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 JoVE Bioengineering

कई रंगों के साथ उच्च गति से संरचित रोशनी TIRF माइक्रोस्कोपी के लिए एक गाइड

1, 1, 1

1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

Article
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    Summary

    Cite this Article

    Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).

    Abstract

    संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के साथ ऑप्टिकल सुपर संकल्प इमेजिंग रासायनिक और जैव चिकित्सा विज्ञान में आणविक स्तर पर प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। हालांकि वाणिज्यिक सिम सिस्टम उपलब्ध हैं, सिस्टम है कि कस्टम वाणिज्यिक प्रणालियों मात कर सकते हैं प्रयोगशाला में तैयार कर रहे हैं, बाद में आम तौर पर इस्तेमाल करते हैं और सामान्य प्रयोजन के आवेदनों की आसानी के लिए, दोनों इमेजिंग निष्ठा और गति के मामले में बनाया गया है। यह लेख एक सिम प्रणाली कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) ​​रोशनी का उपयोग करता है और एक संकल्प 100 एनएम तक पहुंचने में तीन रंगों में 10 हर्ट्ज के लिए ऊपर में इमेजिंग के लिए सक्षम है कि निर्माण के लिए एक में गहराई से गाइड प्रस्तुत करता है। सिम और TIRF के संयोजन के कारण, प्रणाली प्रतिद्वंद्वी प्रौद्योगिकियों की तुलना में बेहतर छवि के विपरीत है। इन विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए, कई ऑप्टिकल तत्वों सभी उपलब्ध उत्तेजना wav के लिए रोशनी प्रकाश का ध्रुवीकरण राज्य और स्थानिक संरचना पर स्वचालित नियंत्रण सक्षम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंelengths। हार्डवेयर कार्यान्वयन और नियंत्रण पर पूर्ण विवरण अधिकतम अधिग्रहण फ्रेम दर प्राप्त करने पर जोर देने के साथ उत्तेजना प्रकाश पैटर्न पीढ़ी, तरंग दैर्ध्य, ध्रुवीकरण राज्य, और कैमरा नियंत्रण के बीच तुल्यकालन प्राप्त करने के लिए दिया जाता है। प्रणाली संरेखण और जांच के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है और प्राप्त संकल्प सुधार आदर्श परीक्षण नमूने पर मान्य है। वीडियो दर सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए क्षमता जीवित कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है।

    Introduction

    पिछले आधे दशक से अधिक, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी परिपक्व और जीवविज्ञानी के हाथों में विशेषज्ञ प्रकाशिकी प्रयोगशालाओं से ले जाया गया है। वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप समाधान ऑप्टिकल सुपर संकल्प को प्राप्त करने के लिए तीन मुख्य वेरिएंट के लिए मौजूद हैं: एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM), प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED), और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) 1,2। SMLM photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में इस तरह के बड़े पैमाने पर ऑप्टिकल सेटअप की सादगी और उच्च स्थानिक संकल्प के वादे के कारण सबसे लोकप्रिय तकनीक से किया गया है, आसानी से 20 समुद्री मील दूर करने के लिए नीचे। एक अणु स्थानीयकरण के माध्यम से हालांकि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एक आंतरिक व्यापार बंद के साथ आता है: स्थानिक संकल्प प्राप्य व्यक्ति fluorophore localizations के लिए पर्याप्त संख्या में जमते, इसलिए अस्थायी समाधान सीमित पर निर्भर है। इमेजिंग गतिशील प्रक्रियाजीवित कोशिकाओं में es इसलिए समस्याग्रस्त हो जाता है के रूप में एक पर्याप्त रूप से ब्याज की संरचना के आंदोलन करते हुए भी उस समय एक छवि को फिर से संगठित करने के लिए पर्याप्त स्थानीयकरण घटनाओं के अधिग्रहण प्रस्ताव कलाकृतियों को रोकने के लिए नमूना चाहिए। आदेश में इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, जीवित कोशिका SMLM प्रदर्शनों बहुत उत्तेजना शक्ति में वृद्धि से fluorophore photoswitching दरों में अपेक्षित वृद्धि प्राप्त की है, और इस phototoxicity और oxidative तनाव के बदले में ले जाता है, जिससे नमूना अस्तित्व बार और जैविक प्रासंगिकता 3 सीमित।

    दोनों सिम और SMLM खत्म STED का एक स्पष्ट लाभ यह है कि यह मोटी नमूनों में सुपर संकल्प, लगभग 60 एनएम का उदाहरण पार्श्व संकल्प के साथ छवि के लिए organotypic मस्तिष्क स्लाइस में गहराई में 120 माइक्रोन से 4 हासिल की थी सकता है। SMLM या सिम का एक उद्देश्य के कार्यान्वयन के साथ इस तरह की गहराई में इमेजिंग अव्यावहारिक है, लेकिन या तो एकल अणु प्रकाश चादर या जाली प्रकाश शीट mic के साथ संभव हो जाता हैroscopy 5। वीडियो दर STED भी प्रदर्शन किया गया है और synaptic पुटिका गतिशीलता नक्शा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि अब तक इस दृश्य 6 के छोटे क्षेत्रों इमेजिंग तक ही सीमित कर दिया गया है।

    कोशिका जीव विज्ञान और आणविक आत्म विधानसभा प्रतिक्रियाओं 7 में अनुप्रयोगों के लिए - 12 में कई बार के अंक से अधिक उच्च अस्थायी समाधान के साथ इमेजिंग की आवश्यकता है कि, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के रूप में यह एक विशेष फ्लोरोसेंट की photophysical गुणों पर निर्भर नहीं है हो सकता है अच्छी तरह से अनुकूल जांच। सिम के इस निहित लाभ के बावजूद, अब तक इसके उपयोग मुख्य रूप से तय की कोशिकाओं या धीमी गति से चलती प्रक्रियाओं इमेजिंग तक ही सीमित कर दिया गया है। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिम सिस्टम की सीमाओं की वजह से है: इन उपकरणों के अधिग्रहण के फ्रेम दर की आवश्यकता sinusoidal रोशनी पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से ध्रुवीकरण प्रकाशिकी बनाए रखने उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल gratings के रोटेशन की गति द्वारा सीमित था। वाणिज्यिक सिम की नई पीढ़ीउपकरणों तेज इमेजिंग में सक्षम हैं, लेकिन वे बेहद सब लेकिन केंद्रीय इमेजिंग सुविधाओं के लिए महंगे हैं।

    इस प्रोटोकॉल पतली नमूनों में और निकट जीवित कोशिकाओं के बेसल सतह तेजी प्रक्रियाओं इमेजिंग के लिए एक लचीला सिम प्रणाली के निर्माण के लिए एक गाइड प्रस्तुत करता है। यह एक रोशनी पैटर्न जो नमूना 13 जो बेहद फोकस पृष्ठभूमि संकेत से बाहर कम कर देता में एनएम कोई लगभग 150 से अधिक गहरा प्रवेश उत्पन्न करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) कार्यरत हैं। TIRF के साथ सिम के संयोजन के विचार सिम में ही 14 के रूप में लगभग रूप में पुरानी है लेकिन 2006 से पहले 15 प्रयोगात्मक एहसास नहीं था। TIRF-सिम के साथ प्राप्त पहले इन विवो छवियों 11 हर्ट्ज की 16 फ्रेम दर को प्राप्त करने tubulin और kinesin कल्पना करने के लिए 2009 में सूचित किया गया गतिशीलता, और दो ​​रंग TIRF-सिम सिस्टम 17,18 प्रस्तुत किया गया है। अभी हाल ही में निर्माण और एक ही रंग के दो-बीम सिम के उपयोग के लिए एक गाइडystem अप करने के लिए 18 हर्ट्ज 19,20 के फ्रेम दर की विशेषता प्रस्तुत किया गया था।

    सेट-अप यहाँ प्रस्तुत तीन रंगों, जिनमें से दो TIRF-सिम में संचालित किया जा सकता है में 20 हर्ट्ज पर सिम सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए सक्षम है। पूरे सिस्टम को एक औंधा माइक्रोस्कोप फ्रेम के आसपास का निर्माण और एक piezo actuated Z मंच के साथ एक मोटर चालित XY अनुवाद चरण का उपयोग करता है। TIRF-सिम के लिए आवश्यक sinusoidal उत्तेजना पैटर्न उत्पन्न करने के लिए, प्रस्तुत प्रणाली एक ferroelectric स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (SLM) का उपयोग करता है। बाइनरी झंझरी पैटर्न SLM पर प्रदर्शित कर रहे हैं और जिसके परिणामस्वरूप ± 1 विवर्तन आदेश, छान relayed और उद्देश्य लेंस की TIR रिंग में ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। आवश्यक चरण बदलाव और gratings का घुमाव प्रदर्शित किया SLM छवि को बदलने से लागू कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल का वर्णन बनाने के लिए और इस तरह के एक उत्तेजना पथ संरेखित करने के लिए कैसे, उत्सर्जन पथ के संरेखण का विवरण, और इष्टतम संरेखण सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण के नमूने प्रस्तुत करता है। यह भी डे के मुद्दों और उच्च गति TIRF-सिम के लिए विशेष चुनौतियों का ध्रुवीकरण नियंत्रण और घटकों के तुल्यकालन के बारे में तो शास्त्री।

    डिजाइन संबंधी और प्रतिबन्ध

    इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत TIRF-सिम प्रणाली कोडांतरण से पहले, वहाँ कई डिजाइन की कमी है जो ऑप्टिकल घटकों के चुनाव को निर्धारित करने पर विचार कर रहे हैं। ऑप्टिकल घटकों के सभी संक्षिप्त 1 चित्रा को देखें।

    स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (SLM)

    एक द्विआधारी ferroelectric SLM इस सेटअप में इस्तेमाल के रूप में यह उप millisecond पैटर्न स्विच करने में सक्षम है। स्केल Nematic SLMs इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इन बहुत प्रदान करते हैं स्विचन समय कम। पर या पिक्सेल छूट हर एक द्विआधारी चरण में SLM, या तो एक π या 0 चरण घटना विमान wavefront करने के लिए ऑफसेट प्रदान करेगा इसलिए अगर एक आवधिक झंझरी पैटर्न SLM यह एक चरण विवर्तन झंझरी के रूप में काम करेंगे पर प्रदर्शित होता है।

    ईएनटी "> कुल आंतरिक परावर्तन (TIR)

    TIR प्राप्त करने और एक क्षणभंगुर क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए, गिलास नमूना इंटरफेस में उत्तेजना बीम की घटना कोण महत्वपूर्ण कोण से अधिक होना चाहिए समीकरण । यह न्यूनतम घटना कोण की आवश्यकता है, और इसलिए भी अधिकतम रिक्ति, या अवधि, क्षणभंगुर रोशनी पैटर्न का सेट। अधिकतम घटना कोण समीकरण (स्वीकृति कोण) उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) परिभाषा से गणना की जा सकती है जिसके द्वारा सीमित है समीकरण । यह प्राप्त रिक्ति न्यूनतम पैटर्न को निर्धारित करता अब्बे सूत्र के अनुसार समीकरण एनए और तरंग दैर्ध्य लिंक जिसमें समीकरण न्यूनतम पैटर्न रिक्ति को (यानी। TIR रिंग) और जिसमें दो उत्तेजना foci सही तैनात किया जाना चाहिए प्राप्त होता है और ठीक प्रत्येक रोशनी पैटर्न उत्पन्न करने के लिए घुमाया में एक अंगूठी को परिभाषित।

    TIRF-सिम छवियों के पुनर्निर्माण की आवश्यकता पैटर्न रोटेशन के अनुसार तीन चरण बदलाव की एक न्यूनतम के अधिग्रहण इसलिए SLM पैटर्न अवधि 3 से भाज्य होना चाहिए (चित्रा 1 देखें)। उदाहरण के लिए, 488 एनएम रोशनी के लिए 9 पिक्सल और 640 एनएम रोशनी के लिए 12 पिक्सल की अवधि। SLM पैटर्न डिजाइन के व्यापक चर्चा, sheared gratings का उपयोग कर रिक्ति पैटर्न के उप पिक्सेल अनुकूलन सहित के लिए, Kner एट अल। 16 और लू-वाल्थर एट अल। 20 दो उत्तेजना foci की स्थिति के पिछले काम, ± 1 आदेशों का हालांकि विवर्तन कोण को देखने के सभी तरंग दैर्ध्य के लिए TIR रिंग के अंदर होना चाहिए से SLM तरंग दैर्ध्य है निर्भर है। मानक सिम के लिए, बहुरंगा इमेजिंग सबसे लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य के लिए झंझरी अवधि के अनुकूलन, और छोटे चैनलों के लिए प्रदर्शन में एक नुकसान बर्दाश्त द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। TIRF-सिम के लिए हालांकि, एक तरंग दैर्ध्य के लिए अनुकूलन का मतलब है कि अन्य तरंग दैर्ध्य foci TIR रिंग के भीतर नहीं रह रहे हैं। उदाहरण के लिए, 9 पिक्सल के एक झंझरी अवधि का उपयोग कर 488 एनएम के लिए TIRF प्रदान करने के लिए पर्याप्त है, के रूप में foci वापस एपर्चर की और TIR रिंग के भीतर व्यास के 95% से कम हैं, लेकिन 640 एनएम के लिए इस अवधि के बाहर foci स्थिति होगी एपर्चर। इस कारण से अलग पिक्सेल पैटर्न spacings प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

    TIRF-सिम उत्तेजना पथ के संरेखणपारंपरिक सिम में बेहद माइक्रोस्कोप शरीर में dichroic दर्पण की स्थिति में छोटे परिवर्तन (चित्रा 1 में DM4) के प्रति संवेदनशील है, बहुत अधिक तो नहीं है। एक घूर्णन फिल्टर क्यूब बुर्ज का उपयोग अनुशंसित नहीं है, बजाय एक एकल, बहु बैंड dichroic दर्पण है, जो उत्तेजना का इस्तेमाल किया तरंग दैर्ध्य के लिए एक निश्चित स्थिति में रखा है और विशेष रूप से बनाया गया है का उपयोग करें। यह जरूरी है कि केवल उच्चतम गुणवत्ता dichroic दर्पण इस्तेमाल कर रहे हैं। ये कम से कम 3 मिमी मोटी substrates की आवश्यकता होती है, और अक्सर "इमेजिंग फ्लैट" निर्माताओं द्वारा नामित कर रहे हैं। अन्य सभी substrates असहनीय विपथन और TIRF-सिम में छवि गिरावट के लिए नेतृत्व।

    ध्रुवीकरण नियंत्रण

    TIRF-सिम प्राप्त करने के लिए यह रोशनी पैटर्न के साथ synchronicity में उत्तेजना प्रकाश का ध्रुवीकरण राज्य बारी बारी से करने के लिए आवश्यक है कि इस तरह की यह ऑप्टिकल धुरी के संबंध में उद्देश्य पुतली विमान में azimuthally ध्रुवीकृत रहता है (यानी। एस-ध्रुवीकृत)। ध्रुवीकरण नियंत्रण प्रकाशिकी के संरेखण एक मोटर रोटेशन चरण 22 में एक Pockels सेल 21, या एक आधे लहर थाली, कार्यरत विशिष्ट ऑप्टिकल तत्व पर निर्भर करेगा उदाहरण के लिए। इस प्रोटोकॉल में एक कस्टम लिक्विड क्रिस्टल चर retarder (LCVR), प्रयोग किया जाता है तरंगदैर्ध्य रेंज पर पूरा-लहर (2π) retardance प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया 488 640 एनएम के रूप में यह अनुमति देता है तेजी से (~ मिसे) स्विचिंग करने के लिए। एक लिक्विड क्रिस्टल retarder का उपयोग अगर यह एक उच्च गुणवत्ता घटक का उपयोग करने के लिए आवश्यक है: मानक घटकों आम तौर पर काफी स्थिर कैमरा जोखिम समय के लिए होता है जो की लंबाई पर एक निरंतर retardance देने के लिए नहीं कर रहे हैं एक रोशनी पैटर्न और कम मॉडुलन विपरीत से बाहर धुंधला । लिक्विड क्रिस्टल retarders भी दृढ़ता से तापमान निर्भर कर रहे हैं और तापमान नियंत्रण में निर्मित की आवश्यकता होती है।

    तुल्यकालन

    लेज़रों SLM के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए। बाइनरी ferroelectric SLMs आंतरिक रूप से रों से संतुलित कर रहे हैंराज्य पर और राज्य से एक के बीच witching। पिक्सल केवल या तो अपने पर या राज्य से दूर है, लेकिन नहीं दौरान interframe स्विचन समय में आधे के रूप में लहर प्लेटों काम करते हैं। इसलिए लेज़रों पर ही बंद / पर राज्यों के दौरान एलईडी के माध्यम से पैटर्न विपरीत में कमी को रोकने के लिए SLM से संकेत सक्षम पिक्सल के मध्यवर्ती राज्य होने के कारण बंद किया जाना चाहिए। यदि लेज़रों डिजिटल संग्राहक नहीं जा सकता है एक acousto ऑप्टिक न्यूनाधिक (AOM) वैकल्पिक रूप से एक तेजी से शटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

    लेंस की पसंद

    इन बाधाओं के आधार पर, उत्पादन करने के लिए नमूना विमान पर SLM विमान के लिए जरूरी demagnification वांछित रोशनी पैटर्न निर्धारित किया जा सकता है। यह दो लेंस L3 और L4 की छवि रिले दूरबीन और उत्तेजना कंडेनसर लेंस L5 में की फोकल लंबाई की गणना के लिए अनुमति देता है। इस प्रणाली में एक 100X / 1.49NA तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस 488 एनएम और 640 एनएम उत्तेजना के साथ प्रयोग किया जाता है, इसलिए 300 और 140 मिमी की फोकल लंबाई का उपयोग करता हैL4 और L3, और L5 के लिए 300 मिमी, 357X की कुल demagnification, नमूना विमान में 38 एनएम के एक SLM पिक्सेल आकार के बराबर देने के लिए। लेंस के इस संयोजन का उपयोग करना, SLM 488 एनएम रोशनी और 640 एनएम नमूना में 172 और 229 एनएम का पैटर्न spacings देने के लिए 12 पिक्सल के लिए 9 की अवधि झंझरी, 70 डिग्री और 67 डिग्री के कोण क्रमशः की घटनाओं के लिए इसी। एक गिलास पानी इंटरफेस के लिए, महत्वपूर्ण कोण 61 डिग्री है, और तरंग दैर्ध्य से स्वतंत्र है, इसलिए इन दोनों के पैटर्न spacings दोनों तरंग दैर्ध्य के लिए TIRF उत्तेजना अनुमति देते हैं। , या अगर 37 डिग्री सेल्सियस पर काम कर रही एक उद्देश्य के लिए एक सुधार कॉलर से लैस लेंस coverslip मोटाई में बदलाव द्वारा शुरू की गोलाकार aberrations के सुधार के लिए उपयोगी है।

    छवि पुनर्निर्माण

    एक बार जब कच्चे सिम डेटा अधिग्रहण किया गया है यह एक दो कदम प्रक्रिया में सुपर हल छवियों को उत्पन्न करने के लिए कम्प्यूटेशनल प्रयास का एक मामला है। सबसे पहले, रोशनी पैटर्न के लिए निर्धारित किया हैहर छवि और दूसरी बात, सिम स्पेक्ट्रम के घटकों को अलग कर दिया और उचित रूप से recombined प्रभावी OTF समर्थन (चित्रा 6 देखते हैं, insets) डबल के रूप में किया जाना चाहिए।

    अनुमान रोशनी पैटर्न का सटीक ज्ञान सर्वोपरि है, के रूप में सुपर हल आवृत्ति घटकों अमिश्रित के रूप में सही रूप में ओवरलैपिंग घटकों के अवशिष्ट भागों की वजह से कलाकृतियों को रोकने के लिए संभव हो सकता है। हम निर्धारित रोशनी पैटर्न प्रक्रिया Gustafsson एट अल। 23 संक्षेप में, रोशनी मानकों का एक सेट है कि एक सामान्यीकृत दो आयामी sinusoid का वर्णन द्वारा शुरू निम्नलिखित कच्चे छवि डेटा से एक अनुभवजन्य मानकों में से प्रत्येक के लिए मिल सकता है समीकरण उत्तेजना पैटर्न समीकरण :

    समीकरण

    इसके द्वारा समीकरण तथा समीकरण हाशिये पर विपरीत और पैटर्न के साथ क्रमश: प्रत्येक व्यक्ति की छवि मीटर के चरण शुरू करने का वर्णन है। लहर वेक्टर के घटकों, समीकरण तथा समीकरण , केवल अलग झुकाव के साथ बदलना समीकरण पैटर्न और कर सकते हैं के अन्यथा स्थिर माना। कटा लहर वेक्टर कच्चे छवि स्पेक्ट्रा के एक पार सहसंबंध किया जाता है, जो के रूप में ओवरलैप अनुकूलन करने के लिए पार से सहसंबद्ध छवियों में से एक के लिए सब-पिक्सेल पारियों लगाने से परिष्कृत किया जाता है के घटकों का निर्धारण करने के लिए। यह वास्तविक अंतरिक्ष चरण ढ़ाल के गुणन के माध्यम से किया जाता है समीकरण कि fre में एक सब-पिक्सेल पारी प्रेरितquency-स्पेस। ध्यान दें कि यह वास्तविक पैटर्न के आकलन के लिए पहले लहर-वैक्टर का एक अच्छा अनुमान है करने के लिए उपयोगी है और यह एक फ्लोरोसेंट मनका परत इमेजिंग द्वारा पाया जा सकता है।

    स्थानांतरित कर दिया पैटर्न के बीच चरण कदम के रूप में समीकरण , अर्थात्। समीकरण , आवृत्ति घटकों की जुदाई "चरण अक्ष" के साथ बदलना एक फूरियर द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। वैश्विक चरण समीकरण और हाशिये पर विपरीत समीकरण उसके बाद विभिन्न घटकों के जटिल रेखीय प्रतिगमन का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। अलग-अलग अलग घटकों तो एक सामान्यीकृत वीनर फिल्टर का उपयोग संयुक्त रहे हैं। दोनों पैरामीटर निष्कर्षण और सामान्यीकृत वीनर फिल्टर के कार्यान्वयन के एक विस्तृत वर्णन के लिए हम Gustafsson के लिए पाठक का उल्लेखएट अल। 23 जहां एक ही एल्गोरिथ्म प्रयोग किया जाता है।

    Protocol

    1. व्यवस्था और उत्तेजना पथ संरेखित

    1. ऑप्टिकल मेज पर घटकों के पदों मार्क (ऑप्टिकल सेटअप के एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें)। अलग उद्देश्य, लेंस L3, L4, L5, और SLM उनके संबंधित फोकल ऐसी है कि SLM सतह उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ पर relayed हो जाएगा लंबाई की राशि से प्रत्येक।
    2. माइक्रोस्कोप फ्रेम के फिल्टर क्यूब बुर्ज में बहु-बढ़त dichroic दर्पण DM4 डालें।
    3. माउंट एक 1 "वर्ग गतिज आईने में दूसरे dichroic दर्पण DM3 डालें, और कंडेनसर लेंस L5 से एक फोकल लंबाई दूर यह स्थिति।
      नोट: यह उत्तेजना पथ डिजाइन शामिल दो समान dichroic DM3 और DM4 जो एक ही उत्पादन बैच से ले रहे हैं समान ऑप्टिकल गुण सुनिश्चित करने के लिए दर्पण। dichroic दर्पण (DM4) ऐसी स्थिति में है कि एस पी और कुल्हाड़ियों माइक्रोस्कोप (DM3) में स्थित dichroic की तुलना में बंद कर रहे हैं जिससे किसी भी रद्दध्रुवीकरण अण्डाकार अपनी birefringence द्वारा शुरू की (चित्रा 1)। यह मुआवजा प्रत्येक रोशनी तरंग दैर्ध्य के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है। यह कदम उच्च मॉडुलन विपरीत बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
    4. उत्तेजना रास्ते में किसी भी लेंस डालने से पहले, सही प्रणाली के लिए ऑप्टिकल अक्ष परिभाषित करते हैं।
      1. बुर्ज से उद्देश्य लेंस (ओ) निकालें और बजाय एक संरेखण उपकरण में पेंच। यह दोनों सिरों पर दो संरेखण डिस्क के साथ एक 500 मिमी लंबे ऑप्टिकल पिंजरे प्रणाली के होते हैं।
      2. दो संरेखण डिस्क में छेद के केंद्र के माध्यम से लेजर 1 से एक collimated संदर्भ चलाने बीम dichroic दर्पण DM3 और एक अस्थायी संरेखण दर्पण SLM की अनुमानित बाद में स्थान पर तैनात प्रयोग करें। चित्र 1 में दर्शाया तीन दर्पण और dichroic दर्पण DM2 का उपयोग कर अस्थायी दर्पण के लिए लेजर बीम 1 से प्रत्यक्ष। SLM स्थिति पर अस्थायी दर्पण ऑप्टिकल अक्ष को सीधा करने के लिए बंद किया जाना चाहिए।
      3. संरेखण निकालें उपकरण एक बार मोटे ऑप्टिकल अक्ष determined.Insert किरण पथ में एक आईरिस किया गया है इससे पहले कि यह माइक्रोस्कोपी शरीर में प्रवेश करती है और बीम पर यह केंद्र। एक छोटा सा छेद iris.Reinsert उद्देश्य लेंस (ओ) पर केन्द्रित साथ सफेद कार्ड का एक टुकड़ा देते।
        नोट: किरण उद्देश्य छोड़ने अब अत्यधिक अलग-अलग हो सकता है, लेकिन लेंस है कि सफेद कार्ड पर दिखाई जाएगी के पीछे की सतह से एक बहुत कमजोर प्रतिबिंब नहीं होगा। सभी लेंस, भले ही वे विरोधी प्रतिबिंब लेपित हैं, कमजोर वापस प्रतिबिंब है कि समाक्षीय संरेखण सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता होगा। किरण बिल्कुल लेंस को सीधा है, तो फिर वापस प्रतिबिंब आईरिस के केंद्र के माध्यम से वापस जाना होगा
      4. (SLM स्थिति पर DM3 और संरेखण दर्पण) दो दर्पण को चलने का कोणीय समायोजन करें पर वापस प्रतिबिंब केंद्र के लिएआने वाली किरण के साथ कार्ड। अस्थायी रूप से उद्देश्य लेंस (ओ) को हटाने और एक संदर्भ की स्थिति पैदा करने के लिए छत पर लेजर हाजिर निशान।
      5. तालिका के पिरोया छेद के साथ संदर्भ बीम की ऊंचाई पर irises की एक जोड़ी डालें। किरण ऑप्टिकल मेज की सतह के समानांतर होना चाहिए। ऑप्टिकल अक्ष अब परिभाषित किया गया है।
    5. कंडेनसर लेंस (L5) लगभग एक फोकल उद्देश्य से दूर लंबाई डालें। संदर्भ किरण की दिशा के साथ अनुवाद करने के लिए एक रेखीय अनुवाद चरण सेट पर इस लेंस माउंट।
    6. कंडेनसर लेंस स्थिति और कोण समायोजित ऐसी है कि किरण उद्देश्य छोड़ने collimated है और छत पर संदर्भ शानदार विकल्प है। जाँच करें कि लेंस फिर आईरिस और सफेद कार्ड के साथ वापस प्रतिबिंब की जाँच करके किरण को सीधा है। उद्देश्य लेंस (ओ) को हटाने और छवि रिले टेलीस्कोप (L4) के दूसरे लेंस डालने।
      नोट: उचित कोलिमेशन और हो के गैर विक्षेपन सुनिश्चित करनाAM जब वहाँ किरण पथ में लेंस की एक भी नंबर है आसान कर दिया है।
    7. स्थिति और इस लेंस के कोण एक रेखीय अनुवाद मंच का उपयोग कोलिमेशन बनाए रखने के लिए और यह सुनिश्चित करने के संदर्भ किरण अभी भी छत पर चिह्नित पूरी करता है समायोजित करें।
    8. उद्देश्य लेंस (ओ) की जगह है और दूरबीन (L3) के पहले लेंस डालने। पिछले चरणों में वर्णित है, कोलिमेशन और गैर-विक्षेपन सुनिश्चित करने के लिए स्थिति और इस लेंस के कोण समायोजित करें।
    9. एक जिम्बल पर SLM चिप माउंट जो चिप सतह के केंद्र के बारे में अनुवाद के बिना रोटेशन प्रदान करता है।
      नोट: विशिष्ट बढ़ते डिजाइन का इस्तेमाल किया SLM पर निर्भर करता है। SLM एक पर्वत के बिना आपूर्ति की जाती है, तो यह एक कस्टम machined एल्यूमीनियम प्लेट जो फिर एक लेंस जिम्बल पर्वत से जुड़ा हुआ है के लिए तय की जानी चाहिए।
    10. साथ लेंस गठबंधन, दर्पण के स्थान पर SLM डालें। SLM कि इस तरह के संदर्भ किरण SLM चिप के केंद्र में स्थित है की स्थिति को समायोजित, और एक समायोजितऐसे GLE कि बीम दो रिले लेंस (L3 और L4) से होकर गुजरता है। जाँच करें कि संदर्भ किरण अभी भी चिह्नित की मौके पर ही केंद्रित है।
    11. विस्तार और एक Keplerian किरण विस्तारक का उपयोग करते हुए संदर्भ किरण collimate।
      1. समायोजन में आसानी के लिए एक पिंजरे प्रणाली में दो लेंस (एल 1 और एल 2) माउंट।
      2. केंद्र लेंस को हटाने और उन्हें irises के साथ जगह से संदर्भ बीम पर पिंजरे प्रणाली।
      3. दो लेंस डालें और विस्तारित बीम एक बाल काटना interferometer का उपयोग कर collimate करने के लिए एल 2 का अक्षीय स्थिति को समायोजित। एल 2 SLM की सतह से एक फोकल लंबाई दूर किया जाना चाहिए।
      4. जाँच करें कि विस्तार किया किरण अभी भी दो रिले लेंस L3 और L4 के बाद collimated है। कोलिमेशन के लिए जाँच करने के लिए सिर्फ DM3 के बाद बाल काटना interferometer का प्रयोग करें।
    12. एक बार उत्तेजना पथ एक एकल तरंगदैर्ध्य, युगल किरण पथ में अन्य दो लेज़रों के लिए गठबंधन किया गया है। का उपयोग कर उत्तेजना पथ पर केन्द्रित दो irises के माध्यम से प्रत्येक बीम के रास्ते पर लानाकिरण के संयोजन dichroic दर्पण (DM1 और DM2)।

    2. ध्रुवीकरण रोटेटर के संरेखण

    1. घटना ध्रुवीकरण करने के लिए 45 डिग्री पर अपनी तेजी अक्ष के साथ LCVR माउंट।
    2. LCVR करने के लिए बीम घटना के ठीक धुन ध्रुवीकरण कोण HWP और पार polarizers के बीच LCVR डालने से एक अवर्णी आधे लहर प्लेट (HWP) का उपयोग। प्रेषित शक्ति को कम करने के HWP घुमाएँ।
      नोट: आदेश में एक चर ध्रुवीकरण रोटेटर के रूप में कार्य करने के लिए, लिक्विड क्रिस्टल retarder (LCVR) की तेज अक्ष ठीक घटना ऊर्ध्वाधर बीम ध्रुवीकरण करने के लिए 45 डिग्री पर गठबंधन किया जाना चाहिए। LCVR शारीरिक रूप से 45 डिग्री पर मुहिम शुरू की है, लेकिन यह केवल एक मोटे संरेखण है। HWP LCVR तेजी धुरी के संबंध में घटना के ध्रुवीकरण का सही 45 डिग्री संरेखण सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तिमाही लहर प्लेट (QWP) एक कोण लागू वोल्टेज द्वारा नियंत्रित पर वापस रेखीय ध्रुवीकरण करने के लिए झुका अंडाकार ध्रुवीकरण LCVR से प्रेरित धर्मान्तरित24।
    3. LCVR के बाद QWP डालें और इसे बारी बारी से पार polarizers के बीच प्रेषित शक्ति कम करके भेजे ध्रुवीकरण करने के लिए अपनी धीमी अक्ष संरेखित करें।

    3. उत्सर्जन पथ के संरेखण

    1. कटा एक मंच सुक्ष्ममापी स्लाइड और प्रेषित प्रकाश का उपयोग कर कैमरे की स्थिति।
      1. लजीला व्यक्ति माइक्रोस्कोप oculars के प्रयोग पर ध्यान दें और इस स्थिति में ऑब्जेक्टिव लेंस तय कर लो।
      2. मोटे तौर पर कैमरा केंद्र और स्क्रीन पर छवि को देख कर ध्यान में लजीला व्यक्ति की छवि को लाने के लिए कैमरे की स्थिति के लिए कदम।
        नोट: एक बाहरी फिल्टर पहिया तो प्रयोग किया जाता है, तो फिल्टर क्यूब एक उत्सर्जन फिल्टर नहीं होगा, इसलिए oculars इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए जब लेज़रों पर बंद कर रहे हैं।
    2. पतले एक फ्लोरोसेंट मनका नमूना का उपयोग कर कैमरे की स्थिति को समायोजित।
      1. एक # 1.5 coverglass पर 100 एनएम बहुरंगा मोतियों की एक बूंद के प्रसार के द्वारा फ्लोरोसेंट मोतियों की एक monolayer तैयार करें। विकास के लिए छोड़ दोRY coverglass के लिए मोती सोखना करने के लिए और फिर पानी में फिर से विसर्जित कर दिया।
      2. विसर्जन के तेल के साथ उद्देश्य पर मनका नमूना रखें। पतले कैमरे की स्थिति को समायोजित ऐसी है कि फ्लोरोसेंट मनका परत ध्यान में है। उद्देश्य लेंस स्थिति को समायोजित एक बार फोकस पाया गया है मत करो।
        नोट: SLM नमूना विमान के लिए एक हवाई जहाज़ साधना में होना चाहिए, SLM की स्थिति, लेंस रिले, और उद्देश्य तय किया जाना चाहिए। ध्यान समायोजित करने के लिए, नमूना अक्षीय बजाय के उद्देश्य से एक पीजो Z-मंच का उपयोग कर ले जाते हैं।
    3. बिटमैप फ़ाइलों के रूप में उपयुक्त सिम बाइनरी झंझरी पैटर्न उत्पन्न करता है।
      1. 3 समान रूप से स्थान चरण बदलाव के साथ 3 पैटर्न झुकाव प्रत्येक: 2D / TIRF-सिम के लिए, 9 बाइनरी झंझरी छवियों की एक श्रृंखला उत्पन्न करते हैं। इन संख्यानुसार उत्पन्न एक चरण ऑफसेट आवेदन के साथ एक घुमाया 2 डी sinusoid से (उदाहरण के लिए MATLAB का उपयोग), तो एक द्विआधारी छवि का निर्माण करने thresholding। उदाहरण के कोड के लिए पूरक संहिता फ़ाइलें देखें।
      2. alignmen के लिएटी प्रयोजनों के लिए, यह भी झंझरी पैटर्न है कि, 3 झुकाव से प्रत्येक के लिए एक छोटे परिपत्र एपर्चर द्वारा विंडोड दिया है के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया उत्पन्न करते हैं। विंडोड संरेखण gratings बाहर से चालू होने की जरूरत नहीं है लेकिन मैन्युअल के माध्यम से उपयोगकर्ता द्वारा बंद किया जा सकता SLM के सॉफ्टवेयर।
        नोट: इष्टतम रोटेशन कोण की एक चर्चा और झंझरी पैटर्न पीढ़ी कोड 16,20 का एक उदाहरण के लिए संदर्भ देखें।
    4. (उदाहरण के लिए MetroCon) निर्माता की सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए SLM बिटमैप छवियों को अपलोड करें।
      1. SLM नियंत्रण सॉफ्टवेयर लोड और "कनेक्ट" पर क्लिक करें।
      2. "प्रदर्शनों की सूची" टैब में, प्रदर्शनों की सूची फ़ाइल को खोलने और फ़ाइल में निहित आदेश रनिंग की संख्या की जांच करने के लिए "लोड" पर क्लिक करें। उदाहरण के प्रदर्शनों की सूची दी गई फाइल में पांच रनिंग आदेश हैं।
      3. क्लिक करें SLM को प्रदर्शनों की सूची फ़ाइल अपलोड करने के लिए "बोर्ड को भेजें"।
      4. बिटमैप छवियों को एक अपलोड करने के लिए प्रतीक्षा करेंएन डी डिवाइस स्वचालित रूप से रिबूट करने के लिए।
        नोट: एक उदाहरण प्रदर्शनों की सूची फ़ाइल है, जो झंझरी बिटमैप छवियों और एक फाइल आदेश को परिभाषित करने में शामिल है, एक पूरक संहिता फ़ाइल के रूप में शामिल किया गया है। ".repz" फ़ाइल ज़िप फ़ाइल archiver सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खोला जा सकता है।
    5. एक विंडोड संरेखण पहले अभिविन्यास (उदाहरण के 0 डिग्री के लिए) के लिए SLM पर झंझरी प्रदर्शित करें।
      1. SLM नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, "स्थिति" टैब का चयन करें (इस आदेश चल रहा है "1" उदाहरण फ़ाइल के मामले में) चल क्रम की संख्या दर्ज करें।
      2. संरेखण झंझरी के लिए चल क्रम बदलने के लिए "का चयन करें" पर क्लिक करें।
        नोट: यह नमूना विमान में एक छोटे परिपत्र क्षेत्र रोशन करेंगे। SLM सतह सही ढंग से नमूना विमान संयुग्मित है तो इस क्षेत्र के किनारों को ध्यान में तेजी से हो जाएगा। के चिंतनशील backplane से शून्य के आदेश प्रतिबिंब: झंझरी पैटर्न L3 का ध्यान केंद्रित में एकाधिक विवर्तन के आदेश का उत्पादन होगाSLM, -1 और +1 के आदेश झंझरी, और भी कमजोर उच्च आदेशों के लिए इसी है कि SLM डिवाइस के लिए विशिष्ट आंतरिक तत्वों का विवर्तन से उत्पन्न होती हैं (जैसे। पिक्सेल किनारों पर SLM पिक्सल और अनियमितताओं के आंतरिक वायरिंग का प्रतिबिंब) । सभी लेकिन -1 और +1 आदेश बाहर फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए।
    6. एक स्थानिक मुखौटा (एस) L3 की फोकल स्थिति पर किरण पथ में एक एक्स में मुहिम शुरू की है, y चरण डालें, और ऑप्टिकल अक्ष ऐसी है कि केवल वांछित पहले के आदेश पारित कर रहे हैं के संबंध में अपनी स्थिति को अनुवाद करते हैं। सीधे स्थानिक फिल्टर करने के बाद, केवल दो गोल मुस्कराते हुए दिखाई जाएगी।
      नोट: स्थानिक मुखौटा एक सुई का उपयोग एल्यूमीनियम पन्नी में 6 छेद छिद्रण द्वारा निर्मित है। छेद काफी बड़े सभी लेजर तरंग दैर्ध्य के लिए पहले के आदेश मुस्कराते हुए पारित करने के लिए होना चाहिए। स्थानिक मुखौटा का एक विस्तृत विश्लेषण के संदर्भ 20 में दी गई है।
    7. संरेखण झंझरी के अगले अभिविन्यास (60 डिग्री, आदेश 2 चल रहा है) और फिर से प्रदर्शितयह सुनिश्चित करें कि केवल पहले के आदेश स्थानिक मुखौटा के माध्यम से जाने जाते हैं, अपनी स्थिति का समायोजन, यदि आवश्यक।
    8. अंतिम अभिविन्यास (120 डिग्री, चल आदेश 3) के लिए दोहराएँ।
    9. कैमरे पर फ्लोरोसेंट मनका परत की छवि की जाँच करें। के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया दो गोल मुस्कराते हुए ओवरलैपिंग नहीं कर रहे हैं तो iteratively उद्देश्य लेंस और कैमरे की स्थिति का समायोजन करके नमूना विमान का स्थान।
    10. दो मुस्कराते हुए जो ध्यान से बाहर की छवि लाएगा ओवरलैप करने के उद्देश्य स्थिति को समायोजित करें। कैमरा का स्थान बदलें मामले में छवि को ध्यान और ठीक धुन में वापस लाने के लिए उद्देश्य दो हलकों अभी भी दिखाई दे रहे हैं। इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक दो मुस्कराते हुए ओवरलैप और एक परिपत्र क्षेत्र के ध्यान में है।
    11. एक बार नमूना विमान की स्थिति को निर्धारित किया गया है, तय उद्देश्य की स्थिति में रहते हैं।
    12. TIRF रोशनी एक 488 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए उदाहरण के लिए फ्लोरोसेंट डाई का एक समाधान है, इस बात की पुष्टि करने के लिए, छवि, 10 के एक समाधान का उपयोग81, एम rhodamine 6G।
      1. ध्यान में डाई नमूना ले आओ। दो मुस्कराते हुए सही TIRF कोण पर घटना कर रहे हैं तो एकल अणुओं उच्च पृष्ठभूमि के बिना दिखाई जाएगी, और परिपत्र एपर्चर के किनारों ध्यान में होगा। गठबंधन और misaligned TIRF मुस्कराते हुए उदाहरण के लिए चित्रा 2 बी डी देखें।
      2. बदले में विंडोड gratings के प्रत्येक रुख प्रदर्शित करें और सुनिश्चित करें कि सभी तीन झुकाव TIRF रोशनी प्रदान करते हैं और दो मुस्कराते हुए नमूना विमान में ओवरलैप है। मुस्कराते हुए की स्थिति को ठीक समायोजन dichroic दर्पण DM3 का समायोजन करके बनाया जा सकता है।
        नोट: हालांकि अलग तरंग दैर्ध्य रंगीन विपथन अक्षीय के कारण थोड़ा अलग पदों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण नहीं है और लागू करने से ठीक किया जा सकता है एक दूसरे तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजना से पहले नमूना स्थिति के लिए लगातार जेड ऑफसेट।

    4. सिस्टम तुल्यकालन और कैलिब्रेशन

    1. जगह मनका monolayer रोंउद्देश्य पर पर्याप्त और ध्यान में लाने के लिए।
    2. अपने नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बदले में 3 चरण में बदलाव छवियों के प्रत्येक प्रदर्शित करने के लिए, पहले पैटर्न अभिविन्यास (0 डिग्री) के लिए SLM कार्यक्रम।
      1. SLM नियंत्रण सॉफ्टवेयर का प्रयोग, उदाहरण के प्रदर्शनों की सूची के आदेश 4 रनिंग के लिए स्विच।
      2. एक सकारात्मक और वैश्विक जोखिम की अवधि के दौरान एक नकारात्मक टीटीएल ट्रिगर संकेत: दो संकेतों उत्पादन करने के लिए (उदाहरण के HCImage के लिए) अपने अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कैमरा विन्यस्त करें। कैमरा सॉफ्टवेयर, "उन्नत कैमरा गुण" के तहत, सेट आउटपुट उत्प्रेरक तरह 1 और 2 "जोखिम", और आउटपुट उत्प्रेरक Polarity 1 और 2 "सकारात्मक" और "नकारात्मक" क्रमशः करने के लिए।
      3. "ट्रिगर" और "समाप्त" क्रमश: SLM के निवेशों, समाक्षीय केबल का उपयोग करने के लिए आउटपुट 1 और 2 कैमरे के कनेक्ट करें। SLM अब कैमरे के लिए सिंक्रनाइज़ है।
    3. 3 छवियों की एक श्रृंखला मोल।
      1. "अनुक्रम" फलक में, चयन और# 34; हार्ड डिस्क रिकॉर्ड "प्रकार स्कैन के रूप में, और 3 करने के लिए फ्रेम गिनती निर्धारित किया है।
      2. 3 फ्रेम प्राप्त करने के लिए "शुरू" पर क्लिक करें। SLM पैटर्न प्रत्येक जोखिम पर बदल जाएगा। छवि में फ्लोरोसेंट मोती 3 छवियों में से प्रत्येक के बीच पर और बंद पलक दिखाई देगा। पलक की राशि sinusoidal रोशनी पैटर्न के मॉडुलन विपरीत के बाहर एक पढ़ा है।
    4. LCVR आदेश दिगंशीय ध्रुवीकरण और दिए गए पैटर्न उन्मुखीकरण के लिए इसलिए उच्चतम मॉडुलन विपरीत प्राप्त करने के लिए कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ उत्तेजना लेजर का ध्रुवीकरण घुमाएँ।
      1. LCVR अंशांकन सॉफ्टवेयर लोड।
      2. न्यूनतम और अधिकतम वोल्टेज के लिए क्रमश: 0 और 8 दर्ज करें।
      3. "स्वीप LCVR वोल्ट" ध्रुवीकरण को बारी बारी से करने के लिए क्लिक करें।
        नोट: LCVR retardance तापमान के एक समारोह है और यहां तक ​​कि तापमान नियंत्रण के साथ दिन-प्रतिदिन के बहाव कर सकते हैं। इस चरण में, इष्टतम दिगंशीय ध्रुवीकरण sweepi द्वारा अनुभव से पाया जाता हैएनजी अपने न्यूनतम और अधिकतम वोल्टेज जो नमूना पर ध्रुवीकरण घटना घूर्णन का प्रभाव पड़ता है के बीच लागू वोल्टेज। मॉडुलन विपरीत प्रत्येक वोल्टेज 25 और वोल्टेज को प्राप्त होता है कि शिखर विपरीत निम्न चरणों में प्रयोग किया जाता है के लिए गणना की है।
      4. पूरा करने के लिए अंशांकन प्रक्रिया के लिए प्रतीक्षा करें, और मापा वोल्टेज नीचे ध्यान दें।
    5. शेष दो पैटर्न झुकाव (60 डिग्री और 120 डिग्री) और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य से प्रत्येक के लिए इस अंशांकन प्रक्रिया को दोहराएं।
    6. LCVR, लेजर, उत्सर्जन फिल्टर पहिया और पीजो Z चरण 26 के साथ कैमरा जोखिम सिंक्रनाइज़ करें। इसे पूरा करने के सिस्टम के लिए मास्टर घड़ी स्रोत के रूप में एक उच्च गति डाटा अधिग्रहण (DAQ) बोर्ड का उपयोग करें, और SLM के एलईडी लेज़रों मिलाना उत्पादन संकेत सक्षम उपयोग करें (देखें चित्र 3 बी)।
      नोट: विशिष्ट कार्यान्वयन उपयोग घटकों लेकिन डिजिटल त्रिकोणीय के लिए एक उच्च गति DAQ बोर्ड के उपयोग पर निर्भर हैgger तुल्यकालन और LCVR एक एनालॉग वोल्टेज, सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित का उपयोग कर के नियंत्रण की सिफारिश की है। नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर अनुरोध पर उपलब्ध है।
    7. अक्षीय रंगीन विपथन के कारण, प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए, यह भी एक जेड ऑफसेट नमूना चरण के लिए लागू होते हैं।
      1. पहले तरंगदैर्ध्य (जैसे। 488 एनएम) तो दूसरी करने के लिए स्विचन (जैसे। 640 एनएम) पर एक बहुरंगा मनका monolayer नमूना पर ध्यान केंद्रित करके प्रयोगात्मक ऑफसेट निर्धारित करते हैं। मोती अब ध्यान से बाहर हो जाएगा।
      2. मोती refocus और Z स्थिति में परिवर्तन है कि जरूरत थी उपाय। इस ऑफसेट तो पीजो जेड चरण के लिए हर बार उत्तेजना तरंगदैर्ध्य परिवर्तित हो जाती है लागू किया जा सकता है।
    8. SLM नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, 9 बाइनरी झंझरी TIRF-सिम के लिए आवश्यक छवियों की पूरी श्रृंखला के लिए SLM चल क्रम स्विच। यह उदाहरण प्रदर्शनों की सूची में आदेश 0 चल रहा है।
    9. कैमरा नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, मनका नमूना के 9 छवियों को प्राप्त। कैमरा सॉफ्टवेयर के "अनुक्रम" फलक में, स्कैन के रूप में "हार्ड डिस्क रिकॉर्ड" का चयन करें, और 9 के लिए फ्रेम गिनती बदल जाते हैं।
    10. छवियों को प्राप्त करने के लिए "शुरू" पर क्लिक करें।
    11. चयन "झगड़ा" "सहेजें बफर छवियाँ" विंडो में छवि प्रकार के रूप में, और ठीक क्लिक करके झगड़ा फ़ाइलों के रूप में प्राप्त कर लिया छवियों को बचाओ।
  • वाणिज्यिक या कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मानक TIRF खत्म संकल्प में सुधार को मान्य करने के लिए कच्चे झगड़ा छवियों से एक सुपर संकल्प छवि पुनर्निर्माण किया।
    नोट: हमारी माइक्रोस्कोप के लिए हम कस्टम पुनर्निर्माण कोड दोनों घर में और डॉ लिन शाओ 27 द्वारा विकसित का उपयोग करें।
  • Representative Results

    बहुरंगा 100nm व्यास फ्लोरोसेंट मोती TIRF-सिम के लिए मानक TIRF तुलना और पार्श्व संकल्प में प्राप्य सुधार (- बी चित्रा -4 ए) यों तो imaged थे। सुपर संकल्प छवियों में कच्चे फ्रेम के पुनर्निर्माण के रूप में साहित्य 27,28 में उल्लिखित मानक एल्गोरिदम का उपयोग किया गया था। यह देखा जा सकता है कि TIRF-सिम स्पष्ट रूप से काफी अधिक पार्श्व संकल्प किया है TIRF की तुलना में। एक माइक्रोस्कोप की बात फैल समारोह (पीएसएफ) खैर, पीएसएफ एक भी उप विवर्तन आकार फ्लोरोसेंट मनका की छवि से approximated है इसलिए और संकल्प प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए व्यक्तिगत मोतियों को ढाले 2 डी गाऊसी कार्यों द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप पूरी चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) का मतलब मूल्य के आधार पर की अनुमानित संकल्प 89 एनएम और 488 और 640 एनएम TIRF-सिम क्रमशः (चित्रा 4C) के लिए 116 एनएम है। यह एक दो गुना impro से मेल खाती हैसैद्धांतिक विवर्तन सीमित मामले की तुलना में दोनों तरंग दैर्ध्य के लिए पार्श्व संकल्प में vement। Fluorescently लेबल amyloid तंतु भी दोगुनी संकल्प (चित्रा 4D) के प्रदर्शन के लिए एक उत्कृष्ट परीक्षण नमूना है। Amyloid तंतु इन विट्रो में β-amyloid 10% rhodamine व्युत्पन्न रंगों (488 एनएम उत्तेजना) 1 सप्ताह के लिए और बाद में TIRF-सिम के साथ इमेजिंग के साथ लेबल incubating द्वारा गठित किया गया। अधिक जानकारी के लिए संदर्भित 12 देखें।

