterer den gennemsnitlige og standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den seneste teknologiske fremskridt har muliggjort en kraftig stigning i kommercialiseringen af ​​rekombinante bioterapeutiske, hvilket resulterer i en gradvis stigning i deres markedsværdi i den bioteknologiske industri. En sådan avancement er fremkomsten af metabolic engineering i rekombinante mikroorganismer, som har vist en meget lovende i etableringen skalerbare industrielle systemer 38. Som med de fleste processer, vellykket kommercialisering af rekombinante biomolekyler fremstillet ved genetisk manipulerede mikroorganismer er meget afhængig af produktionsudbyttet af systemet 39. Dette har ført til den hurtige udvikling af "brute force" genetik 39, hvor direkte evolution af biokatalytiske enzymer er blevet gennemført for at forbedre biokatalysator aktivitet 3. For visse metaboliske veje, såsom redox veje, blotte biokatalysator forbedring er ikke tilstrækkelig til at påvirke economization af produktionen efter signifikant virkning af othER væsentlige reaktion krav, såsom dyre cofaktorer. Opskalering af et sådant system, selv med forbedrede biokatalysatorer, vil kun tjene til at øge produktionsomkostningerne. Således er yderligere strategiske metoder kræves for kommercialisering af bioreaktorer involverer støkiometriske cofaktorer. Hertil kommer, at genanvendelighed af en biokatalysator er også nødvendigt for at forbedre de økonomiske muligheder for en biobaseret proces. For at overvinde den begrænsende virkning af hurtige cofaktor forbrug og dårlig genanvendelighed af hel-celle biokatalysatorer, har vi tidligere udviklet en immobiliseret, koblet helcelle biokatalytisk system til cofaktor regenerering og stabil genbrug 16. Beskrevet i den foreliggende undersøgelse er de eksperimentelle procedurer, der kræves til par og co-immobilisere to hel-celle biokatalysatorer for forbedret biotransformation udbytte og genanvendelighed, sammen med de repræsentative resultater.

En kritisk faktor, der skal overvejes til kobling af helcelle-biocatalysts er opretholdelsen af ​​en præcis kontrol over betingelserne for protein induktion og biokatalytisk produkt dannelse for at sikre reproducerbarhed af systemet. Variationer i parametre som induktion OD 600, induktion tid, og IPTG koncentration bør undgås for at minimere batch-til-batch variation. Derudover er re-evaluering af celle-til-celle-forholdet påkrævet for forskellige biotransformation. Bemærk, at E. coli HjLAD: E. coli SpNox forhold på 1: 1 rapporteret i denne undersøgelse blev bestemt ved eksperimentel optimering snarere end de teoretiske støkiometriske forhold. Til immobilisering af de rekombinante helcelle-biokatalysatorer i calciumalginatperler, er der flere kritiske trin for at sikre ensartethed med hensyn til perlen stivhed og distribution af celler. For det første skal alginatopløsningen fremstilles ved langsomt at tilsætte natriumalginat i vand, og ikke omvendt at forhindre klumpning, der coULD påvirke den lokale alginat-koncentration og således omfanget af tværbinding. For det andet bør forsigtig pipettering anvendes ved håndtering af celle-alginat suspension for at undgå dannelsen af ​​luftbobler, som påfører forskydningsspænding på de indkapslede celler, hindrer effektiv massetransport og kan endda forårsage perlerne til at flyde. I tilfælde indføres luftbobler i suspensionen, tillader celle-alginat suspension henstå uforstyrret i 20 - 30 min at lade boblerne undslippe. For det tredje, når de foretager perlerne, celle-alginat suspension skal langsomt og omhyggeligt tilsat i en dråbevis måde til en tilstrækkelig mængde calciumchlorid opløsning til ensartet størrelse og morfologi. Perler nedsænket ufuldstændigt i calciumchlorid vil have en uregelmæssig form og dårlig stivhed, der kan bidrage til celle lækage. Endelig, for at undgå variabilitet i reaktionsvolumenet fra resterende vaskebuffer, kan perlerne i trin 4.8 være let blottet med filtrerpapir (ikke lufttørre).

E. coli SpNox og E. coli HjLAD cellekulturer, der tilbyder en bedre kontrol med at opretholde et ønsket forhold mellem de to enzymer. Derudover er celler, der udtrykker enkelt proteiner udsat for mindre stress end de co-udtrykkende multiple proteiner, der kan føre til reduceret misfoldning protein og forøget proteinekspression 40,41. Således direkte hel celle kobling viser evnen til at mediere multienzym katalytiske processer uden væsentligt at kompromittere produktudbyttet. Men etablerede strategier såsom omhyggelig udvælgelse af bakterielle initiativtagere med varierende styrke 42,43 og forbedringer i ribosombindingssteder 44 kan være employed at afbøde begrænset kontrol over forholdet mellem målenzymer i co-kultur eller co-ekspressionssystemer. Blandt de mange immobiliseringsteknikker, indkapsling viser flere fordele til immobilisering helcelle-biokatalysatorer løbet alternative metoder såsom tværbinding og adsorption, som er mere egnet til oprensede enzymer. Indkapsling af celler kan også udføres i en række af biomaterialer såsom agar, chitosan, gummier, carrageenan, gelatine og alginat 45 til forbedring af genanvendelighed af biokatalysatorer. Men calciumalginat indkapsling er blevet vist, at være den mest effektive fremgangsmåde med hensyn til immobilisering effektivitet og biomolekyle produktionen 46,47.

