A monte intero
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Summary

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è una tecnica che consente la risoluzione spaziale di molecole di acido nucleico (spesso mRNA) all'interno di una preparazione dei tessuti 'intero monte', o stadio di sviluppo (ad esempio, un embrione o larva) di interesse. WMISH è estremamente potente, perché può contribuire in modo significativo alla caratterizzazione funzionale di genomi complessi metazoi, una sfida che sta diventando sempre più di un collo di bottiglia con il diluvio di dati di sequenza di prossima generazione. Nonostante la semplicità concettuale della tecnica molto tempo è spesso necessaria per ottimizzare i vari parametri inerenti esperimenti WMISH per sistemi modello nuovi; sottili differenze nelle proprietà cellulari e biochimiche tra tipi di tessuto e le fasi di sviluppo significa che un singolo metodo WMISH potrebbe non essere adatto per tutte le situazioni. Abbiamo sviluppato una serie di metodi WMISH per il modello gasteropode Lymnaea stagnalis riemergenti che generano coerente esegnali WMISH chiari per una serie di geni, e in tutte le fasi di sviluppo. Questi metodi includono l'assegnazione di larve di sconosciuto età cronologica a una finestra ontogenetica, la rimozione efficiente di embrioni e larve dalle loro capsule uovo, l'applicazione di un idoneo trattamento con proteinasi-K per ogni finestra ontogenetica e ibridazione, post-ibridazione e immunolocalizzazione gradini. Questi metodi forniscono una base da cui il segnale risultante per un dato trascrizione di RNA può essere ulteriormente raffinato con aggiustamenti specifici sonda (principalmente sondare concentrazione e temperatura di ibridazione).

Introduction

I molluschi sono un gruppo di animali che tengono l'interesse di una vasta diversità di discipline scientifiche. Nonostante la loro diversità morfologica 1, ricchezza di specie (secondo solo a Artropodi in termini di numero di specie 2) e rilevanza per una vasta gamma di commerciali 3, 4 medici e scientifici questioni 5-8, ci sono relativamente poche specie di molluschi che possono vantare di essere entrambi i modelli scientifici ben attrezzate e facili da mantenere in un ambiente di laboratorio. Un mollusco che è molto utilizzato da discipline come la neurobiologia 9, ecotossicologia 10 e la biologia evolutiva, più recentemente 11,12, è Lymnaea stagnalis, soprattutto a causa della sua distribuzione capillare ed estrema facilità di manutenzione. Nonostante la sua popolarità come un organismo 'modello' e la sua lunga storia di utilizzo da parte di biologi dello sviluppo 13-19, la gamma e la potenza di strumenti molecolari a disposizione del L. stagnalis comunità scientifica si trova molto indietro che di più modelli tradizionali animali (Drosophila, il mouse, ricci di mare, nematodi).

Il nostro desiderio di sviluppare Lymnaea come un modello molecolare deriva da un interesse per i meccanismi molecolari che guidano la formazione del guscio. Questo ci ha spinto a perfezionare un insieme di tecniche che permettano per la visualizzazione efficiente, coerente e sensibile dell'espressione genica durante lo sviluppo Lymnaea s '. Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è ampiamente utilizzato per una varietà di organismi modello ed è stato in uso per più di 40 anni 20. Nelle sue varie forme, ISH può essere impiegato per localizzare spazialmente loci specifici sui cromosomi, rRNA, mRNA e micro-RNA.

Una delle sfide che abbiamo bisogno di affrontare prima di perfezionare un metodo per WMISH L. stagnalis è stata la questione degli embrioni estrazione dolcemente e in modo efficiente e larve di varie fasi, dalla tsi capsule uovo in cui sono depositati. Questa estrazione, o 'decapsulation', deve essere realizzato in modo efficiente per raccogliere materiale adeguato per un dato esperimento in situ, mentre allo stesso tempo mantenere l'integrità morfologica e cellulare. Mentre altri organismi modello subiscono anche lo sviluppo incapsulato, nelle nostre mani nessuno dei metodi riportati per quelle specie potrebbe essere impiegato con successo in L. stagnalis.

Gli obiettivi generali di questo metodo sono quindi: per estrarre L. stagnalis embrioni e larve dalle loro capsule in un modo high-throughput, di applicare i trattamenti pre-ibridazione che ottimizzano il segnale WMISH, per preparare gli embrioni e larve con WMISHsignals soddisfacenti per l'imaging.

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Protocol

NOTA: Le seguenti operazioni delineano il nostro metodo per condurre un esperimento in situ su stadi embrionali e larvali di L. stagnalis. Qualora un passo prevede l'utilizzo di un prodotto chimico pericoloso questo è indicato dalla parola 'ATTENZIONE' e tutte le procedure di sicurezza appropriate devono essere adottate. Collegamenti a fogli rappresentative scheda di sicurezza per sostanze chimiche pericolose sono forniti in file supplementare 1. Ricette per tutti i reagenti sono forniti in file integrativa 2.

1. Assemblea dei Decapsulation Apparato

  1. Per fare questo, collegare un 20 siringa monouso ml a tubo in silicone (con diametro interno di 1 mm e un diametro esterno di 3 mm) utilizzando un taglio punta P 1.000 a una lunghezza appropriata come mostrato nella Figura 2A.
  2. Nastro un vetrino da microscopio standard per un grande piatto di Petri invertita. Nastro il tubo in silicone immediatamente adiacente al vetrino da microscopio, come mostrato in figura60; 2C e 2D.
  3. Riposo un ago di vetro tirato sul vetrino e delicatamente inserirla nel tubo di silicio fino a che la punta dell'ago sporge circa il 20% del modo attraverso il diametro interno del tubo (vedere la Figura 2C e 2D). Una volta che l'ago è in posizione del nastro verso il basso al piatto Petri.
  4. Lasciare che l'estremità libera del tubo di silicio di riposare in un altro piatto di Petri che raccoglierà il materiale decapsulated.