    ऐसे emGFP के रूप में उच्च विपरीत के साथ subcellular संरचनाओं सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 5 ब, जी) या LifeAct-GFP (चित्रा 5 डी) TIRF-सिम इमेजिंग के लिए आदर्श होते हैं और उच्च विपरीत सुपर संकल्प छवियों उपज लेबल। सेटअप इस प्रोटोकॉल में विस्तृत का उपयोग कर TIRF-सिम इमेजिंग बेसल सेल कोर्टेक्स के आसपास के क्षेत्र में स्थित सूक्ष्मनलिकाएं की एक उप-जनसंख्या का अवलोकन सक्षम बनाता है, और microtubule polymerization और depolymerization कर सकते हैं खई समय के साथ देखा (एनिमेटेड चित्रा 1)। नहीं सभी के नमूने, विशेष रूप से, कम विपरीत नमूनों में असतत संरचनाओं के बिना TIRF-सिम के साथ इमेजिंग के लिए उत्तरदायी हैं। साइटोसोलिक GFP व्यक्त कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली के किनारों (चित्रा 5F, एच और एनिमेटेड चित्रा 2) पर एक तरफ से उच्च संकल्प जानकारी की कमी है और जिसके परिणामस्वरूप के रूप में पुनर्निर्माण कलाकृतियों के साथ मढ़ा अनिवार्य TIRF चित्र हैं इसलिए TIRF-सिम इमेजिंग के लिए उप इष्टतम कर रहे हैं। इस तरह के नमूने में, इसके विपरीत में वृद्धि अक्सर पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के deconvolution कदम के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

    उच्च मॉडुलन विपरीत सफल सिम इमेजिंग के लिए आवश्यक है। फूरियर खंगाला छवि को बदलने की सिम ऑप्टिकल हस्तांतरण समारोह (OTF) (चित्रा 6A, इनसेट) के दृश्य की अनुमति देता है। दिगंशीय ध्रुवीय सुनिश्चित करने के द्वारा प्रत्येक उन्मुखीकरण के लिए मॉडुलन विपरीत अधिकतम बिनाएक ध्रुवीकरण रोटेटर साथ ization, नमूना सिम passbands में एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात करने के लिए अग्रणी में उच्च संकल्प जानकारी की बहुत कम मॉडुलन है। जो मानक वीनर फिल्टर दृष्टिकोण का उपयोग पुनर्निर्माण एल्गोरिदम बस सिम passbands में शोर बढ़ाना और एक छवि है जो अनिवार्य रूप से एक मानक TIRF छवि हेक्सागोनल (या "छत्ते") कलाकृतियों (चित्रा 6A, सही पैनल) बज से मढ़ा है निकलेगा। एक संभावित वृद्धि चलने 29,30 या अंधे पुनर्निर्माण एल्गोरिदम 31,32 के उपयोग के नमूने के प्रकार के आधार पर इन कलाकृतियों को कम करने के लिए हो सकता है। हम ImageJ प्लगइन SIMcheck पहले और पुनर्निर्माण के बाद 33 सिम डेटा की गुणवत्ता की जांच करने के लिए उपयोग की सलाह देते हैं।

    आकृति 1
    चित्रा 1:। बहुरंगा TIRF-सिम सेटअप के लेआउट TIRF-सिम Microscope तीन मुख्य भागों, बीम उत्पादन इकाई, पैटर्न प्रक्षेपण इकाई, और पता लगाने इकाई के होते हैं। बीम उत्पादन इकाई में, तीन अलग अलग लेज़रों dichroic दर्पण (DM1 और DM2) के माध्यम से एक ही किरण पथ पर गठबंधन और ध्रुवीकरण नियंत्रण के लिए चार ऑप्टिकल तत्वों के माध्यम से निर्देशित कर रहे हैं। सबसे पहले, एक polarizer (पी) लेजर बीम से प्रत्येक के रेखीय ध्रुवीकरण राज्य की शुद्धता सुनिश्चित करता है। निम्नलिखित तीन ऑप्टिकल तत्वों पाठ में विस्तार से वर्णित के रूप में एक तेजी से, स्वचालित ढंग से ध्रुवीकरण बारी बारी से करने की जरूरत है। बाद में, दो लेंस (एल 1 और एल 2) एक दूरबीन विन्यास में स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (SLM) के सक्रिय सतह से मेल करने के लिए बीम का विस्तार और SLM का अनुमान बाइनरी झंझरी पैटर्न से तीन beamlets में विवर्तित कर रहे हैं (उदाहरण टाइल्स 1- में दिखाया जाता है 9)। SLM पैटर्न के लिए रोशनी प्रकाश रिश्तेदार के ध्रुवीकरण राज्य एक तीर के रूप में दिखाया गया है। एक दूसरा टेलीस्कोप (L3 और L4) पैटर्न de-बड़ी और वें प्रदान करता हैSLM पैटर्न के ई फूरियर विमान। इस विमान में एक स्थानिक मुखौटा (एस) SLM की pixelated संरचना और उसके आंतरिक तारों से केंद्रीय घटक और अन्य अवांछित विवर्तन घटकों को फिल्टर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इससे पहले शेष दो मुस्कराते हुए कंडेनसर लेंस (L5) के माध्यम से उद्देश्य (ओ) के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, दो dichroic दर्पण (DM3 और DM4) सेटअप में शामिल किए गए हैं। DM4 एक पारंपरिक dichroic उत्सर्जन प्रकाश से अलग रोशनी करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में दर्पण के रूप में कार्य करता है। हालांकि, इस दर्पण अनिवार्यत: रोशनी प्रकाश जो DM3, DM4 के रूप में आदर्श रूप में एक ही बैच में से एक dichroic दर्पण के लिए मुआवजा दिया जा सकता का ध्रुवीकरण राज्य में अण्डाकार लाती है। तेल विसर्जन TIRF उद्देश्य सीधे coverslip कि पूरी तरह से परिलक्षित होते हैं पर दो काउंटर प्रचार लहरों शुरू करने और coverslip में एक संरचित क्षणभंगुर क्षेत्र को जन्म देने के लिए एक बड़ा पर्याप्त एनए है। नमूना एक xyz अनुवाद मंच पर मुहिम शुरू की है। डिटेक्शन perf हैट्रांसमिशन में एक ही उद्देश्य और DM4 के माध्यम से ormed, प्लस bandpass उत्सर्जन फिल्टर द्वारा एक अतिरिक्त छानने, एक कंप्यूटर नियंत्रित फिल्टर पहिया (EFW) में मुहिम शुरू की। अंत में, छवि आंतरिक माइक्रोस्कोप ट्यूब लेंस (L6) द्वारा एक sCMOS कैमरा पर पेश किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2:। ओवरलैपिंग कड़ियां के संरेखण (ए) एक SLM झंझरी पैटर्न एक परिपत्र एपर्चर के साथ विंडोड संरेखण के लिए उपयोगी है। दो गैर अतिव्यापी मुस्कराते हुए कैमरे (बाएं) पर दिखाई दे रहे हैं, तो नमूना विमान की स्थिति iteratively उद्देश्य लेंस और कैमरे के अक्षीय पदों का समायोजन एक परिपत्र रोशनी स्थान (दाएं) देने के द्वारा repositioned किया जाना चाहिए। मुस्कराते हुए orde में ओवरलैप चाहिएआर sinusoidal उत्तेजना पैटर्न TIRF-सिम के लिए आवश्यक का उत्पादन। मुस्कराते हुए पूरी तरह से ओवरलैप नहीं है तो यह देखने के क्षेत्र जिस पर हस्तक्षेप पैटर्न का गठन किया है कम कर देता है। (बी और सी) मुस्कराते हुए की घटनाओं की सटीक कोण TIRF-सिम के लिए महत्वपूर्ण है। यदि कोण गलत है, मुस्कराते हुए एक TIRF के लिए आवश्यक कोण पर नहीं होगा और यह आसानी से दिखाई दे रहा है एक फ्लोरोसेंट डाई समाधान जब इमेजिंग। एक किरण महत्वपूर्ण कोण जो परिपत्र मौके पैदावार की तुलना में अधिक से अधिक घटनाओं का एक कोण है, और दूसरे को नहीं है जो (बी) में छवि के बाईं तरफ के उज्ज्वल लकीर की ओर जाता है करता है। (डी) दर्पण DM3 के कोण का समायोजन सुनिश्चित करता है दोनों मुस्कराते हुए उसी कोण पर घटना है, और इस उद्देश्य को defocusing द्वारा मान्य किया जा सकता है: अगर सही ढंग से गठबंधन, एक फ्लोरोसेंट रंजक नमूने के एक Z ढेर के xz प्रक्षेपण दिखाना चाहिए दो संतुलित रूप से पारस्परिक पर नगण्य पृष्ठभूमि के साथ मुस्कराते हुएध्यान देते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3:। अलग प्रणाली घटकों के तुल्यकालन निर्भरता (ए) तेजी से सिम अधिग्रहण के लिए, एक हार्डवेयर आधारित समाधान का उपयोग कर प्रणाली के घटकों के तुल्यकालन आवश्यक है। (बी) के एक डाटा अधिग्रहण बोर्ड (DAQ) एक मास्टर ट्रिगर के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। DAQ बोर्ड से एक टीटीएल संकेत sCMOS बाहरी इनपुट के लिए भेजा और कैमरा जोखिम को गति प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कैमरा वैश्विक जोखिम उत्पादन तो एक झंझरी पैटर्न प्रदर्शित करने के लिए SLM चलाता है, और SLM उत्पादन डिजिटल लेजर उत्तेजना मिलाना कि इस तरह के लेजर ही आ रही है जब SLM पिक्सल "पर" राज्य में हैं प्रयोग किया जाता है सक्षम नेतृत्व किया। बाद जोखिम comple हैते, कैमरा वैश्विक जोखिम उत्पादन अगले झंझरी चरण या कोण करने पर SLM पैटर्न अग्रिम करने के लिए प्रयोग किया जाता है। DAQ बोर्ड भी LCVR नियंत्रक करने के लिए एक एनालॉग वोल्टेज outputs रोशनी बीम के रेखीय ध्रुवीकरण स्थिति को नियंत्रित करने के लिए। इस वोल्टेज प्रत्येक पैटर्न कोण के लिए 3 चरण छवियों के अधिग्रहण के बाद बंद कर दिया है। एक एकल तरंगदैर्ध्य के लिए 9 छवियों के अधिग्रहण के बाद, DAQ बोर्ड उत्सर्जन फिल्टर पहिया नियंत्रक करने के लिए एक संकेत outputs, और अगले तरंग दैर्ध्य के लिए स्विच। DAQ बोर्ड भी एक z ऑफसेट Z चरण पीजो नियंत्रक करने के लिए एक एनालॉग वोल्टेज outputting द्वारा नमूना है। लागू होता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: 100 एनएम बहुरंगा मोती और fluorescently एल के नमूने परीक्षण के TIRF-सिम इमेजिंगabelled amyloid तंतु। (ए और बी) के मानक TIRF की तुलना 488 एनएम और 640 एनएम उत्तेजना के लिए TIRF-सिम पुनर्निर्माण की तुलना में। (सी) गाऊसी की पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) के हिस्टोग्राम की उम्मीद संकल्प सुधार दिखा TIRF-सिम मोती के लिए फिट बैठता है। (डी) बनाम β-amyloid तंतु 10% rhodamine व्युत्पन्न डाई (488 एनएम उत्तेजना) के साथ लेबल की TIRF-सिम TIRF। स्केल सलाखों = 1 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5:। लाइव सेल TIRF-सिम इमेजिंग पारंपरिक TIRF के TIRF-सिम तुलना और एक HEK293 सेल में (ए, बी) सूक्ष्मनलिकाएं (emGFP ट्यूबिलिन) की छवियों, (सी, डी (ई, एफ) एक HEK293 सेल में साइटोसोलिक GFP। बी और एफ में छवियां फिल्मों से एक बार अंक हैं। बॉक्सिंग क्षेत्रों (जी, एच) में बढ़ाया दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों = 3 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6:। खंगाला मनका छवियाँ पर ध्रुवीकरण रोटेटर का प्रभाव (ए) इस तरह के एक LCVR के रूप में एक ध्रुवीकरण रोटेटर के उपयोग के बिना सिम passbands में संकेत करने वाली शोर अनुपात जो खंगाला सिम में विशेषता हेक्सागोनल कलाकृतियों में परिणाम कम है छवियों (दाएं), (बी) 2 डी-सिम में, संरचित रोशनी पैटर्न फूरियर में सीधे दिखाई दे रहे हैंTIRF-सिम में कच्चे छवियों (बाएं, उत्तेजना स्थानिक आवृत्ति प्रकाश डाला) वे उत्सर्जन OTF समर्थन के दायरे में गिरावट के रूप में के बदलने, तथापि, वे OTF बाहर से समर्थन कर रहे हैं और इसलिए दिखाई नहीं (दाएं)। इस मामले में, पैटर्न मॉडुलन विपरीत के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लिखित, एक विरल मनका monolayer का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 7
    चित्रा 7:। स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक आधार पैटर्न पीढ़ी बहुकेंद्रक सिम के रूप में इस तरह के अन्य इमेजिंग तौर तरीकों के कार्यान्वयन की अनुमति देता है (ए) MSIM में, वर्ग का एक जाली SLM (इनसेट) पर pointsdisplayed छवि विमान पर विवर्तन सीमित foci के एक जाली अर्जित करता है। कम एकाग्रता rhodamine 6G की एक पतली परत visua के लिए imaged है foci Lize। पैटर्न नमूना (बी) के पार अनुवाद किया है और अधिग्रहण कच्चे छवि जेड ढेर कम कर बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश (सी) के साथ एक छवि उत्पन्न करने के लिए खंगाला है। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    फिल्म 1 फ़्रेम
    एनिमेटेड चित्रा 1:। एक HEK293 सेल में EmGFP ट्यूबिलिन के समय श्रृंखला फिल्म रैपिड polymerization और emGFP की depolymerization लेबल सूक्ष्मनलिकाएं TIRF-सिम का उपयोग कर देखा जा सकता है। छवियाँ 0.5 सेकंड के अंतराल पर स्थान दिया गया कच्चे फ्रेम प्रति 50 मिसे जोखिम समय (सिम फ्रेम प्रति 450 मिसे) का उपयोग कर प्राप्त कर लिया। इस्तेमाल प्रदर्शन के समय, fluorophore की चमक द्वारा सीमित था कैमरा या SLM की गति से नहीं। 3988movie1.mov "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    फिल्म 2 फ़्रेम
    एनिमेटेड चित्रा 2:। एक HEK293 सेल में साइटोसोलिक GFP के समय श्रृंखला फिल्म इस जैसे कम विपरीत के साथ नमूने TIRF-सिम इमेजिंग के लिए आदर्श नमूने नहीं हैं। प्रतिगामी झिल्ली प्रवाह TIRF छवियों में देखा जा सकता है लेकिन TIRF-सिम सेल किनारों पर से अलग कोई अतिरिक्त जानकारी प्रदान नहीं करता है। TIRF-सिम छवियों कच्चे फ्रेम (फ्रेम प्रति सिम 450 मिसे) 5 सेकंड के अंतराल पर स्थान दिया गया है प्रति 50 मिसे जोखिम समय का उपयोग कर हासिल किया गया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    पूरक संहिता फ़ाइल: उदाहरण SLM प्रदर्शनों की सूची फ़ाइल (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3)।डी / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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    पूरक संहिता फ़ाइल: उदाहरण झंझरी पीढ़ी कोड (2 का 2) (circular_mask.m)।= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> यहां इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

    पूरक संहिता फ़ाइल:। मॉडुलन विपरीत (calculate_contrast.m) की गणना करने के लिए उदाहरण कोड इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

    Discussion

    इस तरह इस प्रोटोकॉल में विस्तृत सेटअप के रूप में कस्टम निर्मित TIRF-सिम सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी की तुलना में उच्च गति पर बहुरंगा सुपर संकल्प इमेजिंग में सक्षम हैं। एक सुपर संकल्प तकनीक के रूप में सिम के निहित लाभ यह है कि अस्थायी समाधान इस तरह के एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM) या ऐसे प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी के रूप में बिंदु स्कैनिंग तरीकों (के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में, की fluorophore photophysics द्वारा सीमित नहीं है STED)। इन अन्य तकनीकों के विपरीत, सिम photoswitchable या depletable fluorophores की आवश्यकता नहीं है इसलिए बहुरंगा इमेजिंग सीधा है। सिम और मल्टीफोकल सिम सेक्शनिंग जैसे ऑप्टिकल के रूप में गैर-सिम TIRF प्रणाली, आमतौर पर के रूप में 2 सुधार के कारक यहां बताया करने के लिए विरोध व्यवहार में 1.7 गुना या उससे कम का संकल्प सुधार प्राप्त कर सकते हैं, और वाणिज्यिक प्रणालियों भी अक्सर धीमी है और इस प्रणाली की तुलना में कम कर रहे हैं लचीला इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया।

    "> इस तकनीक को लागू करने में दो मुख्य कठिनाइयों सबसे पहले उद्देश्य के पीछे एपर्चर है, जो एक कठिन और समय लेने वाली ऑप्टिकल संरेखण प्रक्रिया की आवश्यकता के TIR क्षेत्र के भीतर छह सिम बीम की सटीक स्थिति के लिए आवश्यकता है। दूसरे, उच्च पैटर्न विपरीत निर्माण करने के लिए नमूना पर, ध्रुवीकरण रोटेशन जरूरी है। कम NA 2 डी-सिम सिस्टम के लिए, ध्रुवीकरण रोटेशन रेखीय ध्रुवीकरण उन्मुखीकरण के सावधान रहना पसंद से बचा जा सकता है, लेकिन इस TIRF-सिम 25 के लिए असंभव हो जाता है। उच्च गति बहुरंगा इमेजिंग के लिए, विद्युत ऑप्टिकल ध्रुवीकरण नियंत्रण आवश्यक है और इस जटिलता और सिस्टम की कीमत बढ़ जाती है।

    तकनीक की सीमाएं

    TIRF-सिम, पारंपरिक TIRF की तरह है, स्वाभाविक रूप से जैविक संरचनाओं और बेसल कोशिका झिल्ली कि क्षणभंगुर क्षेत्र के 150-200 एनएम प्रवेश गहराई से प्रकाशित किया जा सकता है पर स्थित प्रक्रियाओं का अवलोकन करने के लिए सीमित है। जबकिसिम अक्सर या तो STED या SMLM, पार्श्व संकल्प दोहरीकरण अभी भी कम से कम 4 गुना 5 से फोटॉनों की अपेक्षित संख्या में वृद्धि करता है पारंपरिक TIRF माइक्रोस्कोपी की तुलना में कोशिकाओं को कम photodamaging होने के रूप में उद्धृत किया गया है। कम जोखिम के समय के साथ उच्च फ्रेम दर पर इमेजिंग के लिए, इस फोटॉन वृद्धि वृद्धि हुई रोशनी तीव्रता का उपयोग जरूरी है। किसी भी fluorophore निश्चित या धीमी गति से चलती नमूने, उच्च चमक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या बढ़ाया photostability के साथ अगली पीढ़ी सिंथेटिक रंगों का सिम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लाइव सेल इमेजिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं।

    हालांकि इस कार्यान्वयन 20 हर्ट्ज से अधिक सिम फ्रेम दर पर एक ही रंग इमेजिंग में सक्षम है, प्रस्तुत प्रणाली में बहुरंगा इमेजिंग मोटर चालित उत्सर्जन फिल्टर पहिया की स्विचिंग समय से सीमित है। sCMOS कैमरा चिप के बड़े आकार के कारण, एक multiband उत्सर्जन फिल्टर और छवि बंटवारे प्रकाशिकी के उपयोग संभव हो सकता है और एक साथ मैं अनुमति होगीकोई गति की सजा पर कई तरंग दैर्ध्य के साथ maging। एक और संभावना विभिन्न उत्तेजना लेज़रों वैकल्पिक और उत्तेजना प्रकाश अस्वीकार करने के लिए एक multiband पायदान फिल्टर का उपयोग करने के लिए किया जाएगा। इस कार्यान्वयन में एक द्विआधारी ferroelectric SLM का उपयोग भी इष्टतम नहीं है। इस तरह के एक SLM के विवर्तन दक्षता बहुत कम है, इसलिए घटना के प्रकाश के सबसे शून्य के आदेश प्रतिबिंब है, जो स्थानिक मुखौटा द्वारा फ़िल्टर है में है। बहुत उच्च फ्रेम दर की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए, इमेजिंग गति इसलिए लेजर डायोड का उत्पादन शक्ति द्वारा सीमित है। SLM भी तरंग दैर्ध्य 550 एनएम तरंगदैर्ध्य डिजाइन जहां पिक्सल के रूप में आदर्श आधे लहर प्लेटों काम नहीं कर से दूर के लिए ध्रुवीकरण में कुछ अण्डाकार का परिचय। हालांकि यह एक अतिरिक्त LCVR का उपयोग करके के लिए मुआवजा दिया जा सकता है, आदर्श समाधान एक पैटर्न जनरेटर के रूप में एक डिजिटल माइक्रो दर्पण डिवाइस (डीएमडी) का उपयोग किया जा सकता है।

    संभावित संशोधनों

    सेटअप preseयहाँ nted लचीला और अधिक आसानी से वाणिज्यिक उपकरणों ऐसी 3 डी-सिम, तेजी से 2 डी-सिम, मल्टीफोकल सिम (MSIM) और गैर रेखीय सिम (NL-सिम) के रूप में तो अन्य इमेजिंग तौर तरीकों 21,34,35 लागू किया जा सकता से संशोधित है।

    2 डी-सिम अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सपाट इमेजिंग, तेजी से इस तरह परिधीय जालिका के रूप में संरचनाओं बढ़ने के लिए अनुकूल हो सकता है। परिधीय ईआर अपने फ्लैट संरचना के कारण से एक TIRF क्षणभंगुर क्षेत्र लेकिन का उपयोग कर प्रबुद्ध किया जा सकता कोशिका के भीतर गहरे निहित है नगण्य बाहर का ध्यान केंद्रित पृष्ठभूमि के साथ मानक 2 डी-सिम का उपयोग imaged किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बेहतर ऑप्टिकल सेक्शनिंग पुनर्निर्माण एल्गोरिदम के उपयोग को दबाने के लिए बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश 2 डी-सिम के उपयोग ऑप्टिकली मोटी नमूने, यद्यपि जहां अक्षीय संकल्प दोहरीकरण 21 की आवश्यकता नहीं है के लिए करता हूं।

    MSIM में, नमूना उत्तेजना foci 36 की एक विरल जाली द्वारा प्रकाशित किया जाता है। इस साधन बस स्थानिक नकाब हटाने के द्वारा लागू किया जा सकता है (एस.एम.) है और यह एक polarizer द्वारा की जगह ले। SLM अब एक आयाम न्यूनाधिक रूप में चल रही है। SLM पर प्रदर्शित बाइनरी सिम gratings स्पॉट छवि विमान में एक विवर्तन सीमित फोकस के आकार के बराबर होने के लिए चुना के आकार के साथ, स्थानों की एक 2 डी जाली द्वारा बदला जा सकता है। चित्रा 7A में, 4 x 4 पिक्सेल चौकों की एक जाली SLM (इनसेट) जो जब नमूना पर demagnified 150 x 150 एनएम के विवर्तन सीमित foci उत्पन्न करता है पर प्रदर्शित, 13.62 मीटर की शारीरिक SLM पिक्सेल आकार दिया जाता है। उत्तेजना foci तो SLM पर जाली पैटर्न स्थानांतरण द्वारा अनुवाद किया जा सकता है और इस क्रम में देखने के पूरे क्षेत्र को रोशन करने में कई बार दोहराया है। छवियों प्रत्येक अनुवाद पैटर्न पद के लिए अधिग्रहण कर रहे हैं और ढेर है का एक पहलू अप करने के लिए सुधार के प्रस्ताव के साथ एक खंगाला छवि उपज के बाद संसाधित समीकरण और कम से बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश बराबर widefield छवि की तुलना में30। इस साधन, मोटी, घने नमूने जिसके लिए मानक सिम ऐसे दाग लाल रक्त कोशिकाओं (चित्रा 7) के रूप में अनुपयुक्त है, उदाहरण के कम विपरीत संरचनाओं के लिए इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है, हालांकि अधिग्रहण के समय कच्चे तख्ते की बड़ी संख्या के कारण बढ़ रहा है देखने के क्षेत्र प्रति आवश्यक (इस मामले में एन = 168)।

    अंत में, सेटअप के रूप में ली एट अल द्वारा हाल ही में प्रस्तुत किया है, तो उच्च-NA रेखीय TIRF-सिम या नमूनों सक्रियण गैर रेखीय सिम (पीए नाथन सिम) सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।, एक ultrahigh 1.7 NA उद्देश्य या इसके अतिरिक्त के उपयोग के द्वारा एक 405 एनएम photoactivation लेजर और SLM झंझरी पैटर्न 35 से सावधान अनुकूलन की।

    भविष्य के अनुप्रयोगों

    सिम अभी भी एक तेजी से विकसित तकनीक है और जीवन विज्ञान में कई आवेदन भविष्य में सक्षम हो जाएगा। गति, संकल्प, और इसके विपरीत तकनीक के संवर्द्धन और मानक fluorophores मीटर का उपयोग करने की क्षमताEAN bioimaging के लिए, सिम ऐसे confocal और विस्तृत क्षेत्र प्लेटफॉर्म के रूप में पारंपरिक कई माइक्रोस्कोप प्रणाली, को बदलने के लिए सेट कर दिया जाता है। वाणिज्यिक सिम सिस्टम महत्वपूर्ण बात, वे संशोधित और क्षेत्र में नवीनतम अनुसंधान के घटनाक्रम को लागू करने के लिए विकसित किया जाना है अनम्य हैं पहले से ही बकाया तकनीकी विशिष्टताओं के साथ आज उपलब्ध हैं, तथापि, वे कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं की वित्तीय पहुँच से बाहर हैं, और। उन्होंने यह भी कमी है आवश्यक क्षमता, अक्सर बढ़त जीवन विज्ञान अनुसंधान काटने में एक महत्वपूर्ण टोंटी 'हाथ में प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा'। यहाँ वर्णित प्रणाली विशेष रूप से अच्छी तरह से पुनर्गठन bilayer प्रणालियों के इन विट्रो अध्ययन के लिए, कोशिका की सतह के पास गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, सामग्री और भौतिक विज्ञान, उदा में सतह के रसायन शास्त्र का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा। 2 डी सामग्री, और कई अन्य अनुप्रयोगों की।

    Disclosures

    Acknowledgements

    इस काम Leverhulme ट्रस्ट, इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था [ईपी / H018301 / 1, ईपी / G037221 / 1]; अल्जाइमर रिसर्च यूके [ARUK-EG2012A-1]; वेलकम ट्रस्ट [089703 / Z / 09 / Z] और चिकित्सा अनुसंधान परिषद [एमआर / K015850 / 1, एमआर / K02292X / 1]। हम क्रमशः डब्ल्यू चेन साइटोसोलिक-GFP कोशिकाओं LifeAct-GFP के अभिकर्मक और के लिए ई Avezov और एम लू का शुक्र है, और HEK293 संस्कृति की तैयारी के लिए। हम यह भी उपयोगी विचार विमर्श और सुझाव के लिए माइक्रोस्कोप के डिजाइन के साथ सहायता के लिए लालकृष्ण O'Holleran धन्यवाद, और एल शाओ और आर Heintzmann।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    488 nm laser Toptica iBeam SMART with digital modulation
    561 nm laser Coherent OBIS LS with digital modulation
    640 nm laser Cobolt MLD with digital modulation
    Long-pass dichroic mirrors  Thorlabs for combining excitation beams
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc From same batch as above, 25 x 25 mm
    1" square kinematic mount Edmund Optics 58-860
    Glan-Taylor calcite polarizers Thorlabs GT5-A For alignment of LCVR
    Glan-Taylor mount Thorlabs SM05PM5
    Achromatic half wave plate Thorlabs AHWP05M-600 400-800 nm
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M For HWP
    Liquid Crystal Variable Retarder Meadowlark Optics SWIFT Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
    LCVR controller Meadowlark Optics D3060HV Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
    Achromatic quarter wave plate Meadowlark Optics AQM-100-0545
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1P/M For QWP
    10 mm achromatic doublet Thorlabs AC080-010-A-ML For beam expander
    200 mm achromatic doublet Thorlabs AC254-200-A-ML For beam expander
    Cage XY Translators Thorlabs CXY1
    Ferroelectric spatial light modulator Forth Dimension Displays M0787-00249     SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
    SLM mounting frame Forth Dimension Displays M0787-10014 Fixed to custom built aluminium mount
    Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount Thorlabs GM200/M For SLM mounting
    Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform Thorlabs XYR1/M For SLM mounting
    Rail carrier Newport M-PRC-3 For SLM mounting
    Precision Optical Rail Newport PRL-6 For SLM mounting
    300 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 273 322  f = 300 mm, 31.5 mm diameter
    140 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 239 322 f = 140 mm, 31.5 mm diameter
    Precision XY Translation Mounts Thorlabs LM2XY
    Lens Mounting Adapters Thorlabs SM2AD32 For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
    Translation stages Comar 12XT65 Dovetail, side drive
    XY Translator with Differential Drives Thorlabs ST1XY-D/M for spatial filter
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M for spatial filter
    300 mm achromatic doublet Thorlabs AC508-300-A-ML Excitation tube lens
    Automated XY stage with Z-piezo top plate ASI PZ-2150-XYFT-PZ-IX71  with MS-2000 controller
    Inverted microscope frame Olympus IX-71
    Objective lens Olympus UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA
    High speed filter wheel Prior Scientific HF110A with Prior ProScan III controller
    Bandpass emission filters Semrock FF01-525/30, FF01-676/29
    sCMOS camera Hamamatsu ORCA Flash v4.0
    Stage top incubator OKO Lab H301-K-FRAME For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
    Stainless steel optical posts Thorlabs TR series for mounting optical components
    Post holders Thorlabs PH series for mounting optical components
    Kinematic mirror mounts Thorlabs KM100 for mounting 1" mirrors
    Shearing interferometer Thorlabs SI100
    100 nm fluorescent microspheres Life Technologies T-7279 Tetraspeck
    Rhodamine 6G Sigma Aldrich 83697-250MG
    8 well glass bottom dishes ibidi 80827 with #1.5 coverglass
    Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155409 with #1.5 coverglass
    0.01 mm microscope reticle slide EMS 68039-22
    CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific C10613

    References

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