En væsentlig begrænsning af anvendelse af bakterielle helcelle-biokatalysatorer er minimal evne til post-translationel modifikation af heterologe proteiner i vildtype E. coli 48. Dette begrænser den vellykkede anvendelse af eukaryote biokatalysatorer wnden dette system. Et alternativ til at overvinde denne begrænsning kunne være brugen af ​​organismer såsom gær, der er bedre udstyret med eukaryote indlæg translationel maskiner. En anden begrænsning ved det beskrevne system er relateret til brugen af ​​immobilisering for forbedret genanvendelighed. Immobilisering er en fælles omkostningseffektiv strategi ansat til at modvirke den dårlige stabilitet af biokatalysatorer og forbedre deres omsætning sats ved at forenkle bioprocessen 49-51. De vigtigste parametre, som påvirker den katalytiske ydeevne af indkapslede helcelle-biokatalysatorer inkluderer natriumalginat koncentration, CaCl2 koncentration, celle lastning og perlestørrelse. Det er vigtigt at erkende, at disse parametre er ikke uafhængige af hinanden. Som sådan en omfattende analyse af alle faktorer inden for en enkelt undersøgelse er meget tidskrævende, hvorfor det er nødvendigt at vælge de mest afgørende parametre for optimering. Evalueres og præsenteres her er virkningerne afto parametre, natriumalginat og CaCl2 koncentration. Selvom det ikke er diskuteret i detaljer her, har vi tidligere udført optimering af celle lastning, sammenligner afhængigheden af udbyttet på vægten af celler immobiliserede 16. Rapporter i litteraturen indikerer, at variation af perlestørrelse kunne også modulere produktionen udbytte ved at forøge enzym indkapsling, forbedre aktivitet via forøget overfladeareal af det immobiliserede system eller ved at ændre diffusion af substrater og produkter som følge af ændrede transportegenskaber. Afhængigt af de biokatalytiske reaktioner under overvejelse, kan kræves udvalg af alternative kritiske faktorer, som kan føre til dannelse af et andet sæt af optimale betingelser. En detaljeret undersøgelse for etablering af optimale betingelser for yderligere parametre giver mulighed for yderligere forbedring i udførelsen af ​​den koblede hel-celle system.

Sammenfattende rapporterer vi den eksperimentelle gennemførelførelsen af ​​en koblet hel-celle biokatalytisk systemet immobiliseret i calcium alginat perler, som illustrerer den forbedrede produktion af L-xylulose. Ved at udtrykke forskellige rekombinante enzymer, som letter andre cofaktor afhængig biokatalytiske veje, høje udbytter af mange biologisk relevante molekyler kan opnås under anvendelse af protokollen beskrevet her. Desuden kan dette system udvides til at rumme mere end to rekombinante biokatalysatorer for one-pot multienzymløsning biosyntesen af produkter 52 og andre end biokatalytisk produktion applikationer, såsom mikrobielle biosensorer til biokemisk iltforbrug 53. Drage fordel af den synergistiske træk ved dette system, kan indkapsling af symbiotisk mikrobielle konsortier skal bruges til et utal af applikationer såsom bioremediering 54-56, hel-celle bioforarbejdning for biobrændstoffer 57, plantevækst fremme af jord bioaugmentation 58 og biomining til metal genvinding 59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser. Papiret har til formål at rapportere detaljeret metode til at generere en koblet hel-celle biokatalytisk systemet immobiliseret i alginat perler. Videnskabelige nyheder er blevet rapporteret i en tidligere undersøgelse 16.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (NRF-2013R1A1A2012159 og NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk Universitet og Institut for Kemiteknik og mCubed Program ved University of Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27, (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110, (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54, (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76, (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92, (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32, (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15, (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72, (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5, (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14, (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20, (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106, (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45, (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89, (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39, (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72, (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62, (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90, (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72, (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49, (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72, (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40, (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74, (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36, (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67, (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271, (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34, (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76, (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41, (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11, (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14, (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33, (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22, (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103, (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9, (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30, (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15, (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50, (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163, (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40, (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100, (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30, (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100, (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7, (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012, (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3, (203), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics