Immobilisierung von Multi-Biokatalysatoren in Alginatbeads für Kofaktorregenerierung und verbesserte Reusability

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Summary

Dargestellt ist das Protokoll für die Co-immobilisierenden Ganzzellbiokatalysatoren für Cofactorregenerierung und eine verbesserte Wiederverwertbarkeit, mit der Produktion von L-Xylulose als Beispiel. Die Cofactorregenerierung wird durch Kopplung von zwei Escherichia coli - Stämme exprimieren funktionell komplementären Enzymen erreicht; die Ganzzellbiokatalysator Immobilisierung durch Zellverkapselung in Calciumalginatperlen erreicht.

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

Wir haben vor kurzem eine einfache, wiederverwendbare und gekoppelt whole-cell biokatalytischen System mit der Fähigkeit zur Cofaktor-Regenerierung und Biokatalysator Immobilisierung für eine verbesserte Produktionsausbeute und anhalt Synthese. Beschrieben hiermit ist das experimentelle Verfahren für die Entwicklung eines solchen Systems , bestehend aus zwei E. coli - Stämme , die funktionell komplementäre Enzyme exprimieren. Zusammen können diese beiden Enzyme wirken kooperativ die Regeneration von teuren Cofaktoren für die Verbesserung der Produktausbeute der Bioreaktion zu vermitteln. Darüber hinaus wird berichtet, das Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Form des gekoppelten Systems biokatalytischen durch Einkapselung von ganzen Zellen in Calciumalginat-Kügelchen synthetisiert wird. Als Beispiel stellen wir die verbesserte Biosynthese von L-Xylulose aus L-arabinitol durch E. Kupplung coli - Zellen , die die Enzyme L-Arabinit - Dehydrogenase oder NADH - Oxidase exprimiert. Unter optimalen Bedingungen und mit einer Anfangskonzentration von 150mM L-Arabinit, die maximale L-Xylulose-Ausbeute erreichte 96%, was in der Literatur berichtet höher als jene ist. Die immobilisierte Form der gekoppelten Ganzzellbiokatalysatoren zeigte eine gute Betriebsstabilität, 65% der im ersten Zyklus nach 7 Zyklen von aufeinanderfolgenden Wiederverwertung erhalten Ausbeute aufrechterhalten wird, während das freie Zellsystem fast vollständig die katalytische Aktivität verloren. Daher sind die hier beschriebenen Verfahren liefert zwei Strategien, die die industrielle Produktion von L-Xylulose verbessern helfen könnten, sowie andere Mehrwert-Verbindungen, die die Verwendung von Co-Faktoren in der Regel erforderlich ist.

Introduction

3 - reduktiven Ganzzell - Biotransformation unter Verwendung von Mikroorganismen hat eine weit verbreitete Methode für die chemo-enzymatischen Synthese von kommerziell und therapeutisch wichtigen Biomolekülen 1 geworden. Es stellt mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung von isolierten Enzymen, insbesondere die Beseitigung von kostenintensiven nachgeschaltete Reinigungsverfahren und die Demonstration einer verlängerten Lebensdauer von 4 bis 7. Für biokatalytische Wege wo Cofaktoren für die Produktbildung erforderlich sind, haben Ganzzellsysteme das Potential in situ Regeneration Kofaktor über die Zugabe von kostengünstigen elektronenabgebenden Cosubstrate 5,8,9 bereitzustellen. Jedoch ist diese Kapazität für Reaktionen vermindert , die eine stöchiometrische Konzentration von seltenen oder teuren Co-Substrate 10 erfordern - 13. Zusammen mit einer schlechten Wiederverwertbarkeit von ganzen Zellen, erschwert dies die Einrichtung eines skalierbaren und kontinuierlichen production System. Strategische Änderungen von Ganzzellsysteme für diese cofaktorabhängig Biotransformationen sind erforderlich, um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die Kombination von Ganzzell - Biokatalysatoren gesagt, die kooperativ arbeiten , wurden 14 gezeigt , erheblich die Produktivität und Stabilität der Enzyme beherbergten verbessern. Diese Faktoren, die oft entscheidend für die Aktivierung groß angelegte Produktion von marktfähige Produkte, kann durch 15 Co-Immobilisierung von biokatalytischen Mikroben optimiert werden. Wir haben vor kurzem eine einfache und wiederverwendbar whole-cell biokatalytische System , das sowohl die Regeneration Cofaktor ermöglicht und Biokatalysator Immobilisierung für die L-Xylulose Produktion 16. In dieser Studie wurde dieses System als Beispiel verwendet, um die experimentellen Verfahren des Anwendens dieser beiden Strategien für eine verbesserte Biotransformation Produktionsausbeute und Biokatalysator Wiederverwertbarkeit zu veranschaulichen.

L-Xylulose gehört zu einer class biologisch nützliche Moleküle seltenen Zucker genannt. Seltene Zucker sind einzigartige Monosaccharide oder Zuckerderivate , die sehr selten in der Natur vorkommen, sondern spielen eine entscheidende Rolle als Erkennungselemente in bioaktiven Molekülen 17,18. Sie haben eine Vielzahl von Anwendungen , von Süßstoffen hin, funktionelle Lebensmittel , um potenzielle Therapeutika 19. L-Xylulose kann als potentieller Inhibitor der mehreren α-Glucosidasen verwendet werden und auch als ein Indikator von Hepatitis oder Leberzirrhose 17,20 verwendet werden. Hoher Wirkungsgrad Umwandlung von Xylit zu L-Xylulose in Ganzzellsystemen wurde bereits berichtet , in Pantoea ananatis 21,22, sp Alcaligenes. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 und Escherichia coli 26. In E. coli wurde jedoch nur unter Verwendung von niedrig (<67 mM) Konzentrationen Xylit 26 aufgrund möglicher inhibitorischen Wirkungen von einem Anfangs Xylit Konzentration höher als 1 erreicht00 mM auf Xylit-4-Dehydrogenase - Aktivität 21,26. Das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Xylulose und Xylitol hat sich gezeigt, stark die Bildung von Xylit 25,27 begünstigen. Zusätzlich wird Xylulose Ausbeute durch die Menge der teuren Cofaktoren beschränkt , die in der Abwesenheit eines in situ - Cofaktor - Regenerationssystem zugeführt werden müssen. Zusammen begrenzen diese Faktoren das Potenzial für in nachhaltige Systeme für die L-Xylulose Biosynthese Skalierung.

Um diese Einschränkungen zu überwinden und die L-Xylulose Biotransformation Ausbeute zu verbessern, wurde die Strategie der Cofaktorregenerierung eingesetzt zuerst durch eine gekoppelte Ganzzell biokatalytischen Systems. Genauer gesagt, L-Arabinitol-4 - Dehydrogenase (EC 1.1.1.12) aus Hypocrea jecorina (HjLAD), ein Enzym in den L-Arabinose - Abbauweg von Pilzen, wurde die Umwandlung von L-arabinitol in L-Xylulose 28,29 katalysieren ausgewählte . Wie viele biosynthetischen Enzyme, eine große limitation von HjLAD ist , daß es eine stöchiometrische Menge des teuren Cofaktors Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +, die oxidierte Form von NADH) erfordert , um diese Umwandlung durchzuführen. NADH - Oxidase in Streptococcus pyogenes (SpNox) gefunden wurde , 30,31 hohe Cofaktor-Regeneration Aktivität gezeigt angezeigt werden soll . Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft von SpNox, E. coli - Zellen HjLAD zur Herstellung von L-Xylulose exprimieren , wurden mit E. gekoppelt coli - Zellen SpNox für die Regeneration von NAD + Exprimieren der L-Xylulose - Produktion durch die gekoppelte Reaktion in 1A gezeigt dargestellt zu steigern. Unter optimalen Bedingungen und mit einer Anfangskonzentration von 150 mM L-Arabinit, die maximale L-Xylulose-Ausbeute erreicht 96%, so dass dieses System viel effizienter als die in der Literatur berichtet.

Die Strategie der whole-cell Immobilisierung wurde als nächstes verwendet, um die Wiederverwertbarkeit des gekoppelten biocatalyt verbessernic-System. Häufig verwendete Methoden für die Ganzzell - Immobilisierung umfassen Adsorption / kovalente feste Matrices Verknüpfung Vernetzung / Mitreißen und Verkapselung in polymere Netzwerke 32. Unter diesen Ansätzen ist die am besten geeignete Methode zur Zellimmobilisierung Einkapselung in Calciumalginat-Kügelchen. Ihre milde Geliereigenschaften, inerte wässrigen Matrix und hoher Porosität helfen , die physiologischen Eigenschaften und Funktionalität der eingekapselten Biologicals 33 erhalten. Daher enthält das gekoppelte Biokatalysator System sowohl E. coli - Zellen HjLAD oder SpNox beherbergen , wurde in Calciumalginat Kügelchen immobilisiert auf mehrere Zyklen von L-Xylulose Produktion (Abbildung 2) .Die immobilisiert Biokatalysator System zeigte eine gute Betriebsstabilität, die Aufrechterhaltung 65% der Umwandlungsausbeute des ersten Zyklus nach 7 Zyklen ermöglichen sukzessive Wiederverwendung, während das freie Zellsystem fast vollständig seine katalytische Aktivität verloren.

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Protocol

1. Ganzzellbiokatalysatoren Vorbereitung

HINWEIS: Das rekombinante E. coli - Zellen pET28a- SpNox 31 oder pET28a- HjLAD 28 werden im folgenden als E. beherberge coli SpNox und E. coli HjLAD, respectively.

  1. Impfen eine einzelne Kolonie von E. coli HjLAD in 3 ml Luria-Bertani (LB) Medium mit Kanamycin (50 ug / ml) ergänzt und Inkubation in einem Inkubator - Schüttler O / N bei 37 ° C, 250 Umdrehungen pro Minute.
  2. Verdünne die Kultur von 1: 100 in 200 ml frischem LB , enthaltend 50 ug / ml Kanamycin und Inkubation bei 37 o C, 250 Upm , bis die OD 600 erreicht ~ 0,6.
  3. Induzieren HjLAD Proteinexpression durch Zugabe von 0,1 mM Isopropyl - β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu dem Kulturmedium und Inkubation bei 16 o C, 180 Upm für 16 Stunden.
    1. Alternativ führen Induktion bei 25 ° C, 200 rpm für 6 Stunden, wenn die L-Xylulose-Biosynthese (Schritt 2 unten) wird am selben Tag durchgeführt.
  4. Ernten Sie die induzierte E. coli HjLAD Zellen durch Zentrifugation bei 3.200 xg für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und gehen Sie zu Schritt 2 das Zellpellet zu verarbeiten.
  5. Parallel dazu führen die Schritte 1,1-1,4 für E. coli SpNox.

2. Biosynthese von L-Xylulose durch Kupplung E. coli HjLAD und E. coli SpNox für Kofaktorregenerierung

  1. Resuspendieren der Zellpellets von E. coli HjLAD und E. coli SpNox getrennt in 50 mM Tris-HCl - Puffer (pH 8,0) bei einer Zelldichte von 5,0 g Trockenzellgewicht (gDCW) / L.
    Hinweis: Eine Korrelation zwischen gDCW und der optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD 600) hergestellt werden kann , das Experiment zu vereinfachen. Die Formel, inDieses Protokoll ist ein gDCW / L = 0,722 * OD 600 bis 0,0965, die unter verschiedenen Spektrometern variieren kann.
  2. Mischen Sie 600 ul von 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 & mgr; l von 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 & mgr; l 20 mM NAD + und 150 ul 2 M L-arabinitol in einem 14 ml Rundbodenrohr und bringen zu 2 ml des Reaktionsvolumens durch Zugabe von 550 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
    Hinweis: Das Verhältnis der beiden Ganzzell Biokatalysatoren Menge kann optimiert werden, um die Biosynthese des Produktes zu verbessern. Für das beschriebene System ein Verhältnis von E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 wurde für die L-Xylulose - Biosynthese (1B) als optimal erwiesen.
  3. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 30 ° C, 200 Upm für 8 h.
  4. Sammeln Sie den Überstand nach der Zentrifugation bei 4ºC, 3200 xg für 10 min and fahren Sie mit der L-Xylulose Produktion zu quantifizieren, wie in Schritt 3 weiter unten beschrieben.

3. kolorimetrischen Assay für L-Xylulose Quantification

  1. Aspirat 100 & mgr; l des Reaktionsüberstand von Schritt gesammelt 2,4 in ein 1,5 ml Röhrchen.
  2. Je 50 ul von 1,5% Cystein, 900 & mgr; l 70% iger Schwefelsäure und 50 ul 0,1% Carbazol in Ethanol gelöst und vorsichtig mischen durch das Rohr 3 mal invertiert.
  3. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C, 200 Upm für 20 min.
  4. Anschließend wird die optische Absorption des Reaktionsgemisches bei 560 nm (A 560) unter Verwendung eines Spektrophotometers.
    1. Man verdünnt das Reaktionsgemisch , wenn die A 560 Wert über 1 ist.

4. Immobilisierung von rekombinanten Ganzzellkatalysatoren in Calciumalginatperlen

  1. Man löst 4 g Natriumalginat in 100 ml destilliertem Wasser. Bereiten Sie Alginat-Lösung durch Zugabe von sOdium Alginat zu Wasser, um die Bildung von Klumpen zu vermeiden. Erhitzen Sie die Mischung, wenn nötig.
  2. In 600 & mgr; l von 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD und 600 & mgr; l von 5,0 gDCW / L E. coli SpNox in 1,2 ml 4% Alginat in Schritt 4.1 und mischen Sie die Zellen und Alginat durch vorsichtiges Pipettieren vorbereitet Blasenbildung zu vermeiden.
  3. Absaugen Alginat / Zellsuspension in eine Spritze mit einer Nadel und fügen die Mischung tropfenweise in eine 0,3 M Calciumchlorid (CaCl 2) -Lösung in einem 100 ml Becherglas unter kontinuierlichem Rühren unter Verwendung.
    Hinweis: Das Volumen der CaCl 2 -Lösung für Alginat Wulstbildung verwendet genug sein sollte , um die Alginat - Tröpfchen vollständig eingetaucht werden. Zusätzlich muß der Abstand zwischen der Spritzennadel und der Oberfläche der Calciumchloridlösung in einem optimalen Bereich gehalten werden Bildung sphärischen Kügelchen gleichmäßig zu gewährleisten. Der optimale Abstand Bereich kann Experiment bestimmt werdenally und hängt von dem Innendurchmesser der Nadel. Als Schätzung wurde ein Abstand von ca. 15 ± 5 cm gefunden für ein 0,6 cm (Innendurchmesser) Spritzennadel optimal.
  4. Lassen Sie die Perlen in der CaCl 2 -Lösung für 2 - 3 h bei RT ohne Rühren Vernetzung und Gelkügelchen Bildung zu ermöglichen.
  5. Dekantiert die CaCl 2 -Lösung ohne die Perlen zu stören , indem Sie vorsichtig die CaCl 2 -Lösung in einem 50 ml konischen Röhrchen gegossen, und übertragen Sie die restlichen Perlen in CaCl 2 Lösung in einen anderen 50 ml konischen Röhrchen.
  6. Waschen der Kügelchen mit 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) dreimal Puffer übermßige CaCl 2 und un-eingekapselten Zellen zu entfernen.
    HINWEIS: Zu jedem gegebenen Schritt, nicht zentrifugiert werden die Perlen nicht als so tun wird sie zerreißen. Um die Perlen aus der Lösung zu trennen, damit die Suspension ungestört stehen 3 - 5 min. Die Perlen werden am Boden absetzen und der Waschpuffer kann dekantiert werdenin einen anderen Behälter.
    1. Sie nicht die verwendete Waschpuffer verwerfen. Pool der verwendeten Tris-HCl - Waschpuffer (30 ml) mit der verwendeten CaCl 2 - Lösung aus Schritt gesammelt 4.5.
  7. Pellet die un-immobilisiert E. coli - Zellen durch Zentrifugation des gepoolten CaCl 2 und Tris-HCl - Lösung aus Schritt 4.6 bei 3.200 × g für 20 min gesammelt. Um die Immobilisierung Effizienz bestimmen, die Berechnung der Dichte der pelle un-eingekapselten Zellen in gDCW / L, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
  8. Übertragen Sie die gewaschenen Kügelchen aus Schritt 4.6 in einem Rohr. Führen Sie die Schritte 2,2-3,4 L-Xylulose Biosynthese alle der gewaschenen Kügelchen anstelle von Zellpellets zu bewerten verwenden.

5. Stabilität Assay immobilisierter Biokatalysatoren für L-Xylulose Produktion

  1. Sammeln der Kügelchen aus Schritt 4.8 und wäscht zweimal mit 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) Puffer ohne Zentrifugation (wie in Schritt 4.6 beschrieben).
  2. Verwenden Sie alleder gewaschenen Kügelchen, die Reaktion durchzuführen, wie in den Schritten 2.2 beschrieben - 3.4.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5,1-5,2 für die gewünschte Anzahl von Produktionszyklen und messen die Menge an L-Xylulose im Reaktionsüberstand in jedem Zyklus erzeugt.

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Representative Results

Damit wurde Cofactorregenerierung, L-Xylulose - Synthese durchgeführt in einer gekoppelten whole-cell biokatalytische System enthält E. coli HjLAD und E. coli SpNox Zellen. Nach der Optimierung der verschiedenen Parameter wurde die Wiederverwendbarkeit dieses Systems verbessert , indem es in Calciumalginat - Kügelchen zu immobilisieren (Abbildung 2).

L-Xylulose Produktion mit Kofaktorregenerierung durch Kupplung E. coli HjLAD und E. coli SpNox Zellen.
Zur Verbesserung der Biokonversion von L-arabinitol in L-Xylulose, die E. coli HjLAD und E. coli - Zellen wurden SpNox gekoppelt zu ermöglichenCofactorregenerierung. Zur Berücksichtigung der Unterschiede in der Proteinexpression und Cofaktor Verfügbarkeit in E. coli SpNox und E. coli HjLAD Zellen, eine Vergleichsstudie der L-Xylulose - Ausbeute auf verschiedenen E. coli SpNox -zu-- E. coli HjLAD - Verhältnisse wurde durchgeführt. Wie in 1B gezeigt ist , erhöht die Ausbeute als E. coli SpNox -zu-- E. coli HjLAD Quote erhöhte sich von 0,13: 1 bis 1: 1. Die Ausbeuten für Verhältnisse erhaltenen 1: 1 und 1,33: 1 waren äquivalent und maximal für diese gekoppeltes System. Alle weiteren Versuche wurden mit dem E. durchgeführt coli SpNox -zu-- E. coli HjLAD Verhältnis von 1: 1. Beginnend mit einer Anfangskonzentration von 150 mM L-Arabinit, die Verwendung von E. coli HjLAD Biokatalysator produziert allein 118 mM L-Xylulose nach 8 h (Sättigungspunktfür L-Xylulose - Konzentration), was eine Ausbeute von 79% (1C) darstellt. Im Vergleich dazu die Verwendung des E. coli HjLAD und E. coli SpNox Zellen bei einem Verhältnis 1: 1 hergestellt 144 mM L-Xylulose, die Ausbeute auf 96% verbessert.

Optimierung der Ganzzellbiokatalysator Immobilisation
Immobilisierung von Biokatalysatoren in Calciumalginat-Perlen bietet viele Vorteile, wie eine verbesserte Lebensfähigkeit infolge des milden Gel-Umgebung, die die Zellen aus den physikalischen Belastungen in einem Bioreaktor schützt. Die Eigenschaften dieser Alginatbeads wird durch Formulierung und Verarbeitungsparameter 34 weitgehend bestimmt. Um die Produktionsausbeute von L-Xylulose durch eine immobilisierte Form des gekoppelten Ganzzellbiokatalysator optimieren oben beschrieben, zwei Parameter, nämlich Natriumalginat Konzentration und CaCl & sub2 ; -Konzentration wurden evaluiert. Diese sindDie wichtigsten Parameter, die die Integrität und Steifigkeit der Calciumalginat-Kügelchen, was wiederum Einfluss auf den Biokatalysator Immobilisierungseffizienz und molekulare Diffusion bestimmen.

Wie in 3A gezeigt, der Biokatalysator Immobilisierung Wirkungsgrad im Bereich eine steigende Tendenz von 1 mit zunehmender Natriumalginat Konzentration nachgewiesen - 3% (w / v). Wenn die Natriumalginat - Konzentration in der Immobilisierung verwendete Matrix war weniger als 1%, die erhaltenen Perlen zerbrechlich und brechen leicht durch geringe mechanische Stabilität waren die meisten der Zellen in das umgebende CaCl 2 -Lösung Freigabe (Daten nicht gezeigt). Nach Erhöhung der Natriumalginat - Konzentration auf mehr als 2%, gehärtetes die resultierenden Kügelchen zu Problemen in der molekularen Diffusion 35 (Figur 4) übermäßig führt. Durch Variation der CaCl 2 -Konzentration ein ähnlicher Trend in den Biokatalysator immobilizat ergabIonen-Effizienz. Für eine feste Konzentration von Natriumalginat (2% w / v) und im Bereich von 0,1 bis 0,4 M CaCl 2, CaCl 2 niedrigere Konzentrationen führte zu einer verringerten Steifigkeit der Sicken und Austreten von Zellen in die umgebende Lösung erhöht. Dies ist aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Ca 2+ -Ionen zum Vernetzen der Guluronat - Blöcke auf dem Alginat Polymerketten 36 (3B). Jedoch von 0,3 M bis 0,4 M , um die CaCl 2 -Konzentration zu erhöhen verbesserte sich nur geringfügig auf die Biokatalysator Immobilisierungseffizienz. Aufgrund der hohen Effizienz der Immobilisierung (> 90%) wurden CaCl 2 -Konzentrationen über 0,4 M nicht ausgewertet. Wenn CaCl 2 -Konzentration von weniger als 0,1 M verwendet wurden, den Biokatalysator zerfiel in der CaCl 2 -Lösung und keine kugelförmigen Perlen gebildet wurden (Daten nicht gezeigt) , das Natriumalginat Tröpfchens enthält.

Zur Maximierung derBiokatalysator Immobilisierungseffizienz , ohne die molekulare Diffusion in den Calciumalginatperlen verlangsamt, das Natriumalginat und CaCl 2 -Konzentration wurden als nächstes für eine verbesserte L-Xylulose Produktion optimiert. Unter Verwendung des gleichen Konzentrationsbereich wie für Immobilisierungseffizienz (1 - 3% w / v Natriumalginat und 0,1 bis 0,4 M CaCl 2), eine optimale Natriumalginat Konzentration von 2% beobachtet maximale Ausbeute an L-Xylulose - Produktion (4A zu erreichen ). Jenseits dieser optimalen Konzentration zeigte die Ausbeute einen rückläufigen Trend. Dies war zu erwarten, aufgrund der Probleme bei der Diffusion mit dem übermäßigen Steifigkeit der Calciumalginat-Perlen verbunden. In ähnlicher Weise wurde die optimale CaCl 2 -Konzentration 0,3 M gefunden (4B) zu sein. In Verbindung mit den dargestellten Daten in Abbildung 3, die optimale Natriumalginat Konzentration (2%) und CaCl & sub2 ; -Konzentration (0,3 M), die die Bildung von Kügelchen erlaubt , mitgeeignete Steifigkeit und Permeabilität wurde festgestellt, minimale Zelle Leckage und maximale L-Xylulose Produktionsausbeute ermöglicht.

Es sollte beachtet werden, dass, ein weiterer Faktor, der die katalytische Gesamtwirkungsgrad des immobilisierten Biokatalysators beeinflusst, ist das Gewicht der Zellkultur eingekapselt. Die katalytische Effizienz steigt mit zunehmender Zellinokulum bis zu einem optimalen Inokulum Gewicht, über die hinaus es zeigt einen rückläufigen Trend 37. Eine mögliche Erklärung für diese Abnahme ist zellulares Überbelegung, die im Laufe der Calciumalginat-Perlen molekulare Diffusion behindert und verringert die katalytische Effizienz des Systems. Unter Verwendung des optimierten Immobilisierung Zustand oben, die höchste L-Xylulose - Produktion mit einer Zellbeladung von 3,75 (gDCW) erhalten wurde / L 16 (Daten nicht gezeigt).

Reusability der Immobilisierte und Free Ganzzellbiokatalysatoren fürL-Xylulose Produktion.
Verwendung der etablierten optimierten Zustand von 1: 1 E. coli SpNox bis E. coli HjLAD Verhältnis, 2% (w / v) Natriumalginat und 0,3 M CaCl 2, die immobilisierte gekoppelt Ganzzellbiokatalysator Ausgang ein maximaler L-Xylulose Ausbeute von 64%, im Vergleich zu einer wesentlich höheren Ausbeute von 96% für die freie gekoppelt Ganzzellsystem (Zyklus 1 von 5). Man beachte , dass die Ausbeute von immobilisierten E. coli HjLAD Zelle war allein nur 32,5% (Daten nicht gezeigt), niedriger ist als die des immobilisierten gekoppelten Systems sowie die kostenlose Single Biokatalysator System (79%, 1C). Diese Reduktion erwartet wurde als Immobilisierung bekannt ist, die Aktivität von Biokatalysatoren zu verringern, die möglicherweise durch Diffusionsbeschränkungen zu Substrat, wurde aber durch den Vorteil einer verbesserten Wiederverwertbarkeit eines Biokatalysators nach Immobilisierung kompensiert. Diese Wirkung auf die Stabilität des Biokatalysators istdurch die rückläufige Tendenz in L-Xylulose Ausbeute zeigten die freien und immobilisierten Systemen unterworfen wird wiederholt zu einem Batch - Reaktionsprozess beobachtet, die in 5 gezeigt. Die Ausbeute für das freie System zeigte einen viel stärkeren Rückgang als die des immobilisierten System, was auf eine rascheren Verlust der Enzymaktivität in dem freien System. Als Ergebnis eine vergleichbare L-Xylulose-Ausbeute für Produktionszyklus beide Systeme 2. Am Ende von 7 Zyklen von aufeinanderfolgenden Wiederverwendungs ​​hatte, aufrechterhalten die eingekapselten Biokatalysatoren ihre Stabilität und behielt 65% der ursprünglichen Ausbeute während die freien whole-cell System beibehalten weniger als 10% seiner Fähigkeit, L-Xylulose zu erzeugen. Dies zeigt, dass die immobilisierten Biokatalysatoren effektiv für die Produktion von L-Xylulose, und daß der Vorteil der verbesserten Wiederverwendbarkeit und Stabilität durch Immobilisierung wiederverwendet werden könnte überwiegt bei weitem die Reduktion der Aktivität des Biokatalysators, verleihen einen signifikanten Vorteil für die Herstellungsverfahren gebracht übereine kostenlose Ganzzellsystem.

Abbildung 1
Abbildung 1. Coupled Whole-cell - System zur biokatalytischen Herstellung von L-Xylulose. (A) Schematische Darstellung der Cofaktor - Regenerationsreaktion in einem gekoppelten Ganzzellsystem auftreten E. umfassend coli - Zellen HjLAD oder SpNox beherbergt sind. (B) Variation der Ausbeute an L-Xylulose mit verschiedenen E. coli SpNox bis E. coli HjLAD Verhältnisse. (C) L-Xylulose Ausbeute aus einer Ganzzellbiokatalysator von nur E. umfasste coli HjLAD im Vergleich zu derjenigen eines gekoppelten Ganzzellsystem von E. umfasst coli HjLAD und E. coli SpNox Zellen von Cofactorregenerierung fähig. Die Parzellen gezeigt repräsentieren durchschnittliche und standard Abweichung von drei unabhängigen Experimenten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Immobilisierung der Ganzzellbiokatalysatoren über Encapsulation in Alginatbeads. Schematische Darstellung der Bildung von einheitlicher Größe Ca 2+ Alginatbeads durch Eintropfen der Natrium - Alginat-Zellsuspension zu einer Lösung von Calciumchlorid. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. beeinflussenden Parameter die Effizienz der Immobilisierung von die Ganzzellbiokatalysator in Alginatperlen. Immobilisierungseffizienz als Funktion von (A) Natriumalginat (% w / v) (B) CaCl 2 (M) -Konzentration. Die gezeigten Plots der Mittelwert und Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Bewertung der Ausbeute an L-Xylulose aus der immobilisierte Coupled Ganzzellbiokatalysator als Funktion von (A) Natriumalginat (% w / v) (B) CaCl 2 (M) -Konzentration. Die Parzellen gezeigt stellen den Mittelwert und Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Beurteilung der Biokatalysator Reusability. Die Ausbeute an L-Xylulose Produktion für 7 aufeinanderfolgenden Zyklen der Wiederverwendung von immobilisiert und frei gekoppelt Ganzzellbiokatalysator ist in dunklen und hellen grau gezeigt. Das Grundstück stellt gezeigt , um die Mittelwert und Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Neueste technologische Fortschritte haben einen Anstieg in der Kommerzialisierung von rekombinanten Biotherapeutika, was zu einem allmählichen Anstieg in ihrem Marktwert in der Biotechnologie-Industrie ermöglicht. Ein solcher Fortschritt ist das Aufkommen von Metabolic Engineering in rekombinanten Mikroorganismen, die ein großes Versprechen bei der Schaffung skalierbare industrielle Systeme 38 gezeigt hat. Wie bei den meisten Verfahren ist die erfolgreiche Kommerzialisierung von rekombinantem Biomolekülen durch gentechnisch veränderte Mikroorganismen hergestellte stark abhängig von der Produktionsausbeute des Systems 39. Dies hat zu der rasanten Entwicklung der "Brute - Force" führte Genetik 39, wo die gerichtete Evolution von biokatalytische Enzyme wurde umgesetzt, um Biokatalysator Aktivität 3 zu verbessern. Jedoch für bestimmte Stoffwechselwege, wie beispielsweise Redox-Wege bloße Biokatalysator Verbesserung ist nicht ausreichend economization Produktionsort zum signifikante Wirkung von OTH durch Beeinflussunger wesentlichen Reaktionsanforderungen, wie teure Cofaktoren. Scale-up von einem solchen System auch mit einer verbesserten Biokatalysatoren dienen nur die Produktionskosten zu erhöhen. Somit sind zusätzliche strategische Methoden für die Vermarktung von Bioreaktionen erforderlichen stöchiometrischen Verhältnisse von Cofaktoren beteiligt sind. Darüber hinaus ist die Wiederverwertbarkeit eines Biokatalysators auch notwendig für die wirtschaftliche Machbarkeit eines Bioprozess verbessert. Um die beschränkende Wirkung des schnellen Cofaktor Verbrauch und schlechte Wiederverwertbarkeit Ganzzellbiokatalysatoren zu überwinden, haben wir vorher einen immobilisierten, gekoppelt mit ganzen Zellen biokatalytische System für Cofactorregenerierung und stabile Wiedereinsatz 16 entwickelt. Beschrieben in der vorliegenden Studie sind die experimentellen Verfahren erforderlich zu koppeln und Co-immobilisieren zwei Ganzzellbiokatalysatoren für eine verbesserte Biotransformation Ausbeute und Wiederverwertbarkeit, zusammen mit den repräsentativen Ergebnissen.

Ein kritischer Faktor zur Kopplung der whole-cell BioCat zu betrachtentalysatoren ist die Aufrechterhaltung einer genauen Kontrolle über die zur Proteininduktionsfestgelegten Bedingungen und biokatalytische Produktbildung Reproduzierbarkeit des Systems zu gewährleisten. Variationen in den Parametern , wie Induktions OD 600, Induktionszeit und IPTG - Konzentration sollte zur Minimierung von Charge zu Charge Variation vermieden werden. Zusätzlich Neubewertung der Zell-zu-Zell-Verhältnis für verschiedene Biotransformationen erforderlich. Beachten Sie, dass die E. coli HjLAD: E. coli SpNox Verhältnis von 1: 1 in dieser Studie berichtet wurde durch experimentelle Optimierung bestimmt eher als die theoretische stöchiometrische Verhältnis. Zur Immobilisierung der rekombinanten Ganzzell-Biokatalysatoren in Calciumalginat-Perlen, gibt es mehrere wichtige Schritte, um sicherzustellen, Einheitlichkeit hinsichtlich der Wulststeifigkeit und Verteilung der Zellen. Erstens muss die Alginatlösung durch langsame Zugabe von Natriumalginat in Wasser, und nicht umgekehrt ein Verklumpen zu verhindern, hergestellt werden, die zusammenULD die lokale Alginat-Konzentration beeinflussen und damit das Ausmaß der Vernetzung. Zweitens sollte vorsichtiges Pipettieren verwendet werden, wenn die Zelle-Alginat-Suspension Behandlung die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, die auf den eingekapselten Zellen Scherspannung verursachen, behindern effizienten Massentransfer und kann sogar die Kügelchen führen zu schweben. Bei Luftblasen in die Suspension eingeleitet, damit die zell Alginatsuspension 20 ungestört stehen - 30 Minuten die Blasen zu entkommen lassen. Drittens, wenn die Perlen machen, muss die Zelle-Alginat-Suspension langsam und vorsichtig in ein ausreichendes Volumen an Calciumchloridlösung für eine gleichmäßige Größe und Morphologie in eine tropfenweise Art und Weise zugegeben werden. unvollständig in Calciumchlorid getaucht Perlen wird eine unregelmäßige Form und eine schlechte Steifigkeit aufweisen, die an Zell Leckage beitragen kann. Schließlich Variabilität im Reaktionsvolumen von Restwaschpuffer zu vermeiden, werden die Perlen in Schritt 4.8 kann leicht mit Filterpapier abgetupft werden (nicht der Luft trocknen lassen).

E. coli SpNox und E. coli HjLAD Zellkulturen und bietet eine bessere Kontrolle in einem gewünschten Verhältnis zwischen den beiden Enzymen beibehalten wird . Darüber hinaus werden auf weniger Stress einzelne Proteine ​​exprimierenden Zellen ausgesetzt als die Coexpression mehrere Proteine, die 40,41 zu einer reduzierten Proteinfehlfaltungen und erhöhte Proteinexpression führen könnte. Somit stellt direkte Ganzzell-Kopplung die Fähigkeit, Multi-Enzym katalytischen Prozessen zu vermitteln, ohne die Produktausbeute wesentlich zu beeinträchtigen. Allerdings etablierte Strategien wie die sorgfältige Auswahl der bakteriellen Promotoren mit unterschiedlicher Stärke 42,43 und Verbesserungen in der Ribosomenbindungsstellen kann 44 sein employed die begrenzte Kontrolle über das Verhältnis von Zielenzyme in Kokultur oder Co-Expressionssysteme zu mildern. Unter den vielen Immobilisierungstechniken stellt Verkapselung mehrere Vorteile zur Immobilisierung Ganzzellbiokatalysatoren über alternative Methoden wie Vernetzung und Adsorption, die für die gereinigten Enzyme besser geeignet sind. Verkapselung von Zellen können auch in einer Vielzahl von Biomaterialien wie Agar, Chitosan, Gummi, Carrageen, Gelatine und Alginat 45 zur Verbesserung der Wiederverwendbarkeit der Biokatalysatoren durchgeführt werden. Jedoch Calciumalginat Verkapselung wurde der effektivste Ansatz in Bezug auf Immobilisierungseffizienz und Biomolekül Produktion 46,47 erwiesen.

Eine große Einschränkung der bakteriellen Ganzzellen - Biokatalysatoren verwendet , ist die minimale Fähigkeit für post-translationale Modifikation von heterologen Proteinen in Wildtyp E. coli 48. Dies schränkt die erfolgreiche Verwendung von eukaryotischen Biokatalysatoren wnnerhalb dieses System. Eine Alternative, diese Einschränkung zu überwinden, könnte die Verwendung von Organismen, wie Hefe, die besser mit eukaryotische posttranslationale Maschinen ausgestattet sind. Eine weitere Einschränkung des beschriebenen Systems ist im Zusammenhang mit der Verwendung der Immobilisierung für eine verbesserte Wiederverwertbarkeit. Immobilisation ist eine gemeinsame kostengünstige Strategie eingesetzt , um die geringe Stabilität von Biokatalysatoren entgegenzuwirken und ihre Umsatzrate verbessern , indem die Bioprozess 49 vereinfacht - 51. Die wichtigsten Parameter, die die katalytische Leistung von verkapselten Ganzzellbiokatalysatoren umfassen Natriumalginat Konzentration, CaCl 2 -Konzentration, Zellenbelastung und Perlengröße beeinflussen. Es ist wichtig zu erkennen, dass diese Parameter nicht voneinander unabhängig sind. Als solche eine umfassende Analyse aller Faktoren in einer einzigen Untersuchung ist sehr zeitaufwendig, so ist es notwendig, die wichtigsten Parameter für die Optimierung auszuwählen. Ausgewertet und hier vorgestellt sind die Auswirkungen vonzwei Parameter, Natriumalginat und CaCl 2 -Konzentration. Obwohl hier nicht im Detail diskutiert, haben wir durchgeführt , die zuvor die Optimierung der Zellenbelastung, auf das Gewicht der Zellen , die die Abhängigkeit der Ausbeute verglichen 16 immobilisiert. Berichte in der Literatur zeigen, dass eine Variation der Perlengröße auch die Produktionsausbeute durch Erhöhung Enzym Verkapselung modulieren könnte, durch erhöhte Oberflächenbereich des immobilisierten Systems oder durch Veränderung der Diffusion von Substraten und Produkten durch veränderte Transporteigenschaften verbessert Aktivität. Je nach den biokatalytischen Reaktionen in Betracht, die Auswahl der alternativen kritischen Faktoren kann erforderlich sein, was zu der Erzeugung eines anderen Satz von optimalen Bedingungen führen könnte. Eine detaillierte Studie zur Schaffung optimaler Bedingungen für zusätzliche Parameter bietet Spielraum für die weitere Verbesserung der Leistung des gekoppelten Ganzzellsystem.

Zusammenfassend berichten wir über die experimentelle Umsettation eines gekoppelten Ganzzell biokatalytischen System in Calciumalginat-Kügelchen immobilisiert, die verbesserte Produktion von L-Xylulose veranschaulicht. Durch verschiedene rekombinante Enzyme exprimieren, die andere Cofaktor-abhängige biokatalytische Wege zu erleichtern, hohe Ausbeuten vieler biologisch relevanter Moleküle können mit dem hier beschriebene Protokoll erhalten werden. Darüber hinaus kann dieses System mehr als zwei rekombinanter Biokatalysatoren für die Ein-Topf - Biosynthese Mehrenzym von Produkten 52 und Anwendungen gerecht zu werden , erweitert außer biokatalytischen Herstellung, wie mikrobielle Biosensoren für biochemische Sauerstoffbedarf 53. Unter Ausnutzung der Synergie Merkmal dieses Systems, Verkapselung von symbiotischen mikrobiellen Konsortien können für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden , wie zum Beispiel bioremediation 54-56, whole-cell Bioverfahrenstechnik für Biokraftstoffe 57, Förderung des Pflanzenwachstums durch Boden Bioaugmentation 58 und Biomining zur Metallrückgewinnung 59

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Das Papier zielt auf die Berichterstattung detaillierte Methodik eine gekoppelte whole-cell biokatalytische System in Alginatbeads immobilisiert zu erzeugen. Scientific Neuheiten wurden in einer früheren Studie 16 gemeldet.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von der Grundlagenforschung Forschungsprogramm durch die National Research Foundation of Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (NRF-2013R1A1A2012159 und NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University, und dem Department of Chemical Engineering und mcubed finanziert unterstützt Programm an der University of Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27, (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110, (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54, (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76, (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92, (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32, (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15, (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72, (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5, (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14, (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20, (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106, (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45, (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89, (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39, (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72, (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62, (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90, (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72, (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49, (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72, (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40, (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74, (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36, (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67, (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271, (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34, (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76, (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41, (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11, (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14, (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33, (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22, (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103, (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9, (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30, (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15, (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50, (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163, (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40, (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100, (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30, (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100, (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7, (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012, (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3, (203), (2012).

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