ككل جبل
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) هي تقنية تسمح للقرار المكاني للجزيئات الحمض النووي (في كثير من الأحيان من mRNAs) ضمن إعداد الأنسجة "جبل بأكمله، أو مرحلة النمو (مثل الجنين أو يرقة) من الفائدة. WMISH هي قوية للغاية لأنها يمكن أن تساهم بشكل كبير في توصيف وظيفي من الجينوم metazoan معقدة، وهو التحدي الذي أصبح أكثر من عنق الزجاجة مع طوفان من البيانات تسلسل الجيل القادم. على الرغم من بساطة المفاهيمية للتقنية وغالبا ما يحتاج الكثير من الوقت لتحسين مختلف المعايير المتأصلة في تجارب WMISH لنظم نموذج الجديدة؛ يعني الفروق الدقيقة في خصائص الخلوية والكيمياء الحيوية بين أنواع الأنسجة والمراحل التطويرية التي أسلوب WMISH واحد قد لا يكون مناسبا لجميع الحالات. لقد قمنا بتطوير مجموعة من الأساليب WMISH لعاودت الظهور نموذج البطني المنقعية الراكدة التي تولد يتفق وإشارات WMISH واضحة لمجموعة من الجينات، وعبر جميع مراحل النمو. وتشمل هذه الأساليب احالة يرقات العمر الزمني غير معروف إلى نافذة التخلق، وإزالة فعالة للأجنة ويرقات من كبسولات البيض، وتطبيق العلاج بروتين-K المناسبة لكل نافذة التخلق، والتهجين، بعد التهجين ومناعي خطوات. وتوفر هذه الأساليب على الأساس الذي الإشارة الناتجة عن نسخة RNA معينة يمكن أن يكون مزيد من الصقل مع تعديلات محددة التحقيق (التحقيق في المقام الأول التركيز ودرجة الحرارة التهجين).

Introduction

الرخويات هي مجموعة من الحيوانات التي تحمل الفائدة من تنوع واسع من التخصصات العلمية. وعلى الرغم من تنوع الصرفي من ثراء الأنواع (في المرتبة الثانية بعد المفصليات من حيث عدد الأنواع 2) وصلة إلى مجموعة واسعة من التجارية 4 الطبية والعلمية القضايا 5-8، هناك عدد قليل نسبيا من الأنواع الرخويات التي يمكن أن تدعي ل يكون كلا النموذجين علمية مجهزة تجهيزا جيدا وسهلة للحفاظ في بيئة معملية. واحد الرخويات التي تستخدم كثيرا من قبل التخصصات مثل علم الأعصاب والسمية الإيكولوجية 10 وأكثر في الآونة الأخيرة البيولوجيا التطورية 11،12، هو المنقعية الراكدة، وذلك أساسا بسبب التوزيع على نطاق واسع وسهولة القصوى من الصيانة. وعلى الرغم من شعبيته بوصفه الكائن 'نموذج' وتاريخها الطويل من الاستخدام من قبل علماء البيولوجيا التطورية 13-19، ومجموعة وقوة الأدوات الجزيئية المتاحة للL. stagnيكمن المجتمع العلمي أليس بعيدا وراء ذلك من مزيد من النماذج التقليدية الحيوان (ذبابة الفاكهة، والماوس، قنفذ البحر والديدان الخيطية).

لدينا الرغبة في تطوير المنقعية كما ينبع نموذج جزيئي من مصلحة في الآليات الجزيئية التي توجه تشكيل قذيفة. هذا دفعنا لصقل مجموعة من التقنيات التي من شأنها أن تسمح لتصور فعال، بما يتفق وحساسة في التعبير الجيني خلال تطوير المنقعية الصورة. جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) يعمل على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذج والتي تم فيها استخدام لأكثر من 40 عاما 20. في وجوهها المختلفة، ISH يمكن استخدامها في توطين مكانيا مواضع محددة على الكروموسومات، الريباسي، مرنا والرنا الصغير.

واحدة من التحديات التي تحتاج إلى معالجة قبل صقل طريقة WMISH لL. كان الراكدة قضية استخراج بلطف وكفاءة الأجنة واليرقات من مراحل متفاوتة من رانه كبسولات البيض التي يتم إيداعها. هذا الاستخلاص، أو "نزع المحفظة"، يحتاج إلى أن يتحقق بكفاءة من أجل جمع المادية الكافية لالواردة في تجربة الموقع، وفي الوقت نفسه الحفاظ على سلامة المورفولوجية والخلوية. بينما الكائنات النموذج الأخرى أيضا الخضوع لتطوير مغلفة، في أيدينا يمكن أن تستخدم أيا من الأساليب ذكرت لتلك الأنواع بنجاح في L. الراكدة.

وبالتالي فإن الأهداف العامة لهذه الطريقة هي: لاستخراج L. الراكدة الأجنة واليرقات من كبسولات بها بطريقة الإنتاجية العالية، لتطبيق علاجات ما قبل التهجين أن تحسين إشارة WMISH، لإعداد الأجنة واليرقات مع WMISHsignals مرضية للتصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الخطوات التالية توضح طريقة لدينا لإجراء التجربة في الموقعي على المراحل الجنينية واليرقات من L. الراكدة. أين ينطوي على خطوة استخدام المواد الكيميائية الخطرة ويدل على ذلك كلمة "تنبيه" وجميع إجراءات السلامة المناسبة التي ينبغي اعتمادها. وتقدم وصلات إلى أوراق MSDS التمثيلية للمواد الكيميائية الخطرة في الملف التكميلي 1. وتقدم وصفات لجميع الكواشف في الملف التكميلي 2.

الجمعية 1. من نزع المحفظة جهاز

  1. للقيام بذلك، قم بتوصيل 20 الحقنة مل إلى أنبوب السيليكون (التي يبلغ قطرها الداخلي من 1 ملم وقطرها الخارجي من 3 ملم) باستخدام قطع P1،000 طرف إلى الطول المناسب كما هو مبين في الشكل 2A.
  2. الشريط شريحة المجهر القياسية لطبق بتري كبير مقلوب. الشريط أنابيب السيليكون متاخم لشريحة المجهر كما هو مبين في الشكل60، 2C و 2D.
  3. راحة إبرة الزجاج سحبت على شريحة المجهر وبلطف أدخله في أنابيب السيليكون حتى غيض من الإبرة يبرز ما يقرب من 20٪ من الطريق في جميع أنحاء القطر الداخلي للأنابيب (انظر الشكل 2C و 2D). وبمجرد أن الإبرة في الشريط موقف وصولا الى طبق بيتري.
  4. السماح للنهاية خالية من أنابيب السيليكون للراحة في طبق بيتري أخرى من شأنها أن جمع المواد الأرتيميا decapsulated.

2. عينة جمع والتثبيت ونزع المحفظة

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات من على RT ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. جمع بعناية سلاسل البيض من جدران الحوض. للقيام بذلك، استخدم قطعة مسطحة من البلاستيك المرن كما ملعقة لتتخلص من سلسلة البيض قبالة الركيزة، واستخدام مصفاة الشاي البلاستيكية لصيد السمك سلسلة البيض تسربت من الماء. مرحلة وفرز المواد تحت المجهر باستخدام دليل المنصوص عليها في الشكل1.
  2. وضع سلسلة البيض على منشفة ورقية وجعل شق طولي على طول كتلة البيض باستخدام ملقط وزن الريشة. لفة كبسولات البيض من سلسلة البيض وإزالة أكبر قدر من المواد هلام ممكن من كل كبسولة عن طريق دفع لهم في جميع أنحاء منشفة ورقية باستخدام ملقط وزن الريشة.
  3. باستخدام ملقط وزن الريشة، ونقل كبسولات البيض في طبق بتري تحتوي على 5 مل من ماء الصنبور. مواصلة جمع كبسولات البيض هلامي دي من مراحل النمو المطلوب في هذا الطبق. جمع كبسولات كافية من جميع المراحل التنموية للتجربة WMISH المخطط ثم الانتقال إلى الخطوة التالية.
  4. عند العمل مع يرقات الأكثر تقدما (5 آخر أيام الانقسام الأول (dpfc) وما فوق) تخدير لهم قبل التثبيت.
    ملاحظة: هذا سوف يمنع العضلات من التعاقد مما يجعل تفسير في الموقع أنماط تلطيخ صعبة للغاية.
    1. الاسترخاء اليرقات (في حين أنها لا تزال في capsu بهمليه) في 2٪ ث / ت حل MgCl 2 • 6H 2 O لمدة 30 دقيقة قبل التثبيت.
    2. تقييم درجة من الاسترخاء بعد 30 دقيقة عن طريق غمر العديد من اليرقات في حين لا يزال في كبسولات البيض في حل تثبيتي، ورصد استجابتها تحت المجهر. غير كامل اليرقات استرخاء سوف تتراجع في قشرتها، في حين أن اليرقات استرخاء تماما لم يستجب. مرة واحدة وقد تم تخفيف هذه اليرقات تنتقل إلى الخطوة التالية.
  5. نقل كبسولات البيض باستخدام ماصة تتحمل البلاستيك واسعة في أنبوب قابل للغلق التي توفر 10 أضعاف حجم كبسولات البيض (على سبيل المثال، سوف 1 مل من كبسولات استقر تتطلب أنبوب مل 10+).
  6. نضح قدر السائل ممكن من الأنبوب واستبدالها مع حجم محلول تثبيتي التي هي من 10X حجم كبسولات البيض تسويتها. تناوب بلطف كبسولات البيض في تثبيتي في RT للمرة المناسب لكل مرحلة التطوير (انظر الشكل 1).
  7. Discontinتناوب رق والسماح للكبسولات لإغراق ونضح الحل تثبيتي في وعاء النفايات المناسبة.
  8. غسل كبسولات البيض بالاستعاضة عن حل تثبيتي مع الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1٪ توين 20 (PBTw) وتناوب على RT لمدة 5 دقائق. نضح PBTw وكرر مرتين.
  9. إزالة الأجنة واليرقات من الكبسولات الخاصة بهم باستخدام جهاز (انظر القسم 1 لمزيد من التفاصيل) هو موضح في الشكل (2). ارسم كبسولات تصل الى حقنة 20 مل، ونعلق الأنبوب ومن ثم تبديد كبسولات من خلال أنابيب والماضي الإبرة الزجاج للخروج الى الطبق جمع.
    ملاحظة: عادة، يجب أن الأغلبية (> 90٪) من جميع كبسولات يحتاج مرور واحد فقط من خلال الجهاز. في كثير من الحالات تلف غشاء الكبسولة ولكن تبقى الأجنة واليرقات داخل كبسولة تمزق. اعادة معالجة هذه المواد ببساطة عن طريق صياغته في حقنة وتبديد ذلك مرة أخرى.
  10. جمع الأجنة الأرتيميا decapsulated واليرقات في أنبوب 1.5 مل باستخدام هيئة التصنيع العسكري(- قطع 3 يوم اليرقات البالغة من العمر، وP200 ليرقات القديمة مع نهاية غيض قبالة P20 ل0) ropipette.
    ملاحظة: وقفة (لمدة تصل إلى عدة أشهر) في البروتوكول يمكن أن يتخذ في هذه المرحلة. إذا تطلب الأمر ذلك، والمواد decapsuled ينبغي جمع في أنبوب 1.5 مل لتخزين (انتقل إلى الخطوة التالية). مواصلة خلاف ذلك فورا إلى بروتوكول 3.
  11. السماح للأجنة ويرقات لتنزل الى قاع الأنبوب ونضح طاف. استبدال 33٪ من الإيثانول (ETOH) في PBTw وترك الجلوس لمدة 5-10 دقائق. كرر مع 66٪ ETOH في PBTw و 100٪ ETOH. غسل اليرقات مرتين في 100٪ ETOH في RT. تخزين المواد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في 100٪ ETOH.
  12. عندما تصبح مستعدة لمواصلة، وإعادة هيدرات العينات عن طريق إزالة 100٪ ETOH واستبدالها مع 66٪ ETOH في PBTw، واسمحوا الجلوس لمدة 5-10 دقائق. كرر مع 33٪ ETOH في PBTw، ترك الجلوس لمدة 5-10 دقائق. وأخيرا يغسل 3X 5 يغسل دقيقة من PBTw لضمان إزالة جميع ETOH.

3. بروتين-K، الشاي والمشاركة فايxation

ملاحظة: نحن يجد أداء الخطوات التالية في سلال صغيرة مع أرضية شبكة الأسلوب الأكثر فعالية ولطيف لتبادل بسرعة حلول حاسمة الوقت. في حين أن هذه يمكن أن تكون محلية الصنع، ونحن نستخدم سلال (متوسطة الحجم) التي تتوافق مع Intavis InSituPro -Vsi التعامل مع السائل الروبوت (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). هذه السلال يمكن بسرعة وسهولة نقلها بين الآبار بئر طبق نسيج الثقافة 12 (TCD) من أجل حلول الصرف، أو الحل يمكن أن يستنشق من البئر باستخدام ماصة. بدلا من ذلك، كل عمليات التبادل الحل لا يمكن أن يؤديها من دون هذه السلال ببساطة عن طريق الشفط طاف من اليرقات. في هذه الحالة حركة يحوم طيف ستركز جميع الأجنة واليرقات إلى وسط الطبق السماح طاف لإزالتها من على حافة البئر. يفترض ما يلي المستخدم يوظف سلال للتبادلات حل.

  1. باستخدام ماصة، نقل الأجنة واليرقات في سلة يجلس في TCD 12 جيدا مع 2 مل من PBTw.
    ملاحظة: عدد الأجنة و / أو اليرقات التي يمكن أن تضاف يعتمد على مرحلة تنموية قيد التحقيق، ولكن كقاعدة عامة من التجربة هو للحفاظ على لا يقل عن 25٪ من مساحة خالية من الأجنة / اليرقات (أي، لا ازدحام سلة).
  2. إعداد المتاخمة جيدا مع 2 مل من محلول بروتين-K المناسب (انظر الشكل 1)، و 2 بئرا أخرى مع 2 مل من 0.2٪ جليكاين لكل منهما. نقل كل سلة في تحتوي أيضا على التركيز المناسب من بروتين-K وبدء توقيت فورا.
  3. بعد 10 دقيقة نقل كل سلة الى يحتوي أيضا 0.2٪ جليكاين واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم نقل كل السلة في البئر الثانية مع 0.2٪ جليكاين واحتضان لمدة 5 دقائق. تغسل جليكاين مع 3X 5 التبادل دقيقة من 3 مل PBTw.
  4. إزالة حل PBTw ومعالجة عينات مرة واحدة مع ترايثولامين (TEA) سول الطازجةution لتنبيه 5 دقائق! لا يتحركون. استبدال مع 3 مل من محلول الشاي الطازجة لمدة 5 دقائق. لا تستنهض الهمم. نضح غالبية حل الشاي من العينات. إضافة ترايثولامين الطازجة مع أنهيدريد الخليك (TEAAA) حل واحتضان لمدة 5 دقائق. تنبيه! لا تستنهض الهمم.
  5. اختياري - في حين أن الخطوة أعلاه ويحتضنها، وإعداد دفعة جديدة أخرى من حل TEAAA وكرر الخطوة أعلاه.
    ملاحظة: هذه المعاملة الثانية التي TEAAA اختيارية ولكنها قد تساعد في القضاء نهائيا على كل خلفية مع تحقيقات عرضة لتوليد الخلفية.
  6. إزالة حل TEAAA بواسطة الشفط أنه من البئر واستبدالها مع 3 مل من PBTw. لا تستنهض الهمم. إزالة PBTw وتطبيق 3 مل من 3.7٪ الفورمالديهايد في PBTw. دوامة بلطف من حين لآخر أثناء الحضانة 30 دقيقة.
  7. إزالة تثبيتي بواسطة الشفط أنه من البئر واستبدالها مع 3 مل من PBTw. نقل المواد إلى أنبوب 1.5 مل. Replace وPBTw مع العازلة التهجين واحتضان لمدة 5 دقائق على RT - تنبيه.
  8. وضع أنابيب في كتلة ساخنة في RT، وضبط درجة الحرارة لدرجة الحرارة التهجين المطلوب.
    ملاحظة: درجة الحرارة التهجين هو تحقيق خاصة، وسوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل تجريبيا، ومع ذلك نجد 55 درجة مئوية إلى أن تكون درجة حرارة جيدة لفي البداية محاكمة. السماح للكتلة أن يأتي إلى درجة حرارة التهجين، والسماح للعينات ما قبل هجن لحوالي 15 دقيقة (أي الوقت اللازم لإعداد وriboprobes، تعد غير ضرورية). إعداد كميات كافية (عادة 100 ميكرولتر) من riboprobes المخفف. نحن تركيزات التحقيق عادة محاكمة 100 و 500 نانوغرام / مل باعتبارها مجموعة الأولي. نحن نستعد riboprobes وفقا ل12.
  9. إزالة المنطقة العازلة التهجين من العينات وإضافة التحقيق في المخزن التهجين للعينات. تراكب مع 100 ميكرولتر (أو حجم كاف لتشكيل المرحلة فوق المنطقة العازله التهجينص) من الزيوت المعدنية.
    ملاحظة: إن الزيوت المعدنية يمنع التكثيف واسعة النطاق التي ستشكل خلال الخطوة التهجين طويلة. والتكثيف واسعة يغير كثيرا كل من الكيمياء من الحل التهجين وتركيز لجنة التحقيق.
  10. تفسد التحقيق والحمض النووي الريبي الهدف عن طريق تسخين العينات إلى 75 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم تخفف الحرارة إلى درجة حرارة التهجين المطلوب. السماح التهجين المضي قدما لمدة لا تقل عن 12 ساعة (O / N) أو أكثر (24 - 48 ساعة).
  11. خلال التهجين إزالة أنبوب واحد من كتلة الحرارة، وتناوب عليها بسرعة بين الإبهام والسبابة على تعليق اليرقات من دون إزعاج مرحلة النفط، ويحل محله في كتلة الحرارة. كرر ذلك مرة واحدة كل 6-12 ساعة أو نحو ذلك.

4. يغسل الساخنة ومناعي

ملاحظة: في حين أننا نستخدم الروبوت التعامل مع السائل للخطوات التالية، وهذه يمكن أيضا بسهولة أن يتم ذلك يدويا. في هذه الحالة، أجنة ويرقات شويونيتبول أن تبقى في 1.5 مل أنابيب كانوا المهجنة في. ويستنشق جميع التبادلات حل لاحقة، وأضاف مع ماصة P1،000. عندما يقوم يدويا في كل من الخطوات التالية يجب أن توظف 1 مل من كل حل.

  1. كميات كافية الحرارة (3 مل لكل منهما لكل عينة) من 4X، 2X و1X حلول غسل لدرجة الحرارة التهجين.
  2. غسل جميع العينات ثلاث مرات في المخزن غسل 4x ولمدة 15 دقيقة كل في درجة الحرارة التهجين. غسل جميع العينات ثلاث مرات في غسل العازلة 2X لمدة 15 دقيقة كل في درجة الحرارة التهجين. غسل جميع العينات ثلاث مرات في غسل العازلة 1X لمدة 15 دقيقة كل في درجة الحرارة التهجين.
  3. غسل جميع العينات مرة واحدة مع العازلة 1X كلوريد الصوديوم سترات الصوديوم + 0.1٪ توين (SSC + 0.1٪ توين) في درجة الحرارة التهجين. السماح للعينات لتبرد إلى RT.
  4. غسل جميع العينات مرتين في 1X SSC + 0.1٪ توين لمدة 15 دقيقة استبدال هذا الحل SSC 1X مع حمض ماليك العازلة (MAB) واتركيه لمدة 10 دقيقة كرر MAB ثرماد. استبدال MAB مع حل كتلة واحتضان لمدة 1.5 ساعة.
  5. تبادل حل كتلة الحل الأجسام المضادة (1: 10000 التخفيف من الأجسام المضادة في حل كتلة)، واحتضان لمدة 12 ساعة (O / N) في RT مع الإثارة لطيف.

5. اللون تنمية وتركيب

  1. نضح الحل الأجسام المضادة ويغسل 15 مرات مع PBTw لمدة 10 دقيقة لكل منهما. استبدال PBTw مع 1X الفوسفاتيز القلوية العازلة (ا ف ب)، واحتضان لمدة 10 دقيقة.
  2. في حين أن عائدات خطوة الحضانة المذكورة أعلاه، تعد الحل تلطيخ AP (انظر الملف التكميلي 2) - تنبيه. نقل المواد إلى TCD جيدا واستبدال الحل ا ف ب 1X مع الحل ا ف ب تلطيخ. لاحظ الوقت الآن بحيث يكون طول الوقت رد فعل اللون يأخذ مكان يمكن تسجيلها. مراقبة تطور نمط تلطيخ حتى إشارة إلى نسبة الخلفية المثلى.
  3. لوقف تطوير اللون، وإزالة حل تلطيخ 1X ا ف ب (التصرف في النفايات المناسبالبريد حاوية)، وتطبيق 2 مل من PBTw ويلاحظ الساعة الآن. شطف مرتين أكثر مع PBTw لمدة 5 دقائق لكل منهما. استخدم أحد هذه يشطف لنقل المواد في أنبوب 1.5 مل.
  4. إزالة PBTw وتطبيق 1 مل من 3.7٪ الفورمالديهايد في PBTw وتستنهض الهمم أو تدوير للالأقل 30 دقيقة في RT (وهذا يمكن أيضا أن يتم O / N).
  5. تغسل تثبيتي مع 3 يغسل من PBT (التخلص تثبيتي النفايات في حاوية النفايات المناسبة). غسل العينات 3 مرات في 50 درجة مئوية في دي المتأينة المياه.
    ملاحظة: هذه يغسل القضاء على ترسب الأملاح التي قد تصبح مرئية خلال المقاصة والخطوات التصور.
  6. تقرر ما إذا كانت العينات يجب أن يتم تنظيمها في البنزيل بنزوات: البنزيل الكحول (BB: BA، المعروف أيضا باسم اضحة موراي) أو الجلسرين.
    ملاحظة: نحن نفضل أكثر قوة وكيل تخليص BB: BA كما L. الأجنة الراكدة هي مبهمة بعض الشيء. عينات ليتم تنظيمها في BB: سوف BA تحتاج أولا إلى أن المجففة من خلال سلسلة الايثانول. عينات ليتم تنظيمها في 60٪الجلسرين يمكن تركيبه على الفور.
  7. نقل العينات إلى الحل تركيب (BB: بكالوريوس أو 60٪ الجلسرين) باستخدام ماصة.
    ملاحظة: عند تركيب في BB: BA هذا يجب أن يتم في كوب جيدا (BB: سوف BA إذابة البلاستيك البولي).
  8. السماح للعينات واضحة ل5-10 دقائق، ثم جبل لهم على شريحة باستخدام عدد مناسب من coverslips مكدسة والفواصل (1 ساترة للعينات <1 dpfc، 2 coverslips لعينات> 1 dpfc).
    ملاحظة: يمكن الآن يتصاعد الجامع يمكن تصوير باستخدام المجهر المركب مع بصريات مدينة دبي للإنترنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء أنماط تلطيخ WMISH ممثل هو مبين في الشكل (3) باستخدام تقنية الموضحة أعلاه، وتعكس مجموعة متنوعة من أنماط التعبير المكاني للجينات لها دور في مجموعة من العمليات الجزيئية بدءا من تشكيل قذيفة (الجينات رواية 1 و 2 و 3 و 4)، إلى إشارات الخلية خلية (النيابة العامة) لتنظيم النسخ (براتشيوري) عبر مجموعة من المراحل التنموية. في حين أننا لم كميا مستويات التعبير عن هذه الجينات نتوقع أن لو كانوا أيضا تتفاوت تفاوتا كبيرا، مشيرا إلى أن لدينا وسيلة يمكن تطبيقه على مجموعة واسعة من المنتجات الجينات التي أعرب عنها في جميع مراحل التنمية على مختلف المستويات. فقط واحد من الجينات المقدمة هنا (النيابة العامة) وقد وصفت سابقا في L. الراكدة 21،22. نتائج نقدم هنا هي إلى حد كبير تماشيا مع هذه التقارير السابقة، ولكن مع ارتفاع ملحوظ قرار يتخذ المكاني lution. وقد وصفت نمط التعبير المكاني للبراتشيوري في أذن البحر 23 والبطلينوس 24 و في كلتا الحالتين تم الكشف أيضا في الخلايا عباءة كما نجد لL. الراكدة (الشكل 3F). نحن عزل الجينات رواية 1-4 (من شاشة البروتين تهدف إلى التعرف على المنتجات الجينات بشكل مباشر في تشكيل قذيفة، وذلك أنماطها التعبير المكانية المرتبطة الغدة قذيفة (الشكل 3A و B) أو الحقل قذيفة (الشكل 3C و D) هي متطابقة تماما مع وظائف تشكيل قذيفة. وهذه النتائج تشير إلى أن تقنية إنتاجية عالية وضعنا لإزالة الأجنة واليرقات من كبسولة البيض، والعلاجات permeabilization المرحلة اللاحقة الخاصة، وتوليد عينات جبل بأكمله من شأنها أن تسفر جودة عالية في تلطيخ الموقع أنماط لمجموعة واسعة من الجينات لجميع مراحل التطور الجنيني واليرقات.

ove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 1
الشكل 1. تلخيص تطور الجنين من المنقعية الراكدة والتثبيت المقابلة وبروتين-K العلاجات. صور الممثل الأجنة واليرقات من 7 أيام الأولى من تطوير توضح زيادة كبيرة في حجم (الصف 1) وتعقيد المورفولوجي (الصفوف 2 و 3) . هذه التغيرات التنموية تترجم إلى اختلافات كبيرة في الوقت المناسب تثبيت وتركيز بروتين-K التي تولد إشارات WMISH المثلى. لWMISH ينبغي أن تكون ثابتة جميع مراحل 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني في RT مع الإثارة لطيف داخل كبسولات البيض الخاصة بهم. ثم ينبغي أن يعامل جميع مراحل مع التركيز المناسب بروتين-K لمدة 10 دقيقة. لاحظ أن نلاحظ كبير الاختلاف بين دفعة في نشاط بروتين-K من مورد لدينا. يجب أن تمثل هذا الاختلاف عليها performiنانوغرام جولة من "معايرة" التجارب WMISH حيث النشاط من جديد بروتين-K مصمم تجريبيا. ولذلك ينبغي أن يعامل تركيزات بروتين-K جاء في الرقم كدليل الأولي، إلا أن تركيزات النسبية بين مراحل النمو (على سبيل المثال 2 يوم الأجنة القديمة تتطلب تركيز بروتين-K 3 مرات أعلى من يوم 1 الأجنة) يتم تعيين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. جهاز يستخدم لDecapsule L. الراكدة الأجنة. (أ) لمحة عامة عن الجهاز الذي يمكن أن يزيل L. بكفاءة الأجنة الراكدة ويرقات من كبسولات بها. (ب) وتضخيم ضوءالمنطقة الصفراء محاصر في الفقرة (أ). يتم وضع إبرة زجاج حادة على شريحة المجهر وإدراجها في أنبوب السيليكون (القطر الداخلي 1 ملم، القطر الخارجي 3 مم) بحيث غيض يبرز ما يقرب من 20٪ من الطريق في تجويف الأنبوب. ثم يتم مسجلة الإبرة الزجاج أيضا على شريحة المجهر وطبق بيتري. (C) نظرا A ​​'خطة' التخطيطي القسم محاصر الأصفر في A. كبسولات البيض يحتوي على أجنة الثابتة واليرقات وأول جمعها باستخدام الحقنة 20 مل. ومن ثم تعلق المحقنة إلى الأنبوب السيليكون وكبسولات طرد عبر الأنابيب والماضي الإبرة. تتمزق الأغشية البيض كبسولة بواسطة الإبرة والمواد الجنينية واليرقات المحررة يمكن جمعها من الطبق جمع باستخدام micropipette. (D) A 'عبر قسم "تخطيطيا القسم محاصر الأصفر في ألف شريحة المجهر يضمن أن إبرة تدخل أنابيب السيليكون في ذروة الصحيح. (F) وجهة نظر تمثيلية من اليرقات التي جعلت مسار واحد عبر الجهاز. تمت إزالة أكثر من 90٪ من المواد بشكل فعال وبلطف من الكبسولات الخاصة بهم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. صور الممثل من أنماط التعبير WMISH ضد مجموعة متنوعة من الجينات من مجموعة من L. وقد تم تجهيز مراحل الراكدة التنموية منشأ بواسطة الطريقة الموصوفة هنا جميع مراحل النمو كما هو موضح في الطريقة المذكورة أعلاه وتصاعدت وتصويرها في BB: BA (واضح موراي). وأشار الأعمار التقريبية في ليشار الحق p من كل لوحة والتوجه في أسفل اليمين. يشار orthology الجين (عندما معروفة) في الجزء الأيمن السفلي من كل لوحة. الاختصارات: قذيفة غدة (سان جرمان). الحقل قذيفة (سادس)؛ عباءة (طن متري)؛ القدم (قدم)؛ Decapentaplegic (النيابة العامة)؛ dpfc (آخر أيام الانقسام الأول). جميع الحانات على نطاق وهي 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يسمح التصور الفعال للنسخ الرنا مع فرضا متفاوتة مستويات التعبير في جميع مراحل تطور المنقعية الراكدة. لإزالة الأجنة واليرقات من كبسولات بهم ونحن محاكمتهم مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية، صدمة التناضحي والمعالجات الفيزيائية وذكرت لencapsulated- الآخر تطوير الكائنات النموذج. ومع ذلك، في أيدينا طريقة وصفنا هنا هو تقنية عالية الإنتاجية الوحيدة التي تزيل غشاء المحفظة صعبة دون الإضرار الأجنة واليرقات. وبعد نزع المحفظة، إما أن المواد يمكن تخزينها، أو تعامل مع نظام مرحلة معينة من بروتين-K ثم المهجنة لriboprobe. قد يكون مطلوبا جهود التحسين التجريبية إضافية (تركز عادة على تركيز التحقيق ودرجة الحرارة التهجين) لكل مسبار / الهدف. هذه المعايير (بالإضافة إلى نظام تثبيت والعلاجات بروتين-K) وعادة ما تكون المعلمات الأكثر نفوذاأي في تجربة الموقع (على افتراض أن نوعية المواد الثابتة والتحقيق RNA ذات مستوى عال).

أهمية العلاج بروتين-K المناسبة إلى النتيجة النهائية لفي تجربة خارج الوضع الطبيعي هو الهدف الأسمى لL. الراكدة. وينعكس هذا في مجموعة واسعة من تركيزات بروتين-K التي تتطلبها مراحل نمو متميزة (تتراوح بين 0 ميكروغرام / مل إلى 500 ميكروغرام / مل). ولذلك فمن المهم أن تكون قادرا على تعيين سلسلة البيض نظرا لنافذة التخلق. تحقيقا لهذه الغاية، والمبدأ التوجيهي التي نقدمها في الشكل 1 يسمح للانطلاق من المواد التنموية للعصور سحيقة (نسخة صالحة للطباعة من هذا الرقم متاح في الملف التكميلي 3 أن المستخدمين قد تجد من المفيد أن يكون في المجهر عند انطلاق المواد) . ونلاحظ أن لأنواع أخرى من الرخويات العلاجات بروتين-K للWMISH يمكن إما أن تبقى ثابتة لمجموعة واسعة من developmental مراحل 8،25،26، أو يمكن حذفها تماما (27). هذا هو في تناقض صارخ مع الوضع في L. الراكدة. وعلاوة على ذلك، في حين أن مجموعات بحثية أخرى قد ذكرت في وقت سابق أنماط التعبير WMISH لعدة جينات في L. الراكدة اليرقات (انظر 22،28،29) الطريقة التي وصفنا هنا ينتج أنماط من القرار المكانية أعلى بكثير. وأخيرا، لاحظنا كبير الاختلاف بين دفعة في نشاط بروتين-K من مورد لدينا. يجب أن تمثل هذا الاختلاف عن طريق إجراء جولة من "معايرة" التجارب WMISH حيث يتم تحديد النشاط من جديد بروتين-K تجريبيا. كل التجارب اللاحقة مع aliquots من بروتين-K من ذلك دفعة ويمكن بعد ذلك أداء بحرية.

وصفنا سابقا طريقة WMISH بديل للL. الأجنة الراكدة واليرقات في أماكن أخرى 12. تفصيل هذه الطريقة استخدام mucolytوكيل جيم N-أسيتيل-L-السيستين (بريدا)، وهو عامل مختزل مثل Dithiothreitol (DTT) ومعالجات ما قبل التهجين مع كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS). لقد وجدنا تلك العلاجات تعزيز أنماط تلطيخ بعض الجينات لبعض مراحل التطوير. استراتيجية التثبيت التي قمنا بتطويرها مؤخرا ووصف هنا (اليرقات داخل كبسولات من تحديد) يبسط وتعجل الخطوات اللازمة لإعداد المواد لفي تجربة الموقع، وعلى ما يبدو ينفي الحاجة لتحديد تجريبيا العلاجات إضافية قبل التهجين الأمثل مع حلف شمال الأطلسي، DTT أو SDS. ويمكن أن تشمل التحسينات المستقبلية لتقنية ذكرت هنا التصور من microRNAs (بعد إدخال تعديلات على البروتوكولات القياسية WMISH ذكرت سابقا 30)، ووضع العلامات ضعفين أو ثلاثة أضعاف مرنا يستهدف 31، والتصور الفلورسنت إشارات WMISH 32. يمكن القول إن أعظم الحد من هذه التقنية هو طول العام من الوقت الذي يستغرقه للانتقال من collectinز المواد، إلى صورة رقمية تمثل معطى نمط التعبير الجيني. نظرا لطبيعة الأحداث البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التي يجب أن تتم خلال هذه العملية وهذا هو سمة متأصلة من أكثر البروتوكولات في الموقع التهجين.

المنقعية تحتل موقعا داخل Metazoa التي هي غاية الممثلة تمثيلا ناقصا من حيث الكائنات النموذج. ونتيجة لSpiralian ممثل، يمكن المنقعية تحقيق التبصر في تطور من الميزات المورفولوجية متميزة مثل تشكيل قذيفة 12 و هيئة الإنصاف 33-35 وأيضا قيمة neuroethology 36 و الفسيولوجيا العصبية نموذج 9،37. تقنيات قوية مثل القدرة على تصور بكفاءة أنماط التعبير الجيني في الموقع يزيد من وظائف من المنقعية كما كائن نموذج، ويوسع مجموعة متنوعة من الأسئلة التي يمكن استخدامها لمعالجة. في الوقت الذي كان فيه جيل كبير تسلسل داتasets (ترنسكربيتوم كاملة وحتى الجينوم) هي والروتينية نسبيا، مثل هذه الأساليب أصبحت أكثر أهمية للباحثين الذين يرغبون في تفسير سيل من البيانات تسلسل من هذه النماذج. في حين المنقعية هو البطني المستمدة نسبيا 38، وتمتلك ما يمكن اعتباره الجينوم كبير بالمقارنة مع الكائنات النموذج الأخرى (1.22 جيجابايت 39)، لديها العديد من الميزات العملية ومثيرة للاهتمام التي تجعل من نظام نموذجا جذابا. الأساليب التي وصفنا هنا توسيع الأدوات المتاحة لالمنقعية ويمكن أن تكون ذات فائدة للالأنواع الأخرى التي الخضوع مغلفة التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من خلال تمويل لDJJ من خلال مشروع DFG # JA2108 / 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218, (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53, (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343, (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50, (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58, (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15, (1), 19 (2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121, (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183, (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26, (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35, (1), 29 (1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63, (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221, (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311, (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129, (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7, (1), 160 (2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4, (1), 15 (2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49, (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11, (1), 43 (2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5, (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462, (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14, (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6, (4), e18745 (2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9, (4), e92941 (2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35, (Database issue), D332-D338 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats