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1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH는) 관심 (예 : 태아 또는 애벌레 같은)에 '전체 마운트'조직 준비 내의 핵산 분자 (보통의 mRNA)의 공간 해상도, 또는 발달 단계를 위해 할 수있는 기술이다. 따라서 매우 복잡한 후생 동물 게놈의 기능적 특성, 차세대 시퀀스 데이터의 범람에 병목이 더 있다는 반칙에 기여할 수 있기 때문에 WMISH은 매우 강력하다. 많은 시간은 종종 새로운 모델 시스템 WMISH 실험에 고유 한 각종 파라미터를 최적화하는데 필요한 기술의 개념적 단순함에도 불구하고; 조직 유형 및 발달 단계의 세포 및 생화학 적 특성의 미묘한 차이는 하나의 WMISH 방법은 모든 상황에 적합하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 우리는 일관 생성하고 다시 새로운 복족류 모델 Lymnaea의 stagnalis에 대한 WMISH 방법의 세트를 개발했다유전자의 모든 발달 단계에 걸쳐 범위에 대한 명확한 WMISH 신호. 이러한 방법은 개체 발생 창에 알 수없는 연대기 나이의 애벌레의 할당, 자신의 계란 캡슐에서 효율적으로 배아를 제거하고 유충, 각각의 개체 발생 창에 적절한 테-K 치료의 응용 프로그램 및 하이브리드, 이후 하이브리드 및 면역을 포함 단계. 이 방법은 주어진 RNA 전 사체에 대한 결과 신호는 프로브 특정 조정 (주로 농도와 혼성화 온도 프로브)을 추가로 정제 할 수있는 기반을 제공합니다.

Introduction

연체 동물은 과학 분야의 폭 넓은 다양성의 관심을 보유 동물의 그룹입니다. 자신의 형태 학적 다양성 (1)에도 불구하고, 종, 3 상업 의료 4 및 과학 문제 5-8의 넓은 범위와 관련 (종수 (2)의 관점에서 만 절지로 두 번째) 풍요 로움을 주장 할 수있다 상대적으로 적은 연체 동물 종들이있다 잘 갖추어 진 과학 모델과 실험실 환경에서 유지 보수가 용이 모두합니다. 많은 등의 신경 생물학 9, 생태 독성학 (10)과 최근 진화 생물학 11, 12 등의 분야에서 사용되는 하나의 연체 동물은 주로 때문에 광범위하게 배포 및 유지 보수의 극단적 인 용이성, Lymnaea의 stagnalis입니다. 는 '모델'유기체로서의 인기와 L. 사용할 발달 생물 학자 13-19, 분자 도구의 범위와 능력으로 사용의 오랜 역사에도 불구하고 stagnALIS 과학 사회는 훨씬 더 전통적인 동물 모델 (초파리, 마우스, 성게, 선충)의 뒤에 자리 잡고 있습니다.

분자 모델 쉘 형성을 유도 분자 메커니즘에 대한 관심에서 비롯된 우리의 욕망은 Lymnaea을 개발. 이 Lymnaea의 개발 기간 동안 유전자 발현의 효율적이고 일관성있는 민감한 시각화 허용하는 기술의 집합을 수정하는 동기를 부여. 현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH)는 널리 모델 생물의 다양한 채용되며, 40 년 이상 20 사용되었습니다. 그 다른 guises에서 ISH 공간적 염색체 rRNA의, mRNA의 마이크로 RNA를 특정 유전자좌 국산화 사용될 수있다.

과제 중 하나는 이전 L.하는 WMISH 방법 정련 해결할 필요 stagnalis 부드럽게하고 효율적으로 추출하는 배아와 t에서 다양한 단계의 애벌레의 문제였다그는 그들이 퇴적 된 계란 캡슐. 이는 추출 또는 '캡슐화'는에 적합한 재료를 수집하기 위해 효율적으로 달성 할 필요가있는 동시에 형태 및 세포의 무결성을 유지하면서, 현장 실험에서 주어진. 다른 모델 생물도 캡슐화 개발을 겪는 동안, 우리 손에 그 종에 대해보고 된 방법 중 어느 것도 성공적 L.에 사용되지 않았다 stagnalis.

이 방법의 전반적인 목표는 따라서 다음과 같습니다 L.를 추출 stagnalis 높은 처리량 방식으로 그들의 캡슐에서 배아 및 유충 이미징을위한 만족스러운 WMISHsignals와 배아 및 유충을 준비하려면 WMISH 신호를 최적화 사전 하이브리드 치료를 적용합니다.

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Protocol

참고 : 다음 단계는 L.의 배아와 애벌레 단계에서 현장 실험의를 수행하기위한 우리의 방법을 간략하게 설명 공정이 단어 '주의'와 모든 적절한 안전 절차에 의해 지시 된 유해 화학 물질의 사용을 포함 stagnalis이. 채용한다. 유해 화학 물질에 대한 대표 MSDS 시트에 대한 링크는 보조 파일 (1)에 제공됩니다. 모든 시약에 대한 조리법은 보조 파일이 제공됩니다.

디 캡슐 레이션 장치의 1 회의

  1. 이를 위해,도 2a에 도시 된 바와 같이 적절한 길이로 P1,000 팁 절단하여 (1 mm의 내경 및 3 mm의 외경)의 실리콘 튜브에 20 ㎖의 일회용 주사기를 연결한다.
  2. 반전 큰 페트리 접시에 표준 현미경 슬라이드를 테이프. 도에 도시 된 바와 같이, 현미경 슬라이드에 바로 인접 실리콘 튜브 테이프60, 2C 및 2D.
  3. 현미경 슬라이드에 뽑아 유리 바늘 나머지 부드럽게 바늘의 선단이 배관의 내부 직경을 가로 지르는 방향의 약 20 %가 돌출 될 때까지 상기 실리콘 튜브에 삽입 (도 2C 및 2D 참조). 바늘은 페트리 접시에 위치 테이프를 아래에 있으면.
  4. 실리콘 튜브의 자유 단은 ​​캡슐화가 자료를 수집 다른 배양 접시에서 휴식을 허용합니다.

2. 시료 채취, 고정 및 캡슐화

참고 : 별도의 표시가없는 한, 모든 단계는 실온에서 수행된다.

  1. 조심스럽게 수족관의 벽에서 계란 문자열을 수집합니다. 이를 위해, 기판 떨어져 계란 문자열을 긁어 주걱으로 유연한 플라스틱의 평면 조각을 사용하고, 물에서 부동 달걀 문자열을 물고기 플라스틱 차 여과기를 사용합니다. 단도에서 제공하는 가이드를 사용하여 현미경으로 재 정렬1.
  2. 종이 타월에 계란 문자열을 놓고 페더급 집게를 사용하여 산란 량을 따라 세로 절개를합니다. 계란 문자열에서 계란 캡슐 롤과 페더급 집게를 사용하여 종이 타월 주위를 밀어 각 캡슐에서 가능한 한 젤리 소재의 정도를 제거합니다.
  3. 페더급 집게를 사용하여, 수돗물 5 ㎖를 포함하는 페트리 접시에 달걀 캡슐을 전송합니다. 이 접시에 원하는 발달 단계의 탈 젤리 계란 캡슐을 수집하기 위해 계속합니다. 계획 WMISH 실험 후 다음 단계로 진행에 대한 모든 개발 단계에서 충분히 캡슐을 수집합니다.
  4. 선진 애벌레로 작업 할 때 고정하기 전에 그들을 마취시키다 (5 일 먼저 절단 (dpfc) 이상 게시).
    참고 : 이것은 매우 어려운 현장 염색 패턴의 해석을하게 계약에서 근육을 방지 할 수 있습니다.
    1. 그들의 capsu 여전히 동안 (애벌레를 휴식이전 고정 30 분 • 6H 2 O의 MgCl 2의 2 %에 v / w 솔루션 레).
    2. 정착액 솔루션에 자신의 달걀 캡슐에 여전히 여러 애벌레 동안 침지 및 현미경 자신의 반응을 모니터링하여 30 분 후 휴식의 정도를 평가합니다. 완전 이완 된 애벌레가 응답하지 반면 불완전 편안한 유충은 껍질에 철회 할 것입니다. 이 유충이 완화되고 나면 다음 단계로 진행합니다.
  5. 계란 캡슐의 10 배 부피를 제공하는 밀봉 튜브로 넓은 구멍 플라스틱 피펫을 사용하여 난자 캡슐을 전송 (예., 정착 캡슐 1 ㎖는 10+ ml의 튜브를 필요).
  6. 대기음만큼 관으로부터 가능한 한 액과 정착 계란 캡슐의 체적 배이다 정착액 용액의 부피로 교체한다. 조심스럽게 각 발달 단계 (그림 1 참조)에 해당하는 시간 동안 실온에서 정착액에 계란 캡슐을 회전합니다.
  7. DiscontinUE의 회전과는 캡슐이 침몰하여, 적절한 폐기 용기에 정착액 솔루션을 대기음 할 수 있습니다.
  8. 5 분 동안 실온에서 0.1 % 트윈 -20 (PBTw)을 인산염 완충 식염수로 정착액 용액을 1,8- 회전 계란 캡슐 씻는다. PBTw을 대기음 두 번 반복합니다.
  9. 배아 및 장치를 사용하여 캡슐에서 유충을 제거 튜브를 통해 유리 바늘 아웃에 과거 캡슐 튜브를 연결 한 후 불식. 그림 2 (자세한 내용은 섹션 1 참조) 20 ML의 주사기로 헤어 캡슐을 그립니다 컬렉션 접시.
    주 : 일반적으로, 모든 캡슐의 대부분 (> 90 %) 장치를 통해 하나의 패스를 필요로한다. 많은 경우에있어서, 캡슐 막의 손상되지만 배아와 유충 파열 캡슐 안에 남아있다. 단순히 주사기로를 그리기 다시 밝혀하여이 물질을 재 처리.
  10. 마이크를 사용하여 1.5 ML 튜브에 디 캡슐화 배아와 애벌레를 수집ropipette (0에 대한 P20 - 삼일 오래 유충 및 팁의 끝 이전의 유충에 대한 P200은 차단).
    참고 :이 단계에서 할 수있는 프로토콜 (몇 개월까지에 대한) 일시 정지. 이것은 필요한 경우 decapsuled 재료 저장 1.5 ㎖의 튜브 (다음 단계로 진행)에 수집한다. 그렇지 않으면 프로토콜 3 즉시 계속합니다.
  11. 배아와 애벌레 튜브의 바닥에 가라 뜨는을 대기음 할 수 있습니다. PBTw에서 33 % 에탄올 (EtOH로)로 교체하고 5 앉아 보자 - 10 분. PBTw에서 66 % EtOH로 100 % EtOH로 반복합니다. RT에서 100 % EtOH로 두 번 유충을 씻으십시오. 100 %의 EtOH에서 -20 ° C에서 자료를 저장합니다.
  12. 10 분 - 준비가 계속되면, 다시 수화물 100 %의 EtOH를 제거하고 PBTw에 66 % EtOH로 교체하여 샘플은 5 앉아 보자. 10 분 - 5 방치, PBTw에 33 % EtOH로 반복합니다. 마지막으로 모든 EtOH를 제거하기 위해 PBTw의 3 배 5 분 세척으로 세척한다.

3. 테-K, TEA 및 포스트 - Fi를xation

참고 : 우리는 빨리 시간이 중요한 솔루션을 교환 메쉬 바닥으로 가장 효율적이고 부드러운 방법을 작은 바구니에 다음 단계를 수행 찾을 수 있습니다. 이들은 집에서 만든 수 있지만, 우리는 Intavis InSituPro -Vsi 액체 처리 로봇 (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc)와 호환되는 바구니 (중간 크기)를 사용합니다. 이러한 바구니 쉽고 빠르게 교환 해결하기 위해, 12 웰 조직 배양 접시 (TCD)의 웰 사이에서 이동 될 수 있거나, 상기 용액은 잘 피펫을 사용하여 흡인 할 수있다. 대안 적으로, 모든 용액 교환 단순히 유충으로부터 상등액을 흡인하여이 바구니없이 수행 될 수있다. 이 경우에 완만 한 선회 운동 상등액은 웰의 에지로부터 제거 될 수 있도록 접시의 중앙에 모든 배아와 유충을 집중한다. 다음은 사용자가 용액 교류 바스켓을 이용하는 것으로 가정.

  1. 피펫을 사용하여, PBTw 2 ㎖로 12 웰 TCD에 앉아 바구니에 전송 배아와 애벌레.
    참고 :. 추가 된 발달 단계에 따라 할 수있다 배아 및 / 또는 유충의 수는 있지만 엄지 손가락의 일반적인 규칙은 배아 / 애벌레 (즉, 무료로 공간의 25 % 이상을 유지하는 것입니다, 조사되고,하지 ) 바구니를 혼잡하게.
  2. 적절한 테-K 용액 (도 1 참조) 2 ㎖, 2 ml의 0.2 %의 글리신 각각 다른 웰이 잘 인접를 준비한다. 테-K의 잘 포함하는 적당한 농도로 각각의 바구니를 이동하고 바로 타이밍을 시작합니다.
  3. 10 분 후 잘 포함 0.2 % 글리신으로 각각의 바구니를 이동하고 5 분 동안 품어. 그런 다음 0.2 % 글리신과 두 번째 우물에 각 바구니를 이동하고 5 분 동안 품어. 3 ㎖ PBTw의 3 배 5 분의 교류와 글리신을 씻으십시오.
  4. PBTw 솔루션을 제거하고 새로 제조 트리에탄올 아민 (TEA) 졸 한 번 샘플을 치료5 분주의에 대한의 ution은! 선동하지 마십시오. 5 분 동안 새로 제조 TEA 용액 3 ㎖로 교체하십시오. 선동하지 마십시오. 샘플에서 TEA 용액의 대부분을 흡인. 무수 초산 (TEAAA) 용액으로 새로 제조 트리에탄올 아민을 추가하고 5 분.주의 부화! 선동하지 마십시오.
  5. 선택 사항 - 위의 단계가 배양되는 동안, TEAAA 솔루션의 또 다른 신선한 배치를 준비하고 위의 단계를 반복합니다.
    참고 : TEAAA와이 두 번째 치료는 선택 사항이지만 완전히 배경을 생성하는 경향이 프로브 모든 배경을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  6. 우물에서 흡입하여 TEAAA 솔루션을 제거하고 PBTw 3 ㎖로 교체합니다. 선동하지 마십시오. PBTw를 제거하고 PBTw 3.7 % 포름 알데히드의 3 ㎖를 적용합니다. 부드럽게 30 분 배양하는 동안 때때로 소용돌이 친다.
  7. 우물에서 흡입하여 정착액을 제거하고 PBTw 3 ㎖로 교체합니다. 1.5 ML 튜브로 자료를 전송합니다. 아르 자형하이브리드 버퍼로 PBTw을 eplace 및 RT에서 5 분 동안 품어 -주의.
  8. RT 핫 블록에 튜브를 배치하고, 원하는 혼성화 온도까지 온도를 설정한다.
    참고 : 하이브리드 온도가 특정 프로브이며, 경험적으로 최적화 될 필요가있을 것이다, 그러나 우리는 55 ° C 좋은 온도 처음 재판을받을 수 찾을 수 있습니다. 블록이 혼성화 온도오고, 샘플은 약 15 분 동안 예비 혼성화 할 수 있도록 허용 (즉, 그 이상은 리보 프로브를 제조하는 데 소요되는 시간은 필요하지 않다). 적절한 볼륨 희석 된 리보 프로브의 (일반적으로 100 μl를) 준비합니다. 우리는 초기 범위 100 및 500 ng를 / ㎖의 일반적으로 시험 프로브 농도. 우리는 12에 따라 리보 프로브를 준비합니다.
  9. 시료의 혼성화 완충액을 제거하고 샘플을 혼성화 완충액에 프로브를 추가한다. 100 μL (또는 적절한 부피 오버레이 혼성화 buffe 위에 상을 형성R)의 미네랄 오일.
    주 : 미네랄 오일이 긴 혼성화 단계에서 형성됩니다 광범위한 결로를 방지 할 수 있습니다. 광범위한 축합 크게 혼성화 용액의 화학 프로브의 농도 모두를 변경한다.
  10. 프로브와 10 분 동안 75 ℃로 샘플을 가열함으로써 표적 RNA를 변성하고 원하는 혼성화 온도로 열을 감소시킨다. (- 48 시간 24) 하이브리드는 12 시간 (O / N) 이상 최소 할 수있게합니다.
  11. 혼성화 중에는 열 블록으로부터 하나의 튜브를 제거 유상을 방해하지 않고 유충 중단 엄지와 집게 손가락 사이에서 급속으로 회전하고, 가열 블록에 교체한다. 12 시간 정도 -이 한 번 매 6를 반복합니다.

4. 뜨거운 세척 및 면역 적를

참고 : 우리는 다음 단계의 액체 처리 로봇을 사용하지만,이 또한 쉽게 수동으로 수행 할 수 있습니다. 이 경우, 배아와 애벌레 소자민련은. 그들은에서 혼성화 된 1.5 ml의 튜브에 보관 이후의 모든 솔루션 교환은 흡입과 P1,000 피펫으로 추가됩니다. 수동으로 수행하는 경우 다음 단계의 각각은 각각의 용액 1 ㎖를 채용한다.

  1. 열 적절한 볼륨 배속, 2 배의 (3 ㎖ 각 샘플에 대한 각) 및 하이브리드 온도 1X 세척 솔루션을.
  2. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 4 배 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 2 배 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 1X​​ 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오.
  3. 하이브리드 온도에서 1 배 나트륨 염화 나트륨 시트르산 버퍼 + 0.1 % 트윈 (SSC + 0.1 % 트윈) 한 번 모든 샘플을 씻으십시오. 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  4. 승 MAB를 반복 말레 산 버퍼 (MAB)이 1 배 SSC 솔루션을 교체 15 분 동안 1 배 SSC + 0.1 % 트윈에 두 번 모든 샘플을 세척하고 10 분 동안 앉아 보자금연 건강 증진 협회. 블록 솔루션 MAB를 교체하고 1.5 시간 동안 품어.
  5. (1 : 블록 솔루션 항체의 10,000 희석) 항체 용액의 블록 솔루션을 교환하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 12 시간 (O / N) 동안 품어.

5. 컬러 개발 및 장착

  1. 항체 솔루션을 기음 10 분 각각 PBTw으로 15 회 반복한다. 1 배 알칼리성 인산 버퍼 (AP)와 PBTw를 교체하고 10 분 동안 품어.
  2. 주의 - 상기 배양 단계로 진행하여 상기 AP 염색 액을 제조하는 동안 (보조 파일 2 참조). 잘 TCD로 자료를 전송하고 AP 염색 용액으로 1 배 AP 솔루션을 교체합니다. 시간의 길이는 발색 반응을 기록 할 수있는 장소를 차지하도록 현재 시간을 참고. 배경 잡음비가 최적이 될 때까지 염색 패턴의 발전을 모니터한다.
  3. 색상 개발을 중지하려면, 해당 WAST에 처분합니다 (1 배 AP 염색 용액을 제거전자 용기), 그리고 PBTw 2 ㎖을 적용하고 현재 시간을 확인합니다. 5 분마다 두 번 더 PBTw와 린스. 1.5 ML 튜브로 자료를 전송하는 데 다음과 헹굼 중 하나를 사용합니다.
  4. (이것은 또한 O / N을 수행 할 수 있습니다)에 PBTw를 제거하고 PBTw 3.7 % 포름 알데히드 1 ㎖을 적용하고 교반 또는 실온에서 적어도 30 분을 돌립니다.
  5. PBT의 3 세척 (적절한 폐기물 용기에 폐기물 정착액을 폐기)와 정착을 씻으십시오. 탈 이온수에 50 ° C에서 샘플을 3 회 반복한다.
    참고 :이 세척은 삭제 및 시각화 단계에서 표시 될 수 있습니다 염의 침전을 제거한다.
  6. 벤질 알코올 (BB : 또한 머레이의 맑은로 알려진 BA) 또는 글리세롤 샘플이 벤질 벤조 에이트에 설치할지 여부를 결정합니다.
    참고 : 우리는 더 강력한 청소 에이전트 BB를 선호 : BA를 L.로 stagnalis 배아는 다소 불투명하다. 샘플은 BB에 장착 할 수 있습니다 : BA 먼저 에탄올 시리즈를 통해 탈수해야합니다. 샘플은 60 %에 마운트 될글리세롤 바로 장착 될 수있다.
  7. 피펫을 사용하여 : (BA 또는 60 % 글리세롤 BB) 장착 용액에 샘플을 전송합니다.
    BB에 설치시 : 참고는 BA이 잘 된 유리에 수행해야합니다 (BB : BA는 폴리 카보네이트 플라스틱을 녹여 것입니다).
  8. 10 분 후 스페이서로 적층 된 커버 적절한 수의 (샘플 <1 dpfc, 샘플이 된 커버> 1 dpfc 1 커버 슬립)를 사용하여 슬라이드에 그들을 탑재 - 샘플이 5 취소 할 수 있습니다.
    참고 : 전체 마운트는 지금 DIC 광학와 복합 현미경을 사용하여 몇 군데 할 수 있습니다.

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Representative Results

도 3에 도시 된 대표적인 WMISH 염색 패턴이 상술 한 기술을 이용하여 생성하고, 쉘의 형성에 이르기까지의 분자 다양한 프로세스에 관여하는 유전자에 대한 공간 발현 패턴의 다양한 반영 하였다 (신규 유전자 1, 2, 3, 4) 개발 단계의 범위에 걸쳐 전사 조절 (Brachyury)으로 세포 - 세포 신호 (DPP)에 관한 것이다. 우리는 그들이 같은 것이라고 기대 이들 유전자의 발현 수준을 정량화하지 않은 반면 우리의 방법은 다양한 단계에서의 개발의 모든 단계에서 발현 유전자 산물의 광범위한 다양성에 대해 적용 할 수 있음을 나타내는 상당히 다양하다. 오직 여기에 제시된 유전자 (DPP) 중 하나는 이전 L. 설명 하였지만 stagnalis 21, 22. 우리가 여기서 제시 결과는 대부분이 이전 보고서와 유지에 있지만 상당히 높은 공간 RESO와 lution. Brachyury의 공간적 발현 패턴 전복 23에서 설명한 24 삿갓 조개 우리는 L. 대해 찾아 같은 두 경우에도 맨틀 세포에서 검출되었다되었습니다 stagnalis (그림 3 층). 직접 쉘 형성에 관여하는 유전자 생성물을 확인하기 위해 설계된 단백체 화면에서 4 (등 쉘 선 (도 3A와 B) 또는 셀 영역 (도 3c 및 D와 연관된 공간적 발현 패턴)이다 - 우리는 신규 유전자 1 격리 쉘 형성 기능이 완전히 합치. 이러한 결과가 우리가 알 캡슐에서 배아와 유충을 제거하기 위해 개발 한 고효율 기술 및 후단 특정 permeabilization 치료가 원위치 염색 고품질을 보장 할 전체 마운트 샘플들을 생성하는 것을 나타 배아와 애벌레 개발의 모든 단계에 대한 유전자의 다양한에 대한 패턴.

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그림 1. 요약 된 Lymnaea stagnalis의 개체 발생과 대응 고정 및 테-K 트리트먼트. 개발의 첫 번째 7 일 배아 및 유충의 대표 이미지는 크기 (행 1)이 크게 증가하고 형태 학적 복잡성 설명 (행 2 및 3) . 이러한 발달 변화가 큰 적절한 정착 시간 차이 최적 WMISH 신호를 생성 테-K 농도로 변환. WMISH를 들어 모든 단계는 달걀 캡슐 내에서 교반과 함께 실온에서 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 고정되어야한다. 모든 단계가 다음 10 분 동안 적절한 테-K의 농도로 처리되어야한다. 우리는 우리의 공급 업체 테-K의 활동에 중요한 간 배치의 변화를 관찰합니다. 이 변화는 performi으로 고려되어야한다NG 새로운 테-K의 활성이 실험적으로 결정된 "교정"WMISH 실험 원형이다. 그림에 명시된 테-K 농도는 따라서 초기 가이드, 발달 단계 사이 그러나 상대 농도로서 취급 할 필요가 있습니다. 설정 (예 : 이일 된 배아는 일보다 3 배 (1) 배아가 테-K 농도를 필요로) 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
Decapsule L.에 사용 된 그림 2. 장치 stagnalis 배아. (A)을 효율적으로 L.를 제거 할 수있는 장치의 개요 그들의 캡슐에서 stagnalis 배아 및 유충. (B)의 확대보기에서 노란색 박스 영역 (A). 날카로운 유리 바늘 끝이 튜브의 공동에 약 20 %의 돌출 (내경 1mm, 외경 3mm)하도록 상기 실리콘 튜브로 현미경 슬라이드 상에 배치되고 삽입된다. 유리 바늘은 다음 또한 현미경 슬라이드와 페트리 접시에 녹화된다. (C) 고정 배아 및 유충을 포함 A. 계란 캡슐에 노란색 박스 부분의 개략적 인 '계획'도 처음으로 20 ML의 주사기를 사용하여 수집됩니다. 주사기는 상기 실리콘 튜브에 부착되고, 캡슐이 튜브를 통해 바늘을지나 토출. 달걀 캡슐 막은 바늘 찢어진되고 유리 된 배아와 유충 물질을 마이크로 피펫을 사용하여 수집 접시에서 수집 될 수있다. (D) A.의 노란 박스 단면의 개략도 '단면'뷰 현미경 슬라이드 것을 보장 바늘이 정확한 높이에서 실리콘 튜브에 들어갑니다. (F) 장치를 통해 하나의 패스를 만든 애벌레의 대표적인보기입니다. 재료의 90 % 이상을 효과적으로 부드럽게 그들의 캡슐에서 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
L.의 범위에서 유전자의 다양성에 대해 WMISH 식 패턴의 그림 3. 대표 이미지 BA (머레이의 삭제) :. 위의 방법에 설명 BB에 장착하고 이미지화 된 바와 같이 여기에 설명 된 방법에 의해 생성 된 stagnalis 발달의 단계는 모든 발달 단계가 처리되었다. 대략적인 연령에에 표시됩니다각 패널과 방향의 페이지 오른쪽은 오른쪽 아래에 표시됩니다. 유전자 orthology는 (알려진 경우) 각 패널의 왼쪽 아래에 표시됩니다. 요약 : 쉘 선 (SG); 쉘 필드 (SF); 맨틀 (산); 발 (피트); Decapentaplegic (DPP); dpfc (일 첫 번째 분열을 게시). 모든 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 방법은 Lymnaea stagnalis의 모든 개발 단계에서 아마도 다양한 발현 수준과 RNA 전 사체를 효율적으로 시각화 있습니다. 그들의 캡슐에서 배아 및 유충을 제거하려면 우리가 다른 encapsulated-보고 화학, 삼투압 충격 및 물리적 처리의 다양한 평가판을 모델 생물을 개발하고 있습니다. 그러나, 우리의 손에 우리는 여기에서 설명하는 방법은 배아와 유충 손상없이 거친 캡슐 막을 제거 만 높은 처리량 기술이다. 캡슐화 후, 재료 중 하나에 저장 될 수 있고, 또는 테-K의 단계 특정 요법으로 치료 한 후, 리보 프로브 (riboprobe) 혼성화. (일반적으로 프로브 농도와 혼성화 온도에 초점을) 추가 실험 최적화 작업은 각 프로브 / 타겟을 위해 요구 될 수있다. (정착 요법 및 테-K 치료에 더하여) 이들 파라미터는 일반적으로 가장 영향력있는 변수현장 실험에있는의 (고정 된 재료의 품질과 RNA 프로브는 높은 수준의 것을 가정).

동일계에서 실험의 최종 결과에 적절한 테-K 치료의 중요성 L.위한 최우선 stagnalis. 이는 (0 μg의 / ㎖에서 500 μg의 / ㎖의 범위) 별개의 발달 단계에 필요한 테-K 농도의 넓은 범위에 반영된다. 개체 발생 창으로 주어진 달걀 문자열을 할당 할 수하는 것이 중요하다. 이를 위해, 우리는 그림 1에서 제공하는 가이드 라인을 알 수없는 연령의 발달 재료의 준비 수 있습니다 (이 그림의 인쇄 친화적 인 버전은 사용자가 자료를 준비 할 때 현미경에 가지고 유용하게 사용할 수 있음을 보충 파일 3에서 사용할 수 있습니다) . 우리는 WMISH에 대한 복족류 테-K 치료의 다른 종 중 하나 develo의 광범위한 일정하게 유지 될 수 있습니다pmental은 8,25,26 스테이지, 또는 전체 (27)를 생략 할 수있다. 이 L.의 상황에 대조적이다 stagnalis. 또한, 다른 연구 그룹은 이전에 L. 여러 유전자에 대한 WMISH 발현 패턴을보고하면서 우리는 여기 설명 stagnalis 유충 (22,28,29 참조)에있어서 훨씬 더 높은 공간 분해능의 패턴을 산출한다. 마지막으로, 우리는 우리의 공급 업체에서 테-K의 활동에 중요한 간 배치의 변화를 관찰했다. 이 변화는 새로운 테-K의 활동이 경험적으로 결정된다 '교정'WMISH 실험 라운드를 수행하여 회계 처리해야합니다. 그 배치에서 테-K의 분취와 이후의 모든 실험은 자유롭게 수행 할 수 있습니다.

우리는 이전에 L. 대한 대안 WMISH 방법을 설명 stagnalis 배아 및 유충 다른 12. 그 방법은 mucolyt 사용 상세한IC 에이전트 N- 아세틸 -L- 시스테인 (NAC)와 같은 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 나트륨 도데 실 설페이트로 예비 혼성화 처리 (SDS) 등의 환원제. 우리는 몇 가지 발달 단계에 대한 몇 가지 유전자의 염색 패턴을 강화하는 치료를 발견했다. (그 캡슐 내에 유충 고정) 우리가 최근에 개발되고 여기 설명 정착 전략 단순화 현장 실험에 대한 재료를 준비하는 데 필요한 단계를 촉진하고 명백하게 경험적 NAC, DTT 부가적인 최적의 예비 혼성화 치료 결정에 대한 필요성을 부정 또는 SDS. 여기에보고 기술에 대한 미래의 개선은 (이전에 30를보고 표준 WMISH 프로토콜을 수정 다음) 마이크로 RNA의 시각화의 mRNA의 이중 또는 삼중 라벨 (31)을 대상으로하고, WMISH 신호 (32)의 형광 시각화를 포함 할 수있다. 논증 기술의 가장 큰 한계는 collectin로부터 이동하는 데 걸리는 시간의 전체 길이는g 재료 주어진 유전자 발현 패턴을 나타내는 디지털 이미지. 때문에 이러한 과정에서 이루어져야 생화학 및 생물 물리학 이벤트의 성격이 현장 하이브리드 프로토콜 대부분의 고유 한 기능입니다.

Lymnaea은 매우 모델 생물의 측면에서 과소 대표 인 후생 내 위치를 차지한다. 대표 Spiralian으로, Lymnaea는 쉘 형성 (12)과 몸 선성 33-35로 별개의 형태 학적 기능의 진화에 대한 통찰력을 가지고 있고 가치있는 neuroethology (36)과 신경 생리학 모델 9,37입니다 수 있습니다. 이러한 효율적 반응계에서의 유전자 발현 패턴을 가시화 할 수있는 능력과 같은 강력한 기술들은 모델 생물로서 Lymnaea의 기능을 증가시키고, 그것을 해결하기 위해 사용될 수있는 다양한 질문 넓어. 한번에 때 큰 시퀀스 DAT 생성asets (전체 전 사체, 심지어 게놈)는 상대적으로 루틴, 이러한 방법은 모델에서 시퀀스 데이터의 홍수를 해석하고자하는 연구자들에게 더 관련성이 될 것입니다. Lymnaea는 상대적으로 파생 복족류 (38)이며, 다른 모델 생물 (1.22 기가 39)에 비해 큰 게놈 간주되는 것을 가지고 있지만, 그것은 매력적인 모델 시스템을 만드는 많은 실용적이고 재미있는 기능을 가지고 있습니다. 우리가 여기서 설명하는 방법은 Lymnaea에 사용할 수있는 도구 상자를 확장하여 개발을 캡슐화 거칩니다 다른 종에 사용 될 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

이 작품은 DFG 프로젝트 #의 JA2108 / 2-1를 통해 DJJ에 자금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

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References

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