2. Raccolta dei campioni, Fissazione e Decapsulation

NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Raccogliere accuratamente stringhe di uova dalle mura di un acquario. Per fare questo, utilizzare un pezzo di plastica flessibile come una spatola per raschiare la stringa uovo fuori dal substrato, e utilizzare un setaccio del tè di plastica a pescare la stringa uovo galleggiante fuori dall'acqua. Stage e ordinare il materiale sotto un microscopio utilizzando la guida fornita in Figura1.
  2. Posizionare la stringa uovo su un tovagliolo di carta e fare una incisione longitudinale lungo la massa delle uova usando le pinze piuma. Arrotolare le capsule uovo fuori della stringa uovo e rimuovere la maggior quantità di materiale gelatinoso possibile da ogni capsula spingendoli intorno al tovagliolo di carta utilizzando le pinze piuma.
  3. Utilizzando le pinze piuma, trasferire le capsule a base di uova in una capsula di Petri contenente 5 ml di acqua di rubinetto. Continuare a raccogliere de-gelatina capsule uovo degli stadi di sviluppo desiderati in questo piatto. Raccogliere abbastanza capsule da tutti gli stadi di sviluppo per l'esperimento WMISH previsto quindi procedere alla fase successiva.
  4. Quando si lavora con le larve più sviluppati (5 giorni dopo prima scissione (dpfc) e più anziani) anestetizzare loro prima della fissazione.
    NOTA: Questo consentirà di evitare i muscoli dal contraente che fa l'interpretazione in situ pattern di colorazione molto difficili.
    1. Relax larve (mentre sono ancora nella loro capsules) in una soluzione al 2% w / v di MgCl 2 • 6H 2 O per 30 minuti prima della fissazione.
    2. Valutare il grado di rilassamento dopo 30 min immergendo diverse larve, pur nelle loro capsule uovo in soluzione fissativo e monitorare la loro risposta al microscopio. Incompleto larve rilassato si ritrae nel loro guscio, mentre le larve completamente rilassato non risponderà. Una volta che queste larve sono state rilassato procedere alla fase successiva.
  5. Trasferire le capsule uovo usando un'ampia pipetta di plastica foro in un tubo sigillato che fornisce 10 volte il volume di capsule uovo (per es., 1 ml di capsule regolate richiederebbe un tubo 10+ ml).
  6. Aspirare il più liquido possibile dal tubo e sostituirlo con un volume di soluzione di fissativo che è 10 volte il volume delle capsule uovo stanziali. Ruotare delicatamente le capsule a base di uova in fissativo a temperatura ambiente per il momento opportuno per ogni fase di sviluppo (vedi Figura 1).
  7. DiscontinRotazione ue e consentire le capsule per affondare e aspirare la soluzione fissativo in un contenitore per i rifiuti appropriato.
  8. Lavare le capsule uovo sostituendo la soluzione fissativa con tampone fosfato con 0,1% Tween-20 (PBTw) e rotante a temperatura ambiente per 5 min. Aspirare il PBTw e ripetere due volte.
  9. Rimuovere embrioni e larve di loro capsule utilizzando l'apparecchiatura (vedi paragrafo 1 per i dettagli) mostrata nella Figura 2. Disegnare le capsule nella siringa 20 ml, collegare il tubo e poi dissipare le capsule attraverso il tubo e passato il ago di vetro fuori in il piatto di raccolta.
    NOTA: In genere, la maggior parte (> 90%) di tutte le capsule dovrebbe essere necessario solo un passaggio attraverso il dispositivo. In molti casi la membrana capsula è danneggiato ma embrioni e larve rimangono all'interno della capsula rottura. Rielaborare questo materiale semplicemente la sua elaborazione nella siringa e dissipare nuovo.
  10. Raccogliere gli embrioni decapsulate e larve in una provetta da 1,5 ml con un microfonoropipette (a P20 per sul 0 - 3 giorno di età larve, e P200 per le larve anziani con l'estremità della punta tagliati).
    NOTA: Una pausa (fino a diversi mesi) nel protocollo può essere fatta in questa fase. Se ciò è necessario, il materiale decapsuled dovrebbe essere raccolto in una provetta da 1,5 ml per immagazzinaggio (continua alla fase successiva). In caso contrario, continua immediatamente al protocollo 3.
  11. Lasciare embrioni e larve a depositarsi sul fondo del tubo e aspirare il surnatante. Sostituire con 33% di etanolo (EtOH) in PBTw e lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Ripetere con il 66% EtOH in PBTw e il 100% EtOH. Lavare larve due volte in 100% EtOH a RT Conservare il materiale a -20 ° C in 100% EtOH.
  12. Quando si è pronti per continuare, reidratare i campioni rimuovendo il 100% EtOH e la sua sostituzione con il 66% EtOH in PBTw, lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Ripetere con il 33% EtOH in PBTw, lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Infine lavare con 3x 5 min lavaggi di PBTw per garantire che tutti EtOH viene rimosso.

3. proteinasi-K, TEA e Post-fifissazione

NOTA: Troviamo eseguire le seguenti operazioni in piccole ceste con un pavimento a rete il metodo più efficace e delicata per lo scambio rapido di soluzioni critiche di tempo. Mentre questi possono essere fatti in casa, usiamo i cestini (di medie dimensioni) che sono compatibili con il Intavis InSituPro -Vsi movimentazione liquido robot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tali cesti possono essere rapidamente e facilmente spostati tra i pozzetti di una ben coltura tissutale piatto 12 (TCD) per soluzioni di cambio, oppure la soluzione può essere aspirati dal pozzetto con una pipetta. In alternativa, tutti gli scambi di soluzioni possono essere effettuate senza questi cestini semplicemente aspirare il surnatante dal larve. In questo caso un delicato movimento rotatorio si concentrerà tutti gli embrioni e larve al centro del piatto permettendo il surnatante viene rimosso dal bordo del pozzo. Di seguito si presuppone che l'utente sta impiegando cestini per lo scambio di soluzioni.

  1. Usando una pipetta, Embrioni e larve di trasferimento in un cesto seduto in un 12 ben TCD con 2 ml di PBTw.
    NOTA:. Il numero di embrioni e / o larve che possono essere aggiunti dipende dallo stadio di sviluppo in fase di studio, ma una regola generale è quello di mantenere almeno il 25% dello spazio al suolo privo di embrioni / larve (vale a dire, non lo fanno sovraffollamento nel carrello).
  2. Preparare un adiacente bene con 2 ml di soluzione di proteinasi-K appropriata (vedi Figura 1), e un altro 2 pozzetti con 2 ml di 0,2% Glycine ciascuna. Spostare ogni canestro nel pozzo contenente la concentrazione appropriata di proteinasi-K ed iniziare immediatamente la tempistica.
  3. Dopo 10 min spostare ciascun cestello in un pozzetto contenente 0,2% Glicina e incubare per 5 min. Quindi spostare ciascun cestello nella seconda sacca con 0,2% Glicina e incubare per 5 min. Lavare la glicina con 3x 5 min scambi di 3 ml PBTw.
  4. Rimuovere la soluzione PBTw e trattare i campioni una volta con trietanolammina (TEA) sol preparati al momentoution per 5 min ATTENZIONE! Non agitare. Sostituire con 3 ml di soluzione di tè appena preparato per 5 min. Non agitate. Aspirare la maggior parte della soluzione di TEA dai campioni. Aggiungere il Trietanolammina appena preparato con la soluzione di anidride acetica (TEAAA) e incubare per 5 min. ATTENZIONE! Non si agita.
  5. OPTIONAL - Mentre il passo precedente è in incubazione, preparare un altro lotto fresco di soluzione TEAAA e ripetere il passo precedente.
    NOTA: Questo secondo trattamento con TEAAA è facoltativo, ma può aiutare a eliminare completamente tutti i sfondo con sonde inclini a generare sfondo.
  6. Rimuovere la soluzione TEAAA aspirando dal pozzo e sostituire con 3 ml di PBTw. Non agitate. Rimuovere il PBTw e applicare 3 ml di 3,7% di formaldeide in PBTw. Mescolare delicatamente di tanto in tanto nel corso di un 30 minuti di incubazione.
  7. Rimuovere il fissativo aspirando dal pozzo e sostituire con 3 ml di PBTw. Trasferire il materiale in una provetta da 1,5 ml. REPosizionare il PBTw con tampone di ibridazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente - ATTENZIONE.
  8. Porre i tubi in un blocco a caldo a temperatura ambiente, e impostare la temperatura alla temperatura desiderata ibridazione.
    NOTA: La temperatura di ibridazione è sonda specifica e dovrà essere empiricamente ottimizzati, tuttavia troviamo 55 ° C per essere una buona temperatura di processo inizialmente. Lasciare il blocco di venire alla temperatura di ibridazione, e permettere ai campioni di pre-ibridano per circa 15 min (cioè, il tempo necessario per preparare le riboprobes, più non è necessario). Preparare volumi adeguati (normalmente 100 mL) dei riboprobes diluiti. Abbiamo concentrazioni sonda genere di prova di 100 e 500 ng / ml come una gamma iniziale. Prepariamo riboprobes secondo 12.
  9. Rimuovere il tampone di ibridazione dai campioni e aggiungere la sonda nel tampone di ibridazione ai campioni. Overlay con 100 microlitri (o un volume sufficiente per formare una fase sopra la buffe ibridazioner) di olio minerale.
    NOTA: L'olio minerale impedisce vasta condensa che si forma durante l'ibridazione lunga. condensa Extensive altererà significativamente sia la chimica della soluzione di ibridazione e la concentrazione della sonda.
  10. Denaturare la sonda e RNA bersaglio riscaldando i campioni a 75 ° C per 10 minuti, poi ridurre il calore alla temperatura di ibridazione desiderata. Lasciare ibridazione di procedere per un minimo di 12 ore (O / N) o più a lungo (24-48 ore).
  11. Durante l'ibridazione rimuovere un singolo tubo dal blocco di calore, ruotare rapidamente tra pollice e indice di sospendere le larve senza disturbare la fase oleosa, e sostituirlo nel blocco di calore. Ripetere questa volta ogni 6-12 ore o giù di lì.

4. Hot Lava e immunorilevazione

NOTA: Oltre ad utilizzare un robot di movimentazione liquido per le seguenti operazioni, queste possono facilmente essere fatto manualmente. In questo caso, gli embrioni e larve shoULD essere conservato in provette da 1,5 ml sono stati ibridati in. Tutti gli scambi di soluzioni successive vengono aspirati e ha aggiunto con una pipetta P 1.000. Quando eseguito manualmente ognuno dei seguenti passaggi dovrebbero impiegare 1 ml di ciascuna soluzione.

  1. Calore volumi adeguati (3 ml ciascuno per ogni campione) del 4x, 2x e 1x soluzioni di lavaggio alla temperatura di ibridazione.
  2. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 4x per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 2x per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 1X per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione.
  3. Lavare tutti i campioni una volta con 1x Sodio cloruro Sodio Citrato tampone + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) alla temperatura di ibridazione. Lasciare che i campioni raffreddare a temperatura ambiente.
  4. Lavare tutti i campioni due volte in 1x SSC + 0,1% Tween per 15 min Sostituire questa soluzione SSC 1x con maleica Acid Buffer (MAB) e lasciate riposare per 10 minuti Ripetete il MAB wcenere. Sostituire MAB con la soluzione di blocco e incubare per 1,5 ore.
  5. Sostituire la soluzione di blocco per soluzione di anticorpi (1: 10.000 diluizione degli anticorpi in soluzione di blocco) e incubare per 12 ore (O / N) a temperatura ambiente con agitazione.

5. Colore di sviluppo e di montaggio

  1. Aspirare la soluzione di anticorpi e lavare 15 volte con PBTw per 10 minuti ciascuno. Sostituire PBTw con 1x fosfatasi alcalina Buffer (AP) e incubare per 10 min.
  2. Mentre i suddetti proventi fase di incubazione, preparare la soluzione colorante AP (vedi file supplementare 2) - ATTENZIONE. Trasferire il materiale in un TCD bene e sostituire la soluzione 1x AP con la soluzione AP colorazione. Si noti il ​​tempo in modo che la lunghezza del tempo di reazione di colore avviene per può essere registrato. Monitorare lo sviluppo del pattern di colorazione finché il rapporto segnale sfondo è ottimale.
  3. Per fermare lo sviluppo del colore, rimuovere la soluzione colorante 1x AP (smaltire nel eri appropriatae container), e applicare 2 ml di PBTw e prendere nota del tempo. Lavare due volte con PBTw per 5 minuti ciascuna. Utilizzare uno di questi risciacqui per trasferire il materiale in una provetta da 1,5 ml.
  4. Rimuovere il PBTw e applicare 1 ml di 3,7% di formaldeide in PBTw e agitare o ruotare per almeno 30 min a RT (ciò può essere fatto anche O / N).
  5. Lavare il fissativo con 3 lavaggi di PBT (smaltire il fissativo rifiuti in un contenitore per i rifiuti appropriato). Lavare i campioni 3 volte a 50 ° C in acqua deionizzata.
    NOTA: Questi lavaggi eliminano la precipitazione dei sali che può diventare visibile durante la compensazione e passaggi di visualizzazione.
  6. Decidere se i campioni devono essere montati in benzoato benzilico: Alcool benzilico (BB: BA, noto anche come chiaro di Murray) o glicerolo.
    NOTA: Preferiamo il più potente agente di compensazione BB: BA come L. embrioni stagnalis sono un po 'opaco. I campioni per essere montati in BB: BA in primo luogo bisogno di essere disidratati attraverso una serie di etanolo. I campioni da montare nel 60%glicerolo può essere montato immediatamente.
  7. Trasferire i campioni nella soluzione di montaggio (BB: BA o 60% glicerolo) con una pipetta.
    NOTA: Durante il montaggio in BB: BA questo deve essere fatto in un bicchiere ben (BB: BA si scioglierà policarbonato).
  8. Consentire ai campioni di chiaro per 5 - 10 minuti, e poi montarli su un vetrino con un numero adeguato di vetrini accatastati come distanziatori (1 vetrino per i campioni <1 dpfc, 2 lamelle per campioni> 1 dpfc).
    NOTA: i supporti interi possono ora essere ripreso con un microscopio composto con ottica DIC.

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Representative Results

I pattern di colorazione WMISH rappresentante mostrato in Figura 3 sono stati generati utilizzando la tecnica sopra descritta, e riflettono una varietà di modelli di espressione spaziale per geni coinvolti in una serie di processi molecolari che vanno dalla formazione del guscio (gene Novel 1, 2, 3 e 4), alla segnalazione cellula-cellula (DPP) del regolamento di trascrizione (Brachyury) in una serie di fasi di sviluppo. Anche se non abbiamo quantificato i livelli di espressione di questi geni ci aspettiamo che avrebbero anche variare in modo significativo, che indica che il nostro metodo può essere applicato contro una vasta gamma di prodotti genici espressi in tutte le fasi di sviluppo a vari livelli. Solo uno dei geni qui presentati (DPP) è stato precedentemente descritto in L. stagnalis 21,22. I risultati che presentiamo qui sono in gran parte in linea con questi rapporti precedenti, ma con significativamente più alta Reso spaziale luzione. Il pattern di espressione spaziale delle Brachyury stata descritta in abalone 23 e patelle 24 e in entrambi i casi è stato anche rilevato in cellule mantello ci per L. stagnalis (Figura 3F). Abbiamo isolato i geni Novel 1 - 4 (da uno schermo proteomica progettato per identificare prodotti genici direttamente coinvolti nella formazione del guscio, e così i loro pattern di espressione spaziale associati alla ghiandola del guscio (Figura 3A e B) o il campo della shell (Figura 3C e D) sono completamente congruenti con funzioni di shell-formatura. Questi risultati indicano che la tecnica elevato throughput abbiamo sviluppato per la rimozione di embrioni e larve dalla capsula uovo e successivi trattamenti permeabilizzazione specifici stadi, generano interi campioni montaggio che consentiranno di ottenere alta qualità in situ colorazione modelli per una vasta varietà di geni per tutte le fasi di sviluppo embrionale e larvale.

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Figura 1. Il riepilogo Ontogeny di Lymnaea stagnalis e fissazione corrispondente e proteinasi-K trattamenti. Immagini rappresentative di embrioni e larve dei primi 7 giorni di sviluppo illustrano un aumento significativo in termini di dimensioni (riga 1) e la complessità morfologica (righe 2 e 3) . Questi cambiamenti evolutivi si traducono in grandi differenze nel tempo di fissazione appropriata e concentrazioni proteinasi-K che generano segnali WMISH ottimali. Per WMISH tutte le fasi devono essere fissati in 3,7% di formaldeide in PBS a temperatura ambiente con agitazione all'interno delle loro capsule uovo. Tutte le fasi devono quindi essere trattati con la concentrazione proteinasi-K appropriato per 10 min. Si noti che osserviamo notevole variabilità inter-lotto nell'attività di proteinasi-K dal nostro fornitore. Questa variazione deve essere rappresentato da performing un giro di "calibrazione" esperimenti WMISH dove l'attività del nuovo proteinasi-K è empiricamente determinato. Le concentrazioni proteinasi-K indicati nella figura devono quindi essere trattati come una guida iniziale, tuttavia le relative concentrazioni tra stadi di sviluppo (ad esempio 2 giorni embrioni richiedono una concentrazione proteinasi-K 3 volte superiore rispetto al giorno 1 embrioni) sono impostati. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. apparecchio utilizzato per Decapsule L. stagnalis embrioni. (A) Una panoramica degli apparecchi in grado di rimuovere in modo efficiente L. embrioni e larve stagnalis dalle loro capsule. (B) Una vista ingrandital'area gialla scatola in (A). Un ago di vetro tagliente è posto sul vetrino da microscopio e inserito nel tubo in silicone (diametro interno 1 mm diametro esterno 3 mm) in modo tale che la punta sporga circa il 20% del modo nella cavità del tubo. L'ago di vetro viene anche attaccata al vetrino da microscopio e la piastra di Petri. (C) Vista A 'piano' schematico della sezione scatolata giallo in A. capsule a base di uova contenenti embrioni fissi e larve vengono prima raccolti con la siringa da 20 ml. La siringa viene quindi collegato al tubo in silicone e le capsule espulsa attraverso il tubo e oltre l'ago. Membrane capsula Egg sono strappati dal ago e il materiale embrionale e larvale liberata possono essere raccolti dal piatto di raccolta utilizzando una micropipetta. (D) Un 'sezione' vista schematica della sezione scatolata giallo in A. Il vetrino assicura che il ago entra il tubo in silicone all'altezza corretta. (F) Una vista rappresentativa larve che hanno fatto un singolo passaggio attraverso l'apparecchiatura. Più del 90% del materiale è stato efficacemente e delicatamente rimossi dal loro capsule. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Il rappresentante immagini di modelli di espressione WMISH contro una varietà di geni da una serie di L. . Fasi stagnalis Sviluppo generati dal metodo qui descritto Tutte le fasi di sviluppo sono stati trattati come descritto nel metodo di cui sopra e sono stati montati e ripreso in BB: BA (di Murray chiaro). età approssimative sono indicati in ap destra di ogni pannello e l'orientamento è indicato in basso a destra. Gene ortologia (se noto) è indicata in basso a sinistra di ciascun pannello. Abbreviazioni: ghiandola del guscio (SG); campo della shell (sf); mantello (mt); piede (ft); Decapentaplegic (DPP); dpfc (giorni dopo prima scissione). Tutte le barre di scala sono 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo qui descritto permette la visualizzazione efficiente dei trascritti di RNA con presumibilmente diversi livelli di espressione all'interno di tutte le fasi di sviluppo di Lymnaea stagnalis. Per rimuovere gli embrioni e larve dalle loro capsule abbiamo trialed una varietà di sostanze chimiche, shock osmotico e trattamenti fisici riportati per altri encapsulated- lo sviluppo di organismi modello. Tuttavia, nelle nostre mani il metodo che descriviamo qui è l'unica tecnica high-throughput che rimuove la membrana della capsula dura senza danneggiare gli embrioni e larve. Dopo decapsulation, il materiale può essere conservato, o trattate con un regime specifico stadio della proteinasi-K e quindi ibridato ad un riboprobe. Ulteriori sforzi di ottimizzazione empirici (tipicamente focalizzati sulla concentrazione della sonda e la temperatura di ibridazione) può essere richiesto per ciascuna sonda / bersaglio. Questi parametri (in aggiunta al regime di fissazione e trattamenti proteinasi-K) sono tipicamente i parametri più influentidi qualsiasi nell'esperimento situ (supponendo che la qualità del materiale fisso e la sonda di RNA sono di livello alto).

L'importanza di un adeguato trattamento proteinasi-K al risultato finale di un esperimento in situ è fondamentale per L. stagnalis. Ciò si riflette nella vasta gamma di concentrazioni proteinasi-K richiesti dalle fasi di sviluppo distinte (da 0 pg / ml a 500 mg / ml). È quindi importante poter assegnare una stringa uovo per una finestra ontogenetica. A tal fine, la linea guida che mettiamo a disposizione in figura 1 consente la messa in scena di materiale inerente allo sviluppo di età sconosciuta (una versione stampata amichevole di questa figura è disponibile in file supplementare 3 che gli utenti possono trovare utile avere al microscopio quando staging materiale) . Notiamo che per altre specie di gasteropodi trattamenti proteinasi-K per WMISH può o essere mantenuta costante per una vasta gamma di svipmental stadi 8,25,26, oppure può essere completamente omessa 27. Ciò è in netto contrasto con la situazione in L. stagnalis. Inoltre, mentre gli altri gruppi di ricerca hanno riportato in precedenza pattern di espressione WMISH per diversi geni in L. stagnalis larve (vedi 22,28,29) il metodo che descriviamo qui produce i modelli di risoluzione spaziale significativamente più alto. Infine, abbiamo osservato significativa variazione inter-batch nell'attività della proteinasi-K dal nostro fornitore. Questa variazione deve essere contabilizzato effettuando un giro di "calibrazione" esperimenti WMISH dove l'attività del nuovo proteinasi-K è empiricamente determinato. Tutti gli esperimenti successivi con aliquote di proteinasi-K da quel lotto possono quindi essere liberamente eseguite.

Abbiamo precedentemente descritto un metodo alternativo per WMISH L. embrioni e larve stagnalis altrove 12. Tale metodo dettagliato l'uso del mucolytagente ic N-acetil-L-cisteina (NAC), un agente riducente quale ditiotreitolo (DTT) e un trattamento pre-ibridazione con sodio dodecil solfato (SDS). Abbiamo trovato quei trattamenti migliorati ai modelli di marcatura di alcuni geni per alcune fasi di sviluppo. La strategia di fissazione che abbiamo recentemente sviluppato e descriviamo qui (fissaggio larve all'interno delle loro capsule) semplifica e velocizza i passaggi necessari per preparare il materiale per un nell'esperimento situ, e apparentemente nega la necessità di determinare empiricamente ulteriori trattamenti ottimali pre-ibridazione con NAC, DTT o SDS. Perfezionamenti futuri alla tecnica riportata qui potrebbero includere la visualizzazione dei microRNA (in seguito modifiche ai protocolli standard di WMISH precedentemente riportati 30), l'etichettatura doppia o tripla di mRNA obiettivi 31, e la visualizzazione fluorescente di segnali WMISH 32. Probabilmente il più grande limitazione della tecnica è la lunghezza complessiva di tempo necessario per andare da collecting il materiale, ad un'immagine digitale che rappresenta un dato pattern di espressione genica. A causa della natura degli eventi biochimici e biofisici che devono avvenire durante tale processo questa è una caratteristica intrinseca di più in protocolli di ibridazione in situ.

Lymnaea occupa una posizione all'interno del metazoi che è estremamente sotto-rappresentato in termini di organismi modello. Come Spiralian rappresentante, Lymnaea può portare comprensione della evoluzione della caratteristiche morfologiche distinte, come la formazione del guscio 12 ed il corpo prepotenza 33-35 ed è anche una preziosa neuroetologia 36 e neurofisiologia modello di 9,37. Potenti tecniche come la possibilità di visualizzare in modo efficiente modelli di espressione genica in situ aumenta la funzionalità di Lymnaea come organismo modello, e amplia la serie di domande che può essere utilizzato per affrontare. Nel momento in cui la generazione di grandi dat sequenzaasets (trascrittoma completo e anche genomi) è relativamente di routine, tali metodi saranno più rilevanti per i ricercatori che desiderano interpretare il flusso di dati di sequenza da tali modelli. Mentre Lymnaea è un gasteropode relativamente derivato 38, e possiede quello che sarebbe stato considerato un grande genoma in confronto ad altri organismi modello (1.22 Gb 39), ha molte caratteristiche pratiche e interessanti che lo rendono un sistema di modello attraente. I metodi che descriviamo qui espandere la casella degli strumenti a disposizione Lymnaea e possono essere utili ad altre specie che subiscono incapsulati sviluppo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di DJJ attraverso il progetto DFG # JA2108 / 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

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References

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