Immobilisering av Multi-biokatalysatorer i alginatpärlor för Cofactor Regeneration och förbättrad Återanvändning

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presenteras är protokollet för co-immobilisera hela celler biokatalysatorer för kofaktor förnyelse och förbättrad återanvändbarhet, med hjälp av produktionen av L-xylulos som ett exempel. Kofaktorn regenere uppnås genom att koppla två Escherichia coli-stammar som uttrycker funktionellt kompletterande enzymer; helcell-biokatalysator immobilisering åstadkommes genom cellinkapsling på kalcium alginatpärlor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi har nyligen utvecklat en enkel, återanvändbar och kopplade helcells-biokatalytisk system med förmågan att kofaktor förnyelse och biokatalysator immobilisering för förbättrad produktionsutbyte och ihållande syntes. Beskrivs härmed är den experimentella proceduren för utvecklingen av ett sådant system som består av två E. coli-stammar som uttrycker funktionellt kompletterande enzymer. Tillsammans kan dessa två enzymer fungera kooperativt att mediera regenerering av dyra kofaktörer för att förbättra produktutbyte av den Bioreaktionsteknik. Dessutom är metoden för syntetisering av en immobiliserad form av det kopplade biokatalytisk systemet genom inkapsling av hela celler i kalcium alginatpärlor rapporterats. Som ett exempel presenterar vi den förbättrade biosyntesen av L-xylulos från L-arabinitol genom koppling E. coli-celler som uttrycker enzymerna L-arabinitoldehydrogenas eller NADPH-oxidas. Under optimala förhållanden och med användning av en initial koncentration av 150mM L-arabinitol, nådde den maximala L-xylulos utbyte 96%, vilket är högre än de som rapporterats i litteraturen. Den immobiliserade formen av de kopplade helcells-biokatalysatorer visade god driftstabilitet, bibehålla 65% av avkastningen som erhålls i den första cykeln efter 7 cykler av successiv återanvändning, medan den fria cellsystemet nästan helt förlorat den katalytiska aktiviteten. Därför metoder rapporterade här ger två strategier som kan bidra till att förbättra den industriella produktionen av L-xylulos, liksom andra mervärdes föreningar kräver användning av kofaktorer i allmänhet.

Introduction

Reduktiv helcells-biotransformation med hjälp av mikroorganismer har blivit en utbredd metod för kemo-enzymatisk syntes av kommersiellt och terapeutiskt viktiga biomolekyler 1 - 3. Den presenterar flera fördelar jämfört med användning av isolerade enzymer, särskilt avskaffandet av kostnadsintensiva nedströms reningsprocesser och demonstration av en förlängd livslängd 4-7. För biokatalytiska vägar där det krävs kofaktörer för produktbildning, hela-cellsystem har potential att ge in situ kofaktor förnyelse via tillsats av billiga elektrondone samsubstrat 5,8,9. Emellertid är denna kapacitet minskas för reaktioner som kräver en stökiometrisk koncentration av sällsynta eller dyra samsubstrat 10 - 13. Tillsammans med dålig återanvändning av hela celler, hindrar detta inrättandet av en skalbar och kontinuerlig produInsatser systemet. Strategiska modifieringar av hel-cellsystem för dessa kofaktor beroende biotransformationer krävs för att övervinna ovannämnda begränsningar. Specifikt har kombinationen av hela celler biokatalysatorer som arbetar kooperativt visat sig signifikant öka produktiviteten och stabiliteten av de hyste enzymerna 14. Dessa faktorer, som ofta kritisk för att möjliggöra storskalig produktion av kommersiellt gångbara produkter, kan optimeras ytterligare genom samtidig immobilisering biokatalytiska mikrober 15. Vi har nyligen utvecklat en enkel och återanvändbar hel-cell biokatalytisk system som tillåter både kofaktor förnyelse och biokatalysator immobilisering för L-xylulos produktion 16. I denna studie var detta system som används som ett exempel för att illustrera de experimentella förfarandena för att tillämpa dessa två strategier för förbättrad biotransformation produktionsutbyte och biokatalysator återanvändbarhet.

L-xylulos tillhör en class av biologiskt användbara molekyler som heter sällsynta sockerarter. Sällsynta sockerarter är unika monosackarider eller sockerderivat som förekommer mycket sällan i naturen, men spelar viktiga roller som igenkänningselement i bioaktiva molekyler 17,18. De har en mängd olika tillämpningar som sträcker sig från sötningsmedel, funktionella livsmedel för potentiella terapeutiska medel 19. L-xylulos kan användas som en potentiell inhibitor av flera a-glukosidaser, och kan också användas som en indikator på hepatit eller levercirros 17,20. Hög omvandlingseffektivitet av xylitol till L-xylulos i hel-cellsystem har tidigare rapporterats i Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 och Escherichia coli 26. I E. coli, men det var endast uppnås med hjälp av låga (<67 mm) xylitolkoncentrationerna 26 på grund av potentiella inhibitoriska effekterna av en initial xylitol koncentration högre än 100 mM om xylitol-4-dehydrogenas aktivitet 21,26. Termodynamisk jämvikt mellan xylulos och xylitol har visat sig starkt gynna bildandet av xylitol 25,27. Dessutom är xylulos avkastning begränsas av mängden av dyra kofaktorer som måste levereras i frånvaro av en in situ kofaktor regenereringssystem. Tillsammans utgör dessa faktorer begränsar risken för skalning i hållbara system för L-xylulos biosyntesen.

För att övervinna dessa begränsningar och förbättra L-xylulos biotransformation avkastning, var strategin att kofaktor regenere anställd först genom att upprätta en kopplad helcells-biokatalytisk systemet. Specifikt, L-arabinitol 4-dehydrogenas (EC 1.1.1.12) från svampdynor jecorina (HjLAD), ett enzym i L-arabinos katabolism av svampar, valdes för att katalysera omvandlingen av L-arabinitol till L-xylulos 28,29 . Liksom många biosyntetiska enzymer, en stor limitation HjLAD är att det kräver en stökiometrisk mängd av den dyra nikotinamidadenindinukleotid cofaktor (NAD +, den oxiderade formen av NADH) för att genomföra denna omvandling. NADPH-oxidas hittades i Streptococcus pyogenes (SpNox) har visat att visa hög kofaktor-regenereringsaktivitet 30,31. Med utnyttjande av detta attribut av SpNox, E. coli-celler som uttrycker HjLAD för produktion av L-xylulos kopplades med E. coli-celler som uttrycker SpNox för regenerering av NAD + för att öka L-xylulos produktion avbildas av den kopplade reaktionen som visas i figur 1A. Under optimala förhållanden och med användning av en initial koncentration av 150 mM L-arabinitol, nådde den maximala L-xylulos utbyte 96%, vilket gör detta system mycket mer effektiv än de som rapporteras i litteraturen.

Strategin med helcells-immobilisering användes nästa för att ytterligare förbättra återanvändbarheten för den kopplade biocatalytIC-systemet. Vanligen använda metoder för helcells-immobilisering inkluderar adsorption / kovalent länkning till fasta matriser, tvärbindning / infångning och inkapsling i polymera nätverk 32. Bland dessa metoder är den lämpligaste metoden för cell immobilisering inkapsling i kalcium alginatpärlor. Deras milda gelningsegenskaper, inert vattenmatris och hög porositet hjälpa till att bevara de fysiologiska egenskaper och funktioner hos de inkapslade biologiska 33. Därför den kopplade biokatalysatorn system innehållande både E. coli-celler som hyser HjLAD eller SpNox immobiliserades i kalciumalginat pärlor för att möjliggöra flera cykler av L-xylulos (figur 2) .Den immobiliserade biokatalysator-system visade god driftstabilitet, bibehålla 65% av omvandlingsutbytet av den första cykeln efter 7 cykler av successiv återanvändning, medan den fria cellsystemet nästan helt förlorat sin katalytiska aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hela-cell Biokatalysatorer Förberedelse

OBS: Den rekombinanta E. coli-celler som hyser pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 är följande kallad E. coli SpNox och E. coli HjLAD, respektive.

  1. Ympa en enda koloni av E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium med tillsats av kanamycin (50 | ig / ml) och inkubera i en inkubator-skakapparat O / N vid 37 ° C, 250 rpm.
  2. Späd kulturen genom ett: 100 i 200 ml färskt LB innehållande 50 | j, g / ml kanamycin och inkubera vid 37 ° C, 250 varv per minut till dess att OD 600 når ~ 0,6.
  3. Inducera HjLAD proteinuttryck genom tillsats av 0,1 mM isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) till odlingsmediet och inkubera vid 16 ° C, 180 rpm under 16 timmar.
    1. Alternativt, utföra induktion vid 25 ° C, 200 rpm under 6 timmar om L-xylulos biosyntesen av (steg 2 nedan) utförs samma dag.
  4. Skörda inducerade E. coli HjLAD celler genom centrifugering vid 3200 xg under 20 min vid 4 ° C Kassera supernatanten och fortsätt till steg 2 för att behandla cellpelleten.
  5. Parallellt utför steg 1,1-1,4 för E. coli SpNox.

2. Biosyntes av L-xylulos genom koppling E. coli HjLAD och E. coli SpNox för Cofactor Regeneration

  1. Resuspendera cellpelletar av E. coli HjLAD och E. coli SpNox separat i 50 mM Tris-HCl-buffert (pH 8,0) vid en celltäthet av 5,0 g torr cellvikt (gDCW) / L.
    Notera: En korrelation mellan gDCW och den optiska densiteten mättes vid 600 nm (OD 600) kan etableras för att underlätta experimentet. Den formel som används idetta protokoll är en gDCW / L = 0,722 * OD 600 till 0,0965, vilket kan variera mellan olika spektrometrar.
  2. Blanda 600 pl 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 pl 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 ul av 20 mM NAD +, och 150 | il av 2 M L-arabinitol i en 14 ml rundbottnad röret och föra reaktionsvolymen till 2 ml genom tillsats av 550 pl av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
    Anmärkning: Förhållandet mellan två hel-cell biokatalysatorer mängden kan optimeras för att förbättra biosyntesen av produkten. För det beskrivna systemet, ett förhållande av E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 befanns vara optimalt för L-xylulos biosyntes (Figur 1B).
  3. Inkubera reaktionsblandningen vid 30 ° C, 200 rpm under 8 h.
  4. Samla supernatanten efter centrifugering vid 4 ° C, 3200 xg under 10 minuter ennd fortsätt att kvantifiera L-xylulos produktion såsom beskrivits i steg 3 nedan.

3. Kolorimetrisk analys för L-xylulos Kvantifiering

  1. Aspirera 100 | il av reaktions supernatanten samlas från steg 2,4 i en 1,5 ml rör.
  2. Tillsätt 50 pl av 1,5% cystein, 900 ul av 70% svavelsyra, och 50 ul av 0,1% karbazol löstes i etanol och blanda försiktigt genom att vända röret 3 gånger.
  3. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C, 200 rpm under 20 min.
  4. Mät den optiska absorbansen hos reaktionsblandningen vid 560 nm (A 560) med användning av en spektrofotometer.
    1. Späddes reaktionsblandningen om A 560 avläsningen är över 1.

4. Immobilisering av rekombinanta Hela-cell Katalysatorer i kalciumalginat Pärlor

  1. Lös upp 4 g natrium-alginat i 100 ml destillerat vatten. Förbereda alginatlösningen genom tillsats av sodium alginat till vatten för att undvika bildning av klumpar. Värm blandningen vid behov.
  2. Lägg 600 ul av 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD och 600 pl av 5,0 gDCW / L E. coli SpNox i 1,2 ml 4% alginat som framställts i steg 4,1 och blanda cellerna och alginat genom försiktig pipettering för att undvika bubbelbildning.
  3. Aspirera alginat / cellsuspensionen i en spruta med användning av en nål och tillsätt blandningen droppvis till en 0,3 M kalciumklorid (CaCl2) lösning i en 100 ml bägare med kontinuerlig omrörning.
    Obs: Volymen CaCl2 lösning som används för alginat pärla bildning bör vara tillräckligt för de alginat dropparna vara helt under vattenytan. Dessutom måste avståndet mellan sprutnålen och ytan av kalciumkloridlösningen bibehållas inom ett optimalt område för att säkerställa bildandet av ett enhetligt sfäriska pärlor. Det optimala avståndet intervall kan bestämmas experimentally och beror på den inre diametern av nålen. Som en uppskattning, var ett avstånd av ~ 15 ± 5 cm befunnits vara optimalt för en 0,6 cm (inre diameter) sprutnål.
  4. Lämna pärlorna i CaCl2-lösning till 2 - 3 h vid RT utan omröring för att medge tvärbindning och gelpärlor bildning.
  5. Dekantera CaCl2-lösning utan att störa pärlorna genom att försiktigt hälla den CaCl2-lösning i ett 50 ml koniskt rör, och överför de återstående pärlor i CaCl2-lösning till en annan 50 ml koniska rör.
  6. Tvätta pärlorna med 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) buffert tre gånger för att avlägsna alltför stora CaCl2 och un-inkapslade celler.
    NOTERA: Vid varje givet steg, Centrifugera inte pärlor som detta kommer att brista dem. För att separera pärlorna från lösning, tillåta suspensionen stå orörd i 3-5 minuter. Pärlorna kommer att sedimentera vid botten och tvättbufferten kan dekanterasi en annan behållare.
    1. Släng inte den använda tvättbufferten. Pool den använda Tris-HCl-tvättbuffert (30 ml) med det använda CaCl2-lösningen uppsamlades från steg 4,5.
  7. Pellets FN-immobiliserade E. coli-celler genom centrifugering av den poolade CaCl2 och Tris-HCl-lösning uppsamlades från steg 4,6 vid 3200 xg under 20 min. För att bestämma immobilisering effektivitet, beräkna densiteten hos de pelleterade un-inkapslade celler i gDCW / L såsom beskrivs i steg 2,1.
  8. Överför de tvättade pärlorna från steg 4,6 i ett rör. Följ steg 2,2 - 3,4 för att utvärdera L-xylulos biosyntesen använda alla de tvättade pärlorna i stället för cellpellets.

5. Stabilitets analys av immobiliserade Biokatalysatorer för L-xylulos Production

  1. Samla pärlorna från steg 4,8 och tvätta två gånger med 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) buffert utan centrifugering (såsom beskrivits i steg 4.6).
  2. Använd allaav de tvättade pärlorna att utföra reaktionen som beskrivs i steg 2.2 - 3,4.
  3. Upprepa steg 5,1-5,2 för önskat antal produktionscykler och mäta mängden L-xylulos produceras i reaktionsvätskan i varje cykel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att möjliggöra kofaktor regenerering, var L-xylulos syntes utförs i en kopplad helcells-biokatalytisk system innehållande E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler. Efter optimering av olika parametrar, var återanvändbarhet av detta system förbättras genom att immobilisera det på kalcium alginatpärlor (Figur 2).

L-xylulos Produktion med Cofactor Regeneration av koppling E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler.
För att förbättra bioomvandlingen av L-arabinitol till L-xylulos, E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler kopplades för att möjliggörakofaktor förnyelse. Redogöra för skillnader i proteinuttryck och cofaktor tillgänglighet i E. coli SpNox och E. coli HjLAD celler, en jämförande studie av L-xylulos utbytet vid olika E. coli SpNox -till- E. coli HjLAD-förhållanden utfördes. Såsom visas i figur 1B, ökade utbytet som E. coli SpNox -till- E. coli HjLAD Graden ökade från 0,13: 1 till 1: 1. De erhållna utbytena för förhållandena 1: 1 och 1,33: 1 var likvärdiga och maximal för detta kopplade systemet. Alla ytterligare experiment utfördes med E. coli SpNox -till- E. coli HjLAD förhållande av 1: 1. Börjar med en initial koncentration av 150 mM L-arabinitol, användning av E. coli HjLAD biokatalysator ensam producerade 118 mM L-xylulos efter 8 timmar (mättnadspunktför L-xylulos koncentration), vilket motsvarar ett utbyte av 79% (Figur 1C). I jämförelse, användning av E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler vid ett 1: 1-förhållande som produceras 144 mM L-xylulos, förbättra utbytet till 96%.

Optimering av hela celler Biocataiyst Immobilisering
Immobilisering av biokatalysatorer i kalcium alginatpärlor erbjuder många fördelar, såsom förbättrad lönsamhet, till följd av den milda gel miljö som skyddar cellerna från de fysiska påfrestningar i en bioreaktor. Egenskaperna hos dessa alginatpärlor bestäms till stor del av formulerings och processparametrar 34. För att optimera produktionsutbytet av L-xylulos genom en immobiliserad form av det kopplade helcell-biokatalysator som beskrivits ovan, två huvudparametrar, nämligen natriumalginat koncentration och CaCl2 koncentration, utvärderades. Dessa ärde viktigaste parametrarna som bestämmer integriteten och styvheten hos kalcium alginatpärlor, vilket i sin tur påverkar biokatalysator immobilisering effektivitet och molekylär diffusion.

Såsom visas i fig 3A, visade biokatalysatorn immobilisering effektiviteten en ökande trend med ökande natriumalginat koncentration inom området av 1 - 3% (vikt / volym). När natriumalginat koncentration som används för immobiliseringen matrisen var mindre än 1%, de resulterande pärlorna var sköra och lätt bryts på grund av låg mekanisk stabilitet, släppa de flesta av cellerna i den omgivande CaCl2-lösning (data ej visade). Vid ökning av natriumalginat koncentrationen till mer än 2%, de resulterande pärlorna härdas alltför ledande till problem i molekylär diffusion 35 (figur 4). Variation av CaCl2 koncentrationen gav en liknande trend i biokatalysator immobilization effektivitet. För en fast koncentration av natriumalginat (2% vikt / volym) och i området av 0,1 till 0,4 M CaCl2, lägre CaCl2-koncentrationer resulterade i minskad styvhet av pärlorna och ökat läckage av celler i den omgivande lösningen. Detta beror på den begränsade tillgången på Ca2 + joner för tvärbindning av guluronat blocken på alginat polymerkedjorna 36 (figur 3B). Men att öka CaCl2 koncentration från 0,3 M till 0,4 M förbättrades biokatalysatorn immobilisering effektivitet endast marginellt. Grund av den höga immobilisering verkningsgrad (> 90%), CaCl2 koncentrationer som överstiger 0,4 M inte utvärderades. När CaCl2 koncentration på mindre än 0,1 M användes, natriumalginatet droppen innehållande biokatalysatorn föll isär i CaCl2-lösning och inga sfäriska kulor bildades (data ej visade).

För att maximerabiokatalysator immobilisering effektivitet utan att nämnvärt bromsa molekylär diffusion i kalcium alginatpärlor, natriumalginatet och CaCl2 koncentration optimerades nästa för förbättrad L-xylulos produktion. Med användning av samma koncentrationsområde som för immobilisering verkningsgrad (1 - 3% vikt / volym natriumalginat och 0,1-0,4 M CaCl 2), en optimal natriumalginat koncentration av 2% observerades för att uppnå maximalt utbyte av L-xylulos produktion (Figur 4A ). Utöver detta optimala koncentrationen, utbytet visade en nedåtgående trend. Detta var väntat, på grund av problem i diffusion i samband med överdriven styvhet kalcium alginatpärlor. På samma sätt har den optimala CaCl2 koncentrationen befanns vara 0,3 M (Figur 4B). I kombination med de data som visas i figur 3, den optimala natriumalginat koncentration (2%) och CaCl2 koncentration (0,3 M) som tillät bildningen av pärlor medlämplig styvhet och permeabilitet bildades, som möjliggör minimal cell läckage och maximal L-xylulos produktionsutbyte.

Det bör noteras att, en annan faktor som påverkar den totala katalytiska effektiviteten av den immobiliserade biokatalysatorn är vikten av cellkulturen inkapslas. De katalytiska effektiviteten ökar med ökande cell inokulat upp till en optimal inokulum vikt, bortom vilken det visar en nedåtgående trend 37. En möjlig förklaring till denna nedgång är cellulära överbeläggning, vilket hindrar molekylär diffusion genom hela kalcium alginatpärlor och minskar den katalytiska effektiviteten i systemet. Genom att använda den optimerade immobilisering villkoret ovan, användes den högsta L-xylulos produktion erhålls med en cellbelastning av 3,75 (gDCW) / L 16 (data visas ej).

Återanvändning av den immobiliserade och fria Hela-cell Biokatalysatorer förL-xylulos Production.
Att använda den etablerade optimerad tillståndet för en: en E. coli SpNox till E. coli HjLAD förhållande, 2% (vikt / volym) natriumalginat och 0,3 M CaCl2, den immobiliserade kopplad helcell-biokatalysator utmata en maximal L-xylulos utbyte på 64%, jämfört med ett mycket högre utbyte av 96% för den fria kopplad hel-cellsystem (cykel 1 i fig 5). Observera att utbytet av immobiliserade E. coli HjLAD cell enbart var endast 32,5% (data visas ej), lägre än den hos den immobiliserade kopplade systemet liksom den fria inre biokatalysator-system (79%, Figur 1C). Denna minskning var väntad eftersom immobilisering är kända för att minska aktiviteten hos biokatalysatorer, möjligen på grund av substrat diffusionsbegränsningar, men kompenserades av fördelen med förbättrad återanvändning av en biokatalysator vid immobilisering. Denna effekt på stabiliteten i biokatalysator ärbevisas av den minskande trenden i L-xylulos avkastning observerats på att utsätta de fria och immobiliserade system upprepade gånger för att en satsvis reaktion process, som visas i figur 5. Utbytet för den fria systemet visade en mycket brantare nedgång än den immobiliserade systemet, vilket indikerar en mer snabb förlust av enzymaktivitet i fritt system. Som ett resultat, de båda systemen hade en jämförbar L-xylulos avkastningen för produktionscykel 2. Vid slutet av 7 cykler av successiva återanvändning, de inkapslade biokatalysatorer bibehöll sin stabilitet och behöll 65% av den ursprungliga utbytet medan den fria helcells- systemet behöll mindre än 10% av sin förmåga att producera L-xylulos. Detta visar att de immobiliserade biokatalysatorer kan återanvändas på ett effektivt sätt för framställning av L-xylulos och att fördelen med förbättrad återanvändning och stabilitet beror på den immobilisering långt uppväger den minskade aktiviteten hos biokatalysator, ger en betydande fördel till produktionsprocessen överen fri hel-cellsystem.

Figur 1
Figur 1. Kopplad Hela-cellsystem för Biokatalytisk Produktion av L-xylulos. (A) Schematisk illustrerar kofaktor regenere reaktionen sker i en kopplad hela celler innefattande E. coli-celler som hyser HjLAD eller SpNox, respektive. (B) Variation i utbytet av L-xylulos med olika E. coli SpNox till E. coli HjLAD-förhållanden. (C) L-xylulos avkastning från en hel-cell biokatalysator som består av endast E. coli HjLAD jämfört med den hos en kopplad hel-cellsystem som består av E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler som kan kofaktor regeneration. Kurvorna som visas representerar genomsnittet och standard avvikelsen för tre oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. immobilisering av hela celler Biokatalysatorer via inkapsling i alginatpärlor. Schematisk representerar bildandet av jämnstora Ca2 + alginatpärlor genom droppvis tillsats av natriumalginat-cellsuspensionen till en lösning av kalciumklorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. faktorer som påverkar effektiviteten av immobilisering av Whole-cell Biocataiyst i alginatpärlor. Immobilisering effektivitet som en funktion av (A) natriumalginat (% vikt / volym) (B) CaCl2 (M) koncentration. Tomterna visas representerar genomsnittet och standardavvikelsen för tre oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Utvärdering av utbytet av L-xylulos från Immobilized Coupled Whole-cell Biocataiyst som en funktion av (A) natriumalginat (% vikt / volym) (B) CaCl2 (M) koncentration. Kurvorna som visas representerar genomsnittet och standardavvikelsen för tre oberoende försök.stripigt "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Bedömning av Biocataiyst Återanvändning. Utbytet av L-xylulos produktion för 7 successiva cykler av återanvändning av immobiliserade och fria kopplade helcells-biokatalysator visas i mörk och ljusgrå, respektive. Handlingen visas representerar genomsnittet och standardavvikelsen för tre oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nya tekniska framsteg har gjort det möjligt ett uppsving i kommersialiseringen av rekombinanta proteinläkemedel, vilket resulterar i en gradvis ökning av marknadsvärdet inom bioteknikindustrin. En sådan utveckling är uppkomsten av metabolisk teknik i rekombinanta mikroorganismer, som har visat en mycket lovande i upprättandet skalindustrisystem 38. Som med de flesta processer är framgångsrik kommersialisering av rekombinanta biomolekyler som produceras av genetiskt modifierade mikrober starkt beroende av produktionsutbytet av systemet 39. Detta har lett till den snabba utvecklingen av "brute force" genetik 39, där riktad evolution av biokatalytiska enzymer har genomförts i syfte att förbättra biokatalysator aktivitet 3. För vissa metaboliska vägar, såsom redox vägar, är bara biokatalysator förbättring inte är tillräcklig för att påverka ekonomisering av produktionen på grund av den betydande effekten av othER väsentliga krav reaktion, såsom dyra kofaktorer. Uppskalning av ett sådant system, även med förbättrade biokatalysatorer, endast kommer att tjäna till att öka produktionskostnaderna. Således är ytterligare strategiska metoder som krävs för kommersialisering av bioreactions involverar stökiometriska förhållanden av kofaktorer. Dessutom är också nödvändigt för att förbättra den ekonomiska genomförbarheten av ett biotekniska återvinning av en biokatalysator. För att övervinna den begränsande effekten av snabb kofaktor förbrukning och dålig återanvändbarhet av helcells-biokatalysatorer, har vi tidigare utvecklat en immobiliserad, kopplad helcells-biokatalytisk system för kofaktor regenerering och stabil återanvändning 16. Beskrivs i den aktuella studien är de experimentella förfaranden som krävs för att koppla och samtidigt immobilisera två helcells-biokatalysatorer för förbättrad biotransformation avkastning och återanvändbarhet, tillsammans med representativa resultat.

En kritisk faktor som bör beaktas för koppling av helcell-BIOCATalysts är upprätthållandet av en exakt kontroll över villkoren för proteininduktion och biokatalytisk produktbildning för att säkerställa reproducerbarhet av systemet. Variationer i parametrar som induktions OD 600, induktionstiden, och IPTG koncentration bör undvikas för att minimera sats till sats variationer. Dessutom krävs en ny bedömning av cell-till-cell-förhållande för olika biotransformationer. Notera att E. coli HjLAD: E. coli SpNox förhållande av 1: 1 som rapporteras i denna studie bestämdes genom experimentell optimering snarare än den teoretiska stökiometriska förhållandet. För immobilisering av de rekombinanta helcells-biokatalysatorer i kalcium alginatpärlor, finns det flera viktiga steg för att säkerställa enhetlighet med avseende på vulsten styvhet och distribution av celler. För det första måste alginatlösningen framställas genom att långsamt tillsätta natriumalginat i vatten, och inte tvärtom för att förhindra klumpning som could påverka lokala alginat-koncentration och sålunda graden av tvärbindning. För det andra bör försiktig pipettering användas vid hantering av cell alginat suspensionen för att undvika bildandet av luftbubblor, vilka vållar skjuvspänning på de inkapslade cellerna, hindras effektiv massöverföring och kan även orsaka pärlorna att flyta. I fall luftbubblor införs i suspensionen, tillåter den cell alginat suspensionen stå orörd under 20 - 30 min för att låta bubblor fly. För det tredje, när du gör pärlorna, cell alginat suspensionen måste tillsättas långsamt och försiktigt i en droppvis sätt i en tillräcklig volym av kalciumkloridlösning för enhetlig storlek och morfologi. Pärlor nedsänkta ofullständigt i kalciumklorid kommer att ha en oregelbunden form och dålig styvhet som kan bidra till cell läckage. Slutligen, för att undvika variabilitet i reaktionsvolymen från kvarvarande tvättbuffert kan pärlorna i steg 4,8 kan lätt utplånad med filterpapper (inte lufttorka).

E. coli SpNox och E. coli HjLAD cellkulturer, som erbjuder en bättre kontroll för att upprätthålla ett önskat förhållande mellan de två enzymerna. Dessutom är celler som uttrycker enskilda proteiner utsätts för mindre stress än de samuttrycker flera proteiner, som kan leda till minskad protein felveckning och ökad proteinuttryck 40,41. Således presenterar direkt helcells-koppling förmågan att förmedla flera enzym katalytiska processer utan att signifikant äventyra produktutbytet. Men etablerade strategier såsom noggrant urval av bakteriella promotorer med varierande styrka 42,43 och förbättringar i ribosombindningsställen 44 kan vara employed för att mildra begränsad kontroll över förhållandet mellan målenzymer i sam-kultur eller sam-expressionssystem. Bland de många immobiliseringstekniker presenterar inkapsling flera fördelar för att immobilisera hela celler biokatalysatorer över alternativa metoder, såsom tvärbindning och adsorption, som är mer lämpade för renade enzymer. Inkapsling av celler kan också utföras i en mängd olika biomaterial såsom agar, kitosan, gummin, karrageenan, gelatin och alginat 45 för förbättring av återanvändbarheten av biokatalysatorer. Emellertid har kalciumalginat inkapsling visat sig vara den mest effektiva metoden med avseende på immobilisering effektivitet och biomolekyler produktionen 46,47.

En viktig begränsning av användning av bakteriella helcells-biokatalysatorer är den minimala förmågan för post-translationell modifiering av heterologa proteiner i vildtyp E. coli 48. Detta begränsar den framgångsrika användningen av eukaryota biokatalysatorer wnom detta system. Ett alternativ för att övervinna denna begränsning kunde vara användningen av organismer såsom jäst som är bättre utrustade med eukaryot posttranslationell maskiner. En annan begränsning hos det beskrivna systemet är relaterad till användningen av immobilisering för förbättrad återanvändbarhet. Immobilisering är en gemensam kostnadseffektiv strategi som används för att motverka den dåliga stabiliteten av biokatalysatorer och förbättra deras omsättningshastighet genom att förenkla bioprocessen 49-51. De viktigaste parametrarna som påverkar den katalytiska prestandan hos inkapslade helcells-biokatalysatorer innefattar natriumalginat koncentration, CaCl2 koncentration, cellbelastning och pärlstorlek. Det är viktigt att inse att dessa parametrar är inte oberoende av varandra. Som sådan, är en omfattande analys av alla faktorer i en enda studie mycket tidskrävande, och därmed är det nödvändigt att välja de mest avgörande parametrarna för optimering. Utvärderas och presenteras här är effekterna avtvå parametrar, natriumalginat och CaCl2 koncentration. Även om det inte diskuteras i detalj här, har vi tidigare utfört optimering av cellbelastning, att jämföra beroende av avkastningen på vikten av celler immobiliserade 16. Rapporter i litteraturen tyder på att variationen av pärlstorlek kan också modulera produktionsutbytet genom att öka enzyminkapsling, förbättrad aktivitet via ökad ytarea av den immobiliserade systemet eller genom att ändra diffusion av substrat och produkter till följd av förändrade transportegenskaper. Beroende på de biokatalytiska reaktioner under övervägande, kan val av alternativa kritiska faktorer att krävas, vilket kan leda till genereringen av en annan uppsättning av optimala betingelser. En detaljerad studie för fastställande av optimala förutsättningar för ytterligare parametrar ger utrymme för ytterligare förbättringar i prestanda kopplade hela-cellsystem.

Sammanfattningsvis rapporterar vi den experimentella genomföranförandet av en kopplad helcells-biokatalytisk systemet immobiliserad på kalcium alginatpärlor, som illustrerar den förbättrade framställningen av L-xylulos. Genom att uttrycka olika rekombinanta enzymer som underlättar andra kofaktor beroende biokatalytiska vägar, höga utbyten av många biologiskt relevanta molekyler kan erhållas med användning av det protokoll som beskrivs här. Dessutom kan detta system utökas för att rymma mer än två rekombinanta biokatalysatorer för ett kärl med flera enzym biosyntesen av produkter 52 och andra än biokatalytisk produktion tillämpningar, såsom mikrobiella biosensorer för biokemisk syreförbrukning 53. Med utnyttjande av den synergistiska inslag i detta system, kan inkapsling av symbiotiskt mikrobiell konsortier användas för en mängd olika applikationer såsom bioremediering 54-56, hela-cell bioprocessning för biobränslen 57, växt tillväxtfrämjande genom jord bioaugmentation 58 och biomining för metallåtervinning 59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen. Papperet syftar till att rapportera detaljerad metod för att generera en kopplad helcells-biokatalytisk systemet immobiliserade i alginatpärlor. Vetenskapliga nyheter har rapporterats i en tidigare studie 16.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (NRF-2013R1A1A2012159 och NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk universitet och Institutionen för kemiteknik och MCubed program vid University of Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27, (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110, (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54, (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76, (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92, (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32, (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15, (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72, (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5, (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14, (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20, (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106, (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45, (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89, (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39, (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72, (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62, (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90, (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72, (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49, (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72, (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40, (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74, (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36, (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67, (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271, (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34, (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76, (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41, (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11, (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14, (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33, (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22, (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103, (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9, (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30, (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15, (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50, (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163, (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40, (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100, (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30, (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100, (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7, (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012, (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3, (203), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics