הר שלם
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הר שלם הכלאה באתרו (WMISH) היא טכניקה המאפשרת את הרזולוציה המרחבית של מולקולות של חומצות גרעין (לעתים קרובות mRNAs) בתוך תכשיר 'הר שלם' רקמות, או שלב התפתחותי (כגון עובר או זחל) של עניין. WMISH היא בעלת עוצמה אדירה, כי זה יכול לתרום באופן משמעותי את האפיון הפונקציונלי של הגנום מטזואניים מורכבים, אתגר נהיה יותר של צוואר בקבוק עם מבול של נתונים רצף הדור הבא. למרות הפשטות המושגית של הטכניקה הרבה זמן יש צורך לעיתים קרובות כדי לייעל את הפרמטרים השונים הגלומים לניסויים WMISH למערכות מודל הרומן; הבדלים דקים במאפייני הסלולר ביוכימיים בין סוגי רקמות שלבי התפתחות אומרים כי שיטת WMISH יחידה לא יכולה להיות מתאימה לכל המצבים. פתחנו מערכת של שיטות WMISH עבור stagnalis Lymnaea מודל חלזון מתעורר מחדש שיוצרים עקבאותות WMISH ברורים עבור מגוון של גנים, ועל פני כל שלבי ההתפתחות. שיטות אלה כוללות הקצאה של זחלים של גיל כרונולוגי ידוע חלון ד"ר מר, ההסרה ביותר של עבר זחלים מן קפסולות הביצה שלהם, היישום של טיפול proteinase-K מתאים לכל חלון ד"ר מר, הכלאה, כלאה-פוסט immunodetection צעדים. שיטות אלה מספקים בסיס שממנו את האות שהתקבל עבור תעתיקי הרנ"א נתונים יכול להיות מעודן יותר עם התאמות ספציפיות בדיקה (בדיקת ריכוז בעיקר וטמפרטורת הכלאה).

Introduction

רכיכות הן קבוצה של בעלי חיים אשר מחזיקים את האינטרס של מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות. למרות מגוון מורפולוגיים שלהם 1, מיני עושר (שני רק פרוקי הרגליים מבחינת מספר מינים 2) ורלוונטי למגוון רחב של מסחרי 3, רפואיות ומדעיים 4 סוגיות 5-8, קיימים מעט מאוד מיני molluscan כי יכול לטעון בשני מודלים מדעיים מאובזרים וקל לתחזוקה בסביבה להיות במעבדה. רכיכות אחד משמשת במידה רבה על ידי דיסציפלינות כגון נוירוביולוגיה 9, ecotoxicology 10 וביולוגיה אבולוציונית ולאחרונה 11,12, הוא stagnalis Lymnaea, בעיקר בגלל ההפצה הנרחבת שלה וקל קיצוניים של תחזוקה. למרות הפופולריות שלו כאורגניזם "מודל" וההיסטוריה הארוכה של שימוש על ידי ביולוגים התפתחותיים 13-19, טווח וכוח של כלים מולקולריים לרשות L. stagnהקהילה המדעית alis טמונה הרחק מאחור כי מודלים של בעלי חיים מסורתיים יותר (דרוזופילה, עכבר, קיפוד ים, נמטודות).

הרצון שלנו לפתח Lymnaea כמודל מולקולרי נובע עניין המנגנונים המולקולריים מנחה היווצרות פגז. זה הניע לנו לחדד סט של טכניקות שתאפשרנה להדמיה היעילה, עקבית ורגישה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות של Lymnaea. הר שלם הכלאה באתרו (WMISH) מועסק נרחב עבור מגוון רחב של אורגניזמים מודל כבר בשימוש במשך יותר מ -20 40 שנה. בתחפושות שונות שלה, שאני עורך יכול להיות מועסק על מנת לבצע לוקליזציה לוקוסים ספציפיים מרחבית על הכרומוזומים, rRNA, mRNA ו-RNAs מיקרו.

אחד האתגרים שאנחנו צריכים לטפל לפני תחילת תהליך זיקוק שיטת WMISH עבור L. stagnalis היה בסוגיית בעדינות וביעילות לחילוץ עוברים וזחלים של שלבים הנעים בין tהוא קפסולות הביצה שבה הם מופקדים. מיצוי זה, או 'decapsulation', צריך להיות מושג בצורה יעילה כדי לאסוף חומר מתאים לשיעור נתון בניסוי באתרו, ואילו באותו זמן שמירה על שלמות מורפולוגיים הסלולר. בעוד אורגניזמים מודל אחרים גם לעבור התפתחות כמוסה, בידינו אף אחת מהשיטות ודווחו מינים אלה יכולים להיות מועסקים בהצלחה ל stagnalis.

מטרות העל של שיטה זו הן אפוא: לחלץ ל stagnalis עובר זחלים מן הכמוסות שלהם באופן תפוקה גבוהה, כדי להחיל טיפולים מראש כלאה המביאות למרב את אות WMISH, להכין עוברים וזחלים עם WMISHsignals משביע רצון עבור הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השלבים הבאים מתארים את השיטה שלנו לעריכה בניסוי באתרו על במות עובריות זחל של L. stagnalis. איפה צעד כרוך בשימוש חומר כימי מסוכן זה מצוין על ידי המילה 'זהירות' וכל נהלי הבטיחות המתאימים יש לאמץ. קישורים לגיליונות נציג MSDS לכימיקלים מסוכנים ניתנים משלים קובץ 1. מתכונים לכל ריאגנטים ניתנים קובץ משלים 2.

1. אסיפה של מכשירי Decapsulation

  1. לשם כך, לחבר 20 מזרק חד פעמי מ"ל צינורות סיליקון (בקוטר פנימי של 1 מ"מ קוטר חיצוני של 3 מ"מ) באמצעות קיצוץ קצה P1,000 לגובה בלתי הולם כפי שמוצג באיור 2 א.
  2. קלטת שקופיות מיקרוסקופ רגילות צלחת פטרי גדולה הפוכה. קלטתי את צינורות סיליקון סמוכים מייד לשקופית מיקרוסקופ כפי שמוצג באיור60; 2C ו 2D.
  3. לנוח מחט זכוכית משך בשקופית מיקרוסקופ בעדינות להכניס אותו לתוך צינורות סיליקון עד קצה המחט יבלוט כ- 20% מאורכו של הגשר הקוטר הפנימי של הצינור (ראה איור 2 ג ו 2D). ברגע שהמחט נמצאת בעמדה קלט אותה למטה כדי בצלחת פטרי.
  4. אפשר את הקצה החופשי של צינור סיליקון לנוח עוד צלחת פטרי כי תאסוף את חומר decapsulated.

2. לדוגמא אוסף, קיבוע Decapsulation

הערה: כל השלבים מבוצעים ב RT אלא אם צוין אחרת.

  1. בזהירות לאסוף מחרוזות הביצית מן הקירות של אקווריום. לשם כך, השתמש חתיכת שטוח מפלסטיק גמיש כמו מרית לגרד את המחרוזת בייץ את המצע, ולהשתמש מסננת תה פלסטיק לדוג את מחרוזת הביצה צפה אל מחוץ למים. שלב ולמיין את החומר תחת מיקרוסקופ באמצעות המדריך המסופק באיור1.
  2. מניח את מחרוזת הביצה על גבי מגבת נייר ולעשות חתך אורכי לאורך המוני הביצה באמצעות מלקחי הנוצה. מגלגל את קפסולות הביצה מתוך מחרוזת הביצה להסיר כמה שיותר חומר הג'לי ככל האפשר מכל הקפסולה על ידי דוחף אותם סביב מגבת נייר באמצעות מלקחי הנוצה.
  3. באמצעות מלקחיים נוצה, להעביר את הכמוסות ביצה לתוך צלחת פטרי המכילה 5 מ"ל של מי ברז. המשך לאסוף קפסולות ביצה קרוש דה של השלבים ההתפתחותיים הרצוי לתוך המנה הזו. אסוף מספיק קפסולות מכל שלבי ההתפתחות לניסוי WMISH המתוכנן ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא.
  4. כשעובד עם זחלים מפותחים יותר (5 ימים שלאחר מהחשוף ראשון (dpfc) ומעלה) לטשטש אותם לפני הקיבוע.
    הערה: פעולה זו תמנע שרירים מלהתקשר מה שהופך את הפרשנות של בדפוסי מכתים באתרו מאוד קשים.
    1. תירגע זחלים (בזמן שהם עדיין capsu שלהםles) בתמיסה 2% w / v של MgCl 2 • 6H 2 O למשך 30 דקות לפני קיבוע.
    2. להעריך את מידת הרפיה לאחר 30 דקות על ידי השריית בעוד זחלים כמה עדיין בכמוסות הביצה שלהם בתמיסה מקבעת וניטור תגובתם תחת מיקרוסקופ. חלקי זחלים רגועים יהיו לסגת לתוך קליפתם, בעוד זחלים רגועים לחלוטין לא יגיבו. לאחר הזחלים הללו היו רגועים להמשיך לשלב הבא.
  5. מעבירים את קפסולות ביצה בעזרת פיפטה פלסטיק נשא רחב לתוך צינור סגר המספק 10 פעמים את נפח כמוסות ביצה (למשל., 1 מ"ל של קפסולות התיישבו ידרוש צינור מ"ל 10+).
  6. לשאוב כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מהצינור ולהחליף עם נפח של פתרון מקבע כי הוא 10x היקף קפסולות הביצה התיישבה. בעדינות לסובב את כמוסות הביצה מקבעת ב RT בפעם המתאימה לכל שלב התפתחותי (ראה איור 1).
  7. Discontinסיבוב ue ולאפשר קפסולות לשקוע לשאוב את הפתרון מקבע לתוך מיכל פסולת מתאים.
  8. שטפו את קפסולות ביצה ידי החלפת הפתרון מקבע עם בופר פוספט עם 0.1% Tween-20 (PBTw) וסיבוב ב RT במשך 5 דקות. לשאוב PBTw וחזור פעמיים.
  9. סר עובר וזחלים מ הכמוס שלהם באמצעות המנגנון (ראה סעיף 1 לפרטים נוספים) שמוצג באיור 2. צייר את הכמוסות לתוך מזרק 20 מיליליטר, לצרף את הצינורות ולאחר מכן לפזר את הכמוסות דרך הצינורות והעבירו את מחט הזכוכית אל המנה האוספת.
    הערה: בדרך כלל, הרוב (> 90%) של כל הכמוסות צריך צריך רק אחד לעבור דרך המכשיר. במקרים רבים קרום הקפסולה פגום אבל עובר וזחלים להישאר בתוך הקפסולה מהקרע. עבד מחדש את החומר הזה פשוט על ידי ציור אותו לתוך מזרק להפיג את זה שוב.
  10. אסוף את העוברים decapsulated וזחלים לתוך צינור 1.5 מ"ל באמצעות מיקרופוןropipette (א P20 עבור 0 - זחלים בן 3 יום, וכן P200 עבור זחלים מבוגרים עם סוף הקצה מנותק).
    הערה: שתיקה (עד מספר חודשים) בפרוטוקול יכול להיעשות בשלב זה. אם זה נדרש, החומר decapsuled יש לאסוף לתוך צינור 1.5 מ"ל לאחסון (המשך לשלב הבא). אחרת להמשיך מיד לפרוטוקול 3.
  11. אפשר העוברים וזחלים לשקוע לתחתית הצינור לשאוב supernatant חלף עם 33% אתנול (EtOH) ב PBTw ולתת לשבת במשך 5 - 10 דקות. אני חוזר עם 66% EtOH ב PBTw ו 100% EtOH. לשטוף זחלים פעמים 100% EtOH ב RT. אחסן את החומר ב -20 ° C. ב 100% EtOH.
  12. כאשר מוכן להמשיך, מחדש מימה דגימות ידי הסרת 100% EtOH והחלפת עם 66% EtOH ב PBTw, ולתת לשבת במשך 5 - 10 דק '. אני חוזר עם 33% EtOH ב PBTw, ולתת לשבת במשך 5 - 10 דקות. לבסוף לשטוף עם 3x 5 שטיפות דקות של PBTw מנת להבטיח את כל EtOH מוסר.

3. proteinase-K, TEA ופוסט-fixation

הערה: אנו מוצאים ביצוע הצעדים הבאים בסלים קטנים עם רצפת רשת השיטה היעילה והעדינה ביותר להחלפה מהר הפעם פתרונות קריטיים. בעוד יכולים להתבצע האלה הביתה, אנו משתמשים סלים (בגודל בינוני) התואמים את רובוט Intavis InSituPro -Vsi טיפול הנוזלי (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). סלים כאלה יכולים להיות בקלות ובמהירות נע בין הבארות של צלחת בתרבית רקמה 12 היטב (TCD) כדי פתרונות החליפין, או הפתרון יכול להישאף מהבאר בעזרת פיפטה. לחלופין, כל חילופי פתרון יכול להתבצע ללא סלים אלה פשוט על ידי aspirating את supernatant מן הזחלים. במקרה זה בתנועות סיבוביות עדינות יהיה לרכז את כל העוברים וזחלים אל מרכז הצלחת המאפשר supernatant להסירו מקצה הבאר. להלן מניח שהמשתמש העסיק סלים עבור חילופי פתרון.

  1. בעזרת פיפטההעברה, עוברים וזחלים לתוך סל יושב TCD 12 היטב עם 2 מ"ל של PBTw.
    הערה:. המספר עוברי ו / או זחלים שניתן להוסיף תלויה בשלב ההתפתחותי נחקרת, אולם ככלל אצבע היא לשמור לפחות 25% של שטח הרצפה החופשי של עוברים / זחלים (כלומר, לא לגדוש את הסל).
  2. הכן סמוך היטב עם 2 מ"ל של הפתרון proteinase-K המתאים (ראה איור 1), ועוד 2 בארות עם 2 מ"ל של 0.2% גליצין כל. הזז כל סל לבאר המכיל את הריכוז המתאים של proteinase-K ומיד להתחיל העיתוי.
  3. לאחר 10 דקות להזיז כל סל לתוך גליצין 0.2% המכיל היטב דגירה במשך 5 דקות. ואז להזיז כל סל לתוך הבאר השנייה עם 0.2% גליצין דגירה במשך 5 דקות. לשטוף את גליצין עם 3x 5 חילופי דקות של 3 מ"ל PBTw.
  4. הסר את הפתרון PBTw ולטפל דגימות פעם עם מוכן טרי Triethanolamine (TEA) סולution לזהירות 5 דקות! אל להתסיס. החלף עם 3 מ"ל של תמיסת TEA מוכן טרי למשך 5 דקות. אל להתסיס. לשאוב את רוב פתרון TEA ממדגמים. מוסיפים את Triethanolamine מוכן טרי עם חומץ אנהידריד (TEAAA) פתרון דגירה במשך 5 דקות. זהירות! אל להתסיס.
  5. אופציונאלי - בעוד הצעד לעיל דוגר, להכין עוד קבוצה חדשה של פתרון TEAAA וחזור על השלב לעיל.
    הערה: הטיפול השני זה עם TEAAA הוא אופציונלי, אך עשוי לעזור לחסל את כל הרקע לחלוטין עם בדיקות נוטה לייצר ברקע.
  6. הסר את הפתרון TEAAA ידי aspirating זה מהבאר ולהחליף עם 3 מ"ל של PBTw. אל להתסיס. הסר את PBTw ולהחיל 3 מ"ל של פורמלדהיד 3.7% ב PBTw. מערבולת בעדינות מדי פעם במהלך הדגירה 30 דקות.
  7. הסר את מקבע על ידי aspirating זה מהבאר ולהחליף עם 3 מ"ל של PBTw. העברת את החומר לתוך צינור 1.5 מ"ל. RePlace PBTw עם חיץ הכלאה ו דגירה במשך 5 דקות ב RT - זהירות.
  8. מניח את הצינורות לתוך גוש חם ב RT, ולהגדיר את הטמפרטורה לטמפרטורת הכלאה הרצויה.
    הערה: טמפרטורת הכלאה היא בדיקה ספציפית ותהיה צריך להיות מותאם באופן אמפירי, אולם אנו מוצאים 55 ° C להיות טמפרטורה טובה בתחילה לדין. אפשר לחסום לבוא טמפרטורת הכלאה, ולאפשר הדגימות טרום להכליא למשך כ 15 דקות (כלומר, הזמן שנדרש כדי להכין את riboprobes, כבר אין צורך). כן כרכים נאותים (בדרך כלל 100 μl) של riboprobes המדולל. אנחנו בדרך כלל ריכוזים בדיקת בדיקה של 100 ו -500 ng / ml כמו מגוון ראשוני. אנחנו מכינים riboprobes פי 12.
  9. הסר את חיץ הכלאה ממדגמים ולהוסיף החללית במאגר הכלאה על דגימות. שכבה עם 100 μl (או נפח מספיק כדי לגבש שלב מעל כלת buffer) של שמן מינרלים.
    הערה: שמן המינרלים מונע עיבוי נרחב שיהווה במהלך שלב הכלאה הממושך. עיבוי נרחב יהיה לשנות באופן משמעותי הוא את הכימיה של הפתרון הכלה ואת הריכוז של החללית.
  10. לפגל החללית לבין היעד RNA על ידי חימום הדגימות עד 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מנמיכים את חום לטמפרטורה הכלאה הרצוי. אפשר הכלאה כדי להמשיך למשך תקופה מינימלית של 12 שעות (O / N) או יותר (24 - 48 שעות).
  11. במהלך הכלאה להסיר צינור יחיד מהגוש החום, לסובב אותו במהירות בין האגודל לאצבע המורה להשעות את הזחלים מבלי להפריע את השלב הנפט, ולהחליף אותו בבלוק חום. חזור פעם אחת זה כל 6 - 12 שעות בערך.

4. חם מתרחץ immunodetection

הערה: בעוד אנו משתמשים רובוט נוזלי טיפול עבור השלבים הבאים, אלה גם יכולים בקלות להיעשות באופן ידני. במקרה זה, עובר וזחלי shoULD להישמר 1.5 מ"ל צינורות הם הכלאה ב. כל חילופי פתרון שלאחר מכן הם aspirated והוסיף עם טפטפת P1,000. כאשר מבוצע באופן ידני כל אחד מן השלבים הבאים צריכים להעסיק 1 מ"ל של כל פתרון.

  1. כרכים חומים נאותים (3 מיליליטר כל אחד עבור כל דגימה) של 4x, 2x ו 1x פתרונות לשטוף לטמפרטורת ההכלאה.
  2. לשטוף את כל הדגימות שלוש פעמים חיץ לשטוף 4x במשך 15 דקות כל אחד בטמפרטורת ההכלאה. לשטוף את כל הדגימות שלוש פעמים חיץ לשטוף 2x במשך 15 דקות כל אחד בטמפרטורת ההכלאה. לשטוף את כל הדגימות שלוש פעמים חיץ לשטוף 1x במשך 15 דקות כל בטמפרטורת ההכלאה.
  3. לשטוף את כל דגימות פעם עם חיץ 1x נתרן כלוריד נתרן ציטראט + 0.1% Tween (Tween SSC + 0.1%) בטמפרטורת ההכלאה. אפשר דגימות להתקרר RT.
  4. לשטוף את כל הדגימות פעמי Tween 1x SSC + 0.1% במשך 15 דקות חלף פתרון SSC 1x זה עם Maleic חומצת הצפה (MAB) ולתת לשבת במשך 10 דקות חזור על MAB wאֵפֶר. חלף MAB עם פתרון לחסום דגירה במשך 1.5 שעות.
  5. להחליף את הפתרון לחסום עבור פתרון נוגדנים (1: 10,000 דילול של נוגדן פתרון לחסום) ו דגירה של 12 שעות (O / N) ב RT עם תסיסה עדינה.

פיתוח צבע 5. שם

  1. לשאוב את פתרון הנוגדן ולשטוף 15 פעמים עם PBTw במשך 10 דקות כל אחד. החלף PBTw עם הצפת phosphatase 1x אלקליין (AP) ו דגירה של 10 דקות.
  2. בעוד תמורת שלב דגירה לעיל, להכין את הפתרון המכתים AP (ראה משלים קובץ 2) - זהירות. מעביר את החומר לתוך TCD היטב ולהחליף פתרון AP 1x עם פתרון מכתים AP. הערת הזמן עכשיו כך את משך זמן תגובת הצבע מתקיימת עבור ניתן להקליט. לפקח על הפיתוח של הדפוס המכתים עד אות יחס ברקע היא אופטימלית.
  3. כדי לעצור התפתחות צבע, להסיר את הפתרון מכתים 1x AP (להשליך את wast המתאיםמיכל ה), ולהחיל 2 מ"ל של PBTw וציין את השעה כרגע. לשטוף פעמיים נוספות עם PBTw במשך 5 דקות כל אחד. השתמש באחת שטיפות אלה להעביר את החומר לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  4. הסר את PBTw וליישם 1 מ"ל של פורמלדהיד 3.7% ב PBTw להתסיס או לסובב עבור לפחות 30 דקות ב RT (זה יכול להיעשות גם O / N).
  5. יש לשטוף היטב את מקבע עם 3 שוטף של PBT (להשליך מקבע פסולת במכל פסולת מתאים). שטפו את דגימות 3 פעמים ב 50 מעלות צלזיוס במים דה מיונן.
    הערה: שטיפות אלה לחסל את המשקעים של מלחים שעלולים להיות גלויים במהלך ניקוי וצעדים ויזואליזציה.
  6. להחליט אם הדגימות צריכות להיות מותקנות בתוך בנזיל בנזואט: בנזיל אלכוהול (BB: BA, הידוע גם בשם הברור של מוריי) או גליצרול.
    הערה: אנו מעדיפים את הסולק חזק יותר BB: BA כמו L. עוברים stagnalis הם קצת אטום. דוגמאות כדי להיות מותקנות ב BB: BA תחילה עליך להיות מיובש באמצעות סדרת אתנול. דוגמאות כדי להיות מותקנות ב 60%גליצרול ניתן לתליה מייד.
  7. העברת הדגימות לתוך תמיסת ההרכבה (BB: BA או 60 גליצרול%) בעזרת פיפטה.
    הערה: כאשר גובר BB: BA זה חייב להיעשות בתוך כוס היטב (BB: BA יתמוסס פלסטיק פוליקרבונט).
  8. אפשר הדגימות כדי לנקות עבור 5 - 10 דקות, ולאחר מכן לטעון אותם לשקופית באמצעות מספר מתאים של coverslips מוערם כמו מפרידים (1 coverslip על דגימות <1 dpfc, 2 coverslips עבור דגימות> 1 dpfc).
    הערה: mounts כל ניתן הדמיה החברה באמצעות מיקרוסקופ מתחם עם אופטיקה דסק"ש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דפוסי מכתים נציג WMISH שמוצג באיור 3 נוצרו באמצעות הטכניקה המתוארת לעיל, ומשקפים מגוון של דפוסי הביטוי המרחבי עבור גנים המעורבים מגוון של תהליכים מולקולריים החל היווצרות פגז (גן Novel 1, 2, 3 ו -4), כדי איתות תאים תאים (DPP) לרגולציה שעתוק (Brachyury) על פני מגוון של שלבים התפתחותיים. אמנם יש לנו לא כמתנו את רמות הביטוי של גנים אלה אנו מצפים שהוא קיימים גם להשתנות באופן משמעותי, מה שמעיד כי השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת נגד מגוון רחב של מוצרי גן לידי ביטוי בכל שלבי התפתחות ברמות שונות. רק אחד מהגנים שהוצגו כאן (DPP) תואר בעבר L. stagnalis 21,22. התוצאות שאנו מציגים כאן הם בעיקר בקנה אחד עם דיווחים קודמים אלה, אך עם reso מרחבית גבוהה באופן משמעותי lution. דפוס הביטוי המרחבי של Brachyury תואר ברגשותיו 23 ו עלוקת 24 ובשני המקרים גם זוהה בתאי מעטפת כפי שאנו מוצאים על L. stagnalis (איור 3F). בודדנו גנים חדשים 1 - 4 (מתוך מסך proteomic שנועד לזהות מוצרי גנים מעורבים באופן ישיר להיווצרות מעטפת, ולכן דפוסי הביטוי המרחבי שלהם הקשורות בבלוטת הקליפה (איור 3 א 'וב') או שדה פגז (איור 3 ג ו-ד ') הם לגמרי בקנה אחד עם פונקציות יוצרי פגז. תוצאות אלו מצביעות כי טכניקת התפוקה הגבוהה פתחנו להסרת עבר זחלים מן הקפסולה הביצה, ואת הטיפולים בשלב ספציפי permeabilization עוקבים ליצור כל דגימות הר שתנבנה באיכות גבוהה ב מכתים באתרו דפוסים עבור מגוון רחב של גנים לכל שלבי התפתחות עוברית זחל.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
איור 1. תמציתי ontogeny של Lymnaea stagnalis קיבוע מקבילים וטיפולים proteinase-K. נציג תמונות של עוברים וזחלים מ -7 הימים של הפיתוח הראשון להמחיש עלייה משמעותית בגודל (שורה 1) ומורכבות מורפולוגיים (שורות 2 ו -3) . שינויים התפתחותיים אלה יתורגמו הבדלים גדולים בזמן הקיבעון המתאים וריכוזי proteinase-K שיוצרים אותות WMISH אופטימליים. לקבלת WMISH בכל השלבים צריכים להיות קבועים בפורמלין 3.7% PBS ב RT עם תסיסה עדינה בתוך קפסולות הביצה שלהם. כל השלבים אז צריכים להיות מטופלים עם ריכוז proteinase-K המתאים למשך 10 דקות. שים לב שאנו רואים וריאציה בין-יצווה משמעותית בפעילות של proteinase-K מהספק שלנו. וריאציה זו חייבת להיות מוסברת על ידי performing סבב 'כיול' ניסויי WMISH שבו הפעילות של proteinase-K החדש היא לקבוע באופן אמפירי. ריכוזי proteinase-K לומר הדמות ולכן צריכים להתייחס אליה כאל מדריך ראשוני, אולם ריכוזים היחסיים בין שלבי התפתחות (למשל 2 עובר בני יומם לדרוש ריכוז proteinase-K 3 פעמים גבוהות יותר מאשר יום 1 עוברי) מוגדרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. המנגנון המשמש כדי Decapsule L. עוברים stagnalis. (א) סקירה של מנגנון שיכול ביעילות להסיר L. עובר stagnalis וזחלים מ הכמוס שלהם. (ב) מוגדל לאורבאזור התאגרף הצהוב ב (א). מחט זכוכית חדה מונחת על שקופיות מיקרוסקופ מוכנסת לתוך צינורות סיליקון (מ"מ פנימי בקוטר 1, מ"מ קוטר 3 חיצוני) כזה הקצה יבלוט כ- 20% מן הדרך לתוך החלל של הצינור. מחט הזכוכית אז הוא מודבק גם לשקופית מיקרוסקופ צלחת פטרי. (C) השקפת'התוכנית' סכמטי של הסעיף בארגזים הצהוב בכמוסות ביצת א המכילות עוברים קבועים זחלים ראשונים שנאסף באמצעות מזרק 20 מיליליטר. המזרק מחובר אז אל צינורות סיליקון ו הכמוסים גורש דרך הצינורות והעבירו את המחט. ממברנות הקפסולה הביצה נקרעות על ידי מחט והחומר עוברי זחל המשוחרר ניתן לאסוף מצלחת האוסף באמצעות micropipette. (ד) סכימטי 'חתך' לאור הסעיף בארגזים הצהוב א שקופית מיקרוסקופ מבטיח כי מחט נכנסה צינורות סיליקון בגובה הנכון. (F) השקפת נציג הזחלים שהפכו אחת לעבור דרך המנגנון. יותר מ -90% של החומר כבר ביעילות ובעדינות יוסרו הכמוסות שלהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תמונות נציג של דפוסי ביטוי WMISH נגד מגוון רחב של גנים מתוך מגוון רחב של L. . שלבי stagnalis התפתחותית שנוצרו על ידי השיטה המתוארת כאן כל שלבי ההתפתחות עובדו כמתואר השיטה הנ"ל ואת כבר רכוב צילמו ב BB: BA (ברור של מוריי). גילים משוערים מצוינים כדיתקין p של כל פאנל ואת הכיוון מצוין בפינה הימנית התחתונה. ג'ין orthology (כאשר ידוע) מותווה בפינה השמאלית התחתונה של כל לוח. קיצורים: בלוטת פגז (SG); שדה פגז (SF); מעטפת (MT); רגל (רגל); Decapentaplegic (DPP); dpfc (ימים שלאחר מחשוף הראשון). כל ברי הסולם הם 20 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה היעילה של תעתיקי רנ"א עם הנראה רמות ביטוי שונות בתוך כל שלבי ההתפתחות של Lymnaea stagnalis. כדי להסיר עבר זחלים מן הכמוסות שלהם אנו trialed מגוון של כימיקלים, הלם אוסמוטי וטיפולים פיסיים ודווח encapsulated- אחר פיתוח אורגניזמים מודל. עם זאת, בידינו השיטה אנו מתארים כאן היא טכניקת התפוקה גבוהה רק שמסירה את הקרום קופסית הקשה מבלי לפגוע בעוברים וזחלים. בעקבות decapsulation, החומר יכול להיות מאוחסן או, או מטופלים עם משטר בשלב מסוים של proteinase-K ואז הכלאה riboprobe. מאמצי ייעול אמפיריים נוספים (בדרך כלל התמקדו ריכוז חללית וטמפרטורת הכלאה) עשויים להידרש כל בדיקה / יעד. פרמטרים אלה (בנוסף משטר הקיבעון וטיפולי proteinase-K) הם בדרך כלל הפרמטרים המשפיעים ביותרמכל בניסוי באתרו (בהנחה שאיכות החומר הקבוע חללית RNA היא ברמה גבוהה).

חשיבותו של טיפול proteinase-K המתאים לתוצאה הסופית של בניסוי באתרו הוא בעל חשיבות עליונה עבור L. stagnalis. הדבר בא לידי ביטוי בטווח רחב של ריכוזי proteinase-K הנדרשת בשלבים התפתחותיים שונים (בטווח שבין 0 מיקרוגרם / מ"ל ​​ל 500 מיקרוגרם / מ"ל). לכן חשוב להיות מסוגל להקצות מחרוזת ביצה שניתנה חלון ד"ר מר. לשם כך, הקו המנחה שאנו מספקים באיור 1 מאפשרת העלאת חומר התפתחותי בגילים ידועים (גרסה להדפסה ידידותית של נתון זה זמינה קובץ משלים 3 שהשתמש עשויים למצוא בם להיות בבית מיקרוסקופ כאשר מעלים חומר) . נציין כי עבור מינים אחרים של טיפולי חלזונות proteinase-K עבור WMISH יכול להיות נשמר קבוע עבור מגוון רחב של developmental טיולי 8,25,26, או ניתן להשמיט 27 לגמרי. זאת בניגוד גמור למצב L. stagnalis. יתר על כן, בעוד קבוצות מחקר אחרות שדווחו בעבר דפוסי ביטוי WMISH עבור מספר גנים ב L. זחלי stagnalis (ראה 22,28,29) השיטה בה אנו מתארים כאן מניבים דפוסים ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר באופן משמעותי. לבסוף, ראינו וריאציה משמעותית בין-יצווה בפעילות של proteinase-K מהספק שלנו. וריאציה זו חייבת להיות מוסברת על ידי ביצוע סבב 'כיול' ניסויי WMISH שבו הפעילות של proteinase-K החדש נקבעה באופן אמפירי. כל הניסויים הבאים עם aliquots של proteinase-K מ אצווה כי אז יכול להתבצע באופן חופשי.

אנחנו קודם לכן תארנו שיטת WMISH חלופית ל עובר וזחלים stagnalis במקום אחר 12. שיטה זו פירט את השימוש mucolytic סוכן N-Acetyl-L-ציסטאין (NAC), סוכן צמצום כגון Dithiothreitol (DTT) וכן טיפול טרום הכלאה עם סולפט dodecyl נתרן (SDS). מצאנו אותם טיפולים משופרים דפוסי מכתים של כמה גנים כבר כמה שלבים התפתחותיים. אסטרטגית הקיבעון שפתחנו לאחרונה ולתאר כאן (תיקון זחלים בתוך קפסולות שלהם) מפשטת מזרזת את הצעדים הנדרשים כדי להכין חומר עבור בניסוי באתרו, וככל הנראה שוללת את הצורך בקביעת טיפולים מראש כלאה אופטימליות נוספים אמפירי עם NAC, DTT או SDS. חידודים העתיד לטכניקה דיווחו כאן יכול לכלול הדמיה של מיקרו-רנ"א (לאחר שינויים פרוטוקולים WMISH תקן שדווח בעבר 30), תיוג כפול או משולש של mRNA מטרות 31, ויזואליזציה פלורסנט של אותות WMISH 32. ניתן לטעון המגבלה הגדולה ביותר של הטכניקה היא אורכו הכולל של הזמן שנדרש כדי לעבור collecting החומר, כדי תמונה דיגיטלית המייצג דפוס ביטוי גנים נתון. בשל אופיו של האירועים ביוכימיים biophysical כי חייבת להתבצע במהלך תהליך כזה זה הוא תכונה טבועה ביותר פרוטוקולי הכלאה באתרו.

Lymnaea תופס מקום בתוך Metazoa כי הוא מאוד מת-ייצוג במונחים של אורגניזמים מודל. כתוצאה Spiralian נציג, Lymnaea יכול להביא תובנה האבולוציה של תכונות מורפולוגיות ברורים, כגון handedness היווצרות פגז 12 והגוף 33-35 והוא גם מודל neuroethology 36 ו לנוירופיזיולוגיה יקר 9,37. טכניקות רבות עוצמה כגון היכולת לדמיין דפוסי ביטוי גנים ביעילות באתרו מגביר את הפונקציונליות של Lymnaea כאורגניזם מודל, ומרחיבה את מגוון השאלות שהוא יכול לשמש כדי לטפל. בכל פעם כאשר דור dat רצף הגדולasets (transcriptomes המלא ואף גנומים) הוא עניין שבשגרה יחסית, שיטות כאלה תהיינה רלוונטיות יותר לחוקרים המעוניינים לפרש את המבול של נתוני רצף ממודלים כזה. בעוד Lymnaea הוא חלזון נגזר יחסית 38, וכן הוא בעל מה ייחשב הגנום גדול בהשוואה לאורגניזמים המודל השני (1.22 Gb 39), יש לו הרבה תכונות מעשי ומעניין זה עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבי. השיטות שאנו מתארים כאן להרחיב את ארגז הכלים העומדים לרשות Lymnaea ועשויות להועיל מינים אחרים שעוברים כמוס פיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון כדי DJJ דרך JA2108 # פרויקט DFG / 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218, (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53, (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343, (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50, (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58, (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15, (1), 19 (2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121, (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183, (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26, (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35, (1), 29 (1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63, (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221, (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311, (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129, (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7, (1), 160 (2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4, (1), 15 (2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49, (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11, (1), 43 (2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5, (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462, (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14, (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6, (4), e18745 (2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9, (4), e92941 (2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35, (Database issue), D332-D338 